Name: efficient and consistent generation of retinal pigment epithelium/choroid flatmounts from human eyes for histological analysis
Uploaded: 2022-10-28T15:00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis at JoVE.com

Vi takker National Eye Institute (NEI) histologikernen for brugen af Zeiss Axio Scan.Z1. Vi takker også donorerne, deres familier, Advancing Sight Network og Lions Eye Institute for deres generøsitet. Dette arbejde blev støttet af NEI IRP-midler (tilskudsnummer ZIA EY000533-04).

Kadavers menneskelige glober blev opnået fra Advanced Sight Network (Birmingham, AL). Arbejde udført på kadavervæv er undtaget af NIH Institutional Review Board fra den forskningsetiske komité.
1. Forsendelse af øjenglobe
<ol><li>Efter enukleation sendes friske øjenkugler i en beholder fyldt med iskold DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. BEMÆRK: Det er bedre at dissekere øjet inden for 24 timer efter enukleation. RPE-morfologien ændres ikke i dette tidsrum.</li>
</ol>2. Forberedelse af silikoneform
<ol><li>Skær de nederste 20 mm af et rundbundet rør med en diameter på 25 mm. Placer den i bunden af en firkantet vejebåd (81 mm x 81 mm x 25 mm).</li>
	<li>Bland de to komponenter i siliciumelastomersættet i forholdet 10: 1, og vær opmærksom på ikke at fange luft. Hæld blandingen i vejebåden, der indeholder det kugleformede stykke af det rundbundede rør.</li>
	<li>Hærd silikonen ved stuetemperatur natten over. Fjern vejebåden og det rundbundede rør fra den hærdede silikoneform.</li>
</ol>3. RPE dissektion
<ol><li>Rens sclera af det friske øje kloden af muskler og bindevæv. Fastgør øjet til silikoneformen ved hjælp af 27 G nåle gevind gennem sclera. Fyld formens hulrum med DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. BEMÆRK: Vær opmærksom på ikke at bryde øjenkammeret. Nålene bør kun passere gennem sclera.</li>
	<li>Brug en 1 ml sprøjte og en 21 G kanyle til at injicere ~400 μL 1.700 mOsm D-mannitol opløsning i glaslegemet. Indsæt nålen gennem pars plana for at undgå at punktere øjets forreste kammer. Lad øjet stå ved stuetemperatur i ~45 min.</li>
	<li>Skær det forreste kammer op på niveau med pars plana ved hjælp af en fin saks og tang. Fyld det bageste øjenkammer med DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. Under stereomikroskopet lokaliseres makulaen (den gule plet på nethinden).</li>
	<li>Hvis en kirurgisk glaslegemeskærer er tilgængelig, skal du fjerne glaslegemet og erstatte det med DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. Alternativt kan du prøve at løfte glaslegemet med tang og klippe det med en fin saks.</li>
	<li>Vær opmærksom på at bevare makulaområdet, skær øjet i kvadranter: nasal, tidsmæssig, overlegen og ringere. Fjern nålene, hvis de er i vejen.</li>
	<li>Overfør det butterflied bageste kammer i øjet til en 100 mm petriskål indeholdende DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. Før du fjerner nethinden, skal du markere kronbladet, der indeholder makulaen, ved at lave et lille snit (V-formet) i ciliarymargenen. Løft og skær alt det glasagtige, der ligger på nethinden.</li>
	<li>Løft forsigtigt nethinden fra flere sider med en buet spatel eller et par tang for at kontrollere, om nethinden har løsnet sig fra RPE og for at lade noget væske cirkulere mellem de to lag. BEMÆRK: Nethinden vil stadig være fastgjort i periferien (ciliære margener) og ved synsnerven.</li>
	<li>Skær nethinden fra ciliarymargenerne i alle kronblade, og sørg for ikke at ridse RPE. Placer vævet i 4% PFA og inkuber i ~1 time. Vask 3x med DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. Vævet overføres til en beholder fyldt med DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+ og opbevares ved 4 °C. BEMÆRK: På dette tidspunkt er nethinden kun fastgjort ved synsnerven. Dette er et pausepunkt i dette eksperiment.</li>
	<li>Overfør prøven til en 100 mm petriskål indeholdende DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. Stans det optiske nervehoved ud med en 1,5 mm biopsistans og saml nethinden. Opbevar nethinden i DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+ ved 4 °C. BEMÆRK: Før du stanser synsnervehovedet ud, skal du sørge for at skære synsnerven så meget som muligt på scleralsiden. Dette vil øge slagets præcision. Stansning af synsnerven, efter at flatmount er fastgjort i 4% PFA, reducerer skaden på RPE-cellerne placeret omkring synsnerven.</li>
	<li>Fjern sclera fra RPE / choroid ved forsigtigt at løfte RPE / choroidlaget fra periferien og skære de koroidale kar og bindevæv, der er mellem sclera og RPE med et par Vannas fjedersaks. Når RPE / choroid er helt adskilt fra sclera, skal du samle RPE / choroidlaget. Overfør vævet til en beholder fyldt med DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+ og opbevar det ved 4 °C. BEMÆRK: På nuværende tidspunkt kan eksperimentet sættes på pause.</li>
</ol>4. Farvning
<ol><li>Overfør RPE / choroid til en brønd på en 6-brønds plade. Bloker og permeabiliser prøven i DPBS 1x med Ca 2+ og Mg 2+ med 1% bovint serumalbumin (BSA), 0,5% Tween20 og 0,5% Triton X-100 i 1 time ved stuetemperatur.</li>
	<li>Inkuber prøven med phalloidin konjugeret med en 647 fluorofor ved en 1:250 fortynding i DPBS 1x med Ca 2+ og Mg 2+ med 1% BSA, 0,5% Tween20 og 0,5% Triton X-100 i 1 time ved stuetemperatur. Vask 3x i DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+.</li>
	<li>RPE/choroidprøven overføres til et glasglas på 50 mm x 75 mm, og flad den fladgøres. Skær hvert "kronblad" i to for at gøre prøven fladere. Vær opmærksom på makulaen. Tegn en kontur af flatmount med en hydrofob pen.</li>
	<li>For at slukke lipofuscinautofluorescensen tilsættes 500 μL autofluorescensquencheropløsning fortyndet til 1:20 i 70% ethanol og inkuberes ved stuetemperatur i 2 min.</li>
	<li>Vask grundigt (mindst 3x) i DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. Fjern DPBS, og tilføj monteringsmediet. Placer et dækglas på flatmount og forsegl med neglelak.</li>
	<li>Afbild flatmounten med et fluorescensmikroskop (helst ved hjælp af et 10x eller 20x objektiv).</li>
</ol>5. REShAPE-analyse
BEMÆRK: Da den REShAPE AI-baserede algoritme blev trænet på 10x og 20x billeder, anbefales det derfor stærkt at bruge et 10x eller 20x mål ved billeddannelse. Hvis ikke, skal billederne skaleres i overensstemmelse hermed.
<ol><li>Hvis billederne er taget med mere end én fluorescerende kanal, skal du isolere den kanal, der bruges til at hente cellekanterne. Eksporter billederne som 16-bit gråtone-TIF-filer. BEMÆRK: Billeder erhvervet med filtypen .czi behøver ikke eksporteres som TIF-filer, men kanalen, der indeholder cellekanterne, skal stadig isoleres.</li>
	<li>Installer softwaren på Windows x64 eller Linux (Centos 7) platforme. BEMÆRK: Softwaren og installationsvejledningen findes på https://github.com/nih-nei/REShAPE.</li>
	<li>Åbn softwaren (Figur 1).</li>
	<li>På fanen Mapper skal du vælge input- og outputmapperne. Vælg den mappe, der indeholder billederne, i inputmappen. Lad softwaren automatisk ændre stien til "input directory / Processed" i outputmappen. Alternativt kan du ændre outputmappen manuelt. BEMÆRK: Softwaren gentages gennem alle billederne i inputmappen.</li>
	<li>På fanen NN-segmenteringsindstillinger skal du vælge følgende indstillinger for billedsegmentering:<ol><li>Batchstørrelse: Skriv en værdi på 20 i tekstfeltet som et godt udgangspunkt, men sænk den, hvis systemet løber tør for grafikbehandlingsenheder (GPU'er). BEMÆRK: Det originale billede er opdelt i mindre fliser til behandling. Batchstørrelsen angiver, hvor mange fliser der kan behandles på én gang.</li>
		<li>Brug GPU?: Hvis systemet ikke har nok GPU-ressourcer, skal du markere afkrydsningsfeltet Nej.</li>
		<li>Intern skala: Brug rullemenuen til at ændre den interne skalering fra Ingen i tilfælde, hvor billederne ikke blev erhvervet med et 10x eller 20x mål. Du kan f.eks. nedskalere 40x billeder til halvdelen af størrelsen ved hjælp af knappen 1/2 . De tilgængelige reskaleringsmuligheder i rullemenuen er som følger: 5x, 2x, Ingen, 1/2, 1/5. BEMÆRK: Maskinlæringen blev trænet med 10x og 20x billeder. Det genkender muligvis ikke cellekanter fra billeder taget ved andre forstørrelser. I dette tilfælde vises binære billeder helt sorte.</li>
		<li>Arti Filter: Brug artefaktfilterfanen til at fjerne meget lyse partikler (snavs eller små dele af nethinden eller bindevævet omkring synsnerven), der kan være til stede i billedet og kan forstyrre segmentering af cellekanter. Der bruges som standard ikke noget filter. De kunstige filterindstillinger i rullemenuen er som følger: Almindelig, Stærk og Svag.</li>
	</ol></li>
	<li>Under fanen Indstillinger for flisebelagt billede skal du indsætte en værdi i tekstfeltet for at angive mængden af overlapning mellem billedfliserne ved at justere parameteren Pad-fliser efter . En overlapning på 100 pixels fungerer normalt godt.</li>
	<li>På fanen Indstillinger for outputgrafik skal du indstille indstillingerne for generering af varmekort:<ol><li>Rekonstruere flisebelagte billeder?: Hvis systemet ikke har tilstrækkelige ressourcer til analyse af store billeder, skal du markere afkrydsningsfeltet Nej for at tillade softwaren at fuldføre analysen ved at gemme individuelle fliser uden at rekonstruere hele billedet.</li>
		<li>Opret farvebilleder: For at generere varmekort skal du vælge Alle i rullemenuen.</li>
		<li>For Farvelægning skal du vælge en af de forskellige farvepaletter, der er tilgængelige i rullemenuen: Termisk, Grøn, Mpl-magma, Fase, Fire, Jet, Cyan Hot.</li>
		<li>For billedformat skal du gemme billederne som TIF eller PNG ved at vælge en af indstillingerne på fanen.</li>
		<li>Med hensyn til funktionen Brug manuelle grænser? skal du markere afkrydsningsfeltet Nej for at lade softwaren bruge de minimums- og maksimumsværdier, der er registreret i hvert billede. Marker afkrydsningsfeltet Ja for manuelt at justere værdiområdet for hvert formmetrisk varmekort, og klik på knappen Indstil grænser for at vælge intervaller for de enkelte parametre ved at indsætte værdier i tekstfelterne. Når du har ændret værdierne af interesse, skal du klikke på Gem. Klik på Indlæs standardindstillinger for at nulstille alle grænserne. BEMÆRK: Brug manuelle grænser, hvis varmekort fra flere billeder skal sammenlignes, f.eks. når du sammenligner virkningerne af forskellige forbindelser på celleformen. På denne måde bruges det samme værdiområde. Det sæt værdier, der skal indtastes manuelt, varierer afhængigt af prøvetypen. Det anbefales at køre et par iterationer for at vælge det optimale interval.</li>
	</ol></li>
	<li>Under fanen Cellestørrelsesbegrænsninger for analyse skal du vælge en cellestørrelsestærskel for analysen:<ol><li>I Lavere cellestørrelse skal du indsætte størrelsen på den mindste celle, der skal medtages i analysen, i tekstfeltet.</li>
		<li>I Øverste cellestørrelse skal du i tekstfeltet indsætte størrelsen på den største celle, der skal medtages i analysen. BEMÆRK: Enheden for cellestørrelse ændres fra pixels til mikrometer i anden grad afhængigt af den indstilling, der er valgt under fanen Automatisk enhedskonvertering .</li>
	</ol></li>
	<li>På fanen Automatisk enhedskonvertering skal du vælge den foretrukne enhed til analysen:<ol><li>I Konverter pixel til reelle enheder? skal du markere afkrydsningsfeltet Nej for at køre analysen i pixelenheder. Markér afkrydsningsfeltet Ja for at køre analysen i mikrometer.</li>
		<li>I Længde på skalalinje (pixel) skal du angive pixelværdien i tekstfeltet.</li>
		<li>I Længde af skalabjælke (mikron) skal du i tekstfeltet indtaste den tilsvarende afstand i mikrometer.</li>
	</ol></li>
	<li>For at starte analysen skal du trykke på Go For It. BEMÆRK: Softwaren kan også måle cellelevedygtighed, når cellerne farves med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) og propidiumiodid (fanen CZI-indstillinger ), men dette gælder ikke for RPE-flatmounts.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig01.jpg"> Figur 1: REShAPE grafisk brugergrænseflade. GUI'en har forskellige faner til valg af arbejdsmapper (fanen Mapper ), ændring af segmenteringsindstillingerne (fanerne NN-segmenteringsindstillinger og flisebelagte billedindstillinger ), angivelse af parametrene til analyse (fanerne Cellestørrelsesbegrænsninger for analyse og automatiseret enhedskonvertering ) og til generering af varmekort (fanen Indstillinger for outputgrafik ). Forkortelse: GUI = grafisk brugergrænseflade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<ol>
	<li>Endo, E. G., Yao, X. Y., Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pigment+adherence+as+a+measure+of+retinal+adhesion:+Dependence+on+temperature.">Pigment adherence as a measure of retinal adhesion: Dependence on temperature.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (9), 1390-1396 (1988).</li><li>Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+detachment+from+hyperosmotic+intravitreal+injection.">Retinal detachment from hyperosmotic intravitreal injection.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 18 (12), 1237-1244 (1979).</li><li>Marmor, M. F., Martin, L. J., Tharpe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotically+induced+retinal+detachment+in+the+rabbit+and+primate.+Electron+microscopy+of+the+pigment+epithelium.">Osmotically induced retinal detachment in the rabbit and primate. Electron microscopy of the pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 19 (9), 1016-1029 (1980).</li><li>Ban, Y., Rizzolo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+model+of+development+reveals+multiple+properties+of+RPE+tight+junctions.">A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions.</a> Molecular Vision. 3, 18 (1997).</li><li>Ortolan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-resolution+map+of+human+retinal+pigment+epithelium+helps+discover+subpopulations+with+differential+disease+sensitivity.">Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (19), 2117553119 (2022).</li><li>Schaub, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+learning+predicts+function+of+live+retinal+pigment+epithelium+from+quantitative+microscopy.">Deep learning predicts function of live retinal pigment epithelium from quantitative microscopy.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 1010-1023 (2020).</li><li>Beatty, S., Koh, H. -. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration.">The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).</li><li>Liu, Z., Kocaoglu, O. P., Miller, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+retinal+pigment+epithelial+cells+in+the+living+human+retina.">3D imaging of retinal pigment epithelial cells in the living human retina.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (9), 533-543 (2016).</li><li>Bhatia, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RPE+morphometry+in+human+eyes.">Analysis of RPE morphometry in human eyes.</a> Molecular Vision. 22, 898-916 (2016).</li><li>vonder Emde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+cell+shape+descriptors+for+the+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration:+A+comparison+to+unaffected+eyes.">Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes.</a> Translational Vision Science &amp; Technology. 11 (8), 19 (2022).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Den konsekvente og effektive adskillelse af human RPE og nethinden kan opnås ved hjælp af denne protokol. Denne metode giver mulighed for undersøgelse af regionale forskelle i RPE-form på tværs af hele menneskelige nethinden5. Et afgørende skridt i protokollen er den fysiske adskillelse af RPE og nethinden. Hvis de to væv ikke er helt løsrevet i nogle områder, skal man forsigtigt løfte nethinden og sikre sig ikke at bryde vævene. REShAPE-analysen af store flatmounts kan kræve brug af systemer med betydelige RAM-ressourcer. I dette tilfælde kan genmontering af hele billedet deaktiveres, så softwaren kan afslutte analysen på trods af manglende behandlingsressourcer.
Den største begrænsning ved at bruge REShAPE til at segmentere humane RPE-flatmounts er, at AI-algoritmen for det meste blev trænet på billeder af induceret pluripotent stamcelleafledt RPE. Som følge heraf er segmenteringen af menneskelige RPE-flatmounts mindre nøjagtig. RPE-celler fra ældre donorer indeholder en stor mængde lipofuscin7, og det brede spektrum af dets autofluorescens forstyrrer cellegrænsesegmentering. I fremtiden vil flere billeder af RPE-flatmounts blive brugt til at forbedre cellekantsegmentering i denne type prøve. På trods af denne begrænsning blev REShAPE specifikt uddannet til at genkende og segmentere RPE-cellegrænser og fungerer bedre end andre eksisterende metoder, såsom Voronoi8 og CellProfiler9-segmentering af RPE-celler.
Desuden giver REShAPE sammenlignet med manuel segmentering 10 fordelen ved hurtigt at analysere store billeder (~ 130.000 pixels x130.000 pixels blev testet). Afslutningsvis er denne dissektionsmetode meget reproducerbar og kan let udvides til andre dyremodeller. Derudover kan softwaren bruges til at studere RPE-form i øjenfladmonteringer eller i cellekulturmodeller for at undersøge effekten af visse behandlinger. Endelig gør REShAPEs alsidighed det bredt anvendeligt til analyse af andre typer epitelceller.

Det retinale pigmentepitel (RPE) og den neurale nethinden er stærkt forbundet med hinanden på grund af fotoreceptorernes stærke fysiologiske afhængighed af RPE. Under dissektion forårsager den mekaniske adskillelse af den neurale nethinden fra RPE rivning af RPE-cellerne, hvor de apikale dele af RPE forbliver fastgjort til de ydre segmenter af retinale fotoreceptorer. Omfanget af RPE-retinal adhæsion er så stort, at mængden af pigment, der er tilbage på nethinden efter adskillelse, bruges til at kvantificere styrken af retinal adhæsion1. Specifikt bryder RPE-tætte kryds og actinstrukturen, der forbinder dem, som er placeret på den apikale side, under mekanisk adskillelse. Derfor resulterer farvning af RPE-fladmonteringer til cellegrænser i et ujævnt monolag, hvor mange celler mangler kanter. Denne effekt forværres, når vævet fikseres med paraformaldehyd (PFA) før dissektion, da proteinerne bliver tværbundet.
Undersøgelser af intravitreal lægemiddelafgivelse har vist, at injektioner af hyperosmotiske opløsninger i det bageste kammer inducerer nethindeløsning 2,3. I disse eksperimenter forårsagede 50 μL forskellige opløsninger, der spænder fra 1.000 mOsm til 2.400 mOsm, injiceret i midten af glaslegemet nethindeløsning inden for få minutter. Især selv efter lange eksponeringer for højosmolaritetsopløsninger syntes RPE-tætte kryds intakte i transmissionselektronmikroskopiske billeder af både kanin- og abeøjne3. Efter en lignende strategi injicerede vi i midten af glaslegemet en hyperosmotisk opløsning af D-mannitol for at inducere en effektiv nethindeløsning, før vi udførte RPE-dissektion. Da D-mannitol ikke transporteres af RPE4, opretholdes en høj intravitreal koncentration, hvilket genererer en osmotisk gradient. Den effektive adskillelse af RPE og nethinden over hele det bageste kammer garanterer bevarelsen af RPE-cellekrydsene og muliggør undersøgelse af RPE-morfometri på hele flatmount. Derudover udviklede vi en kunstig intelligens (AI) -baseret software, der genkender og segmenterer fluorescerende mærkede RPE-cellegrænser, kvantificerer 30 forskellige formmålinger og producerer varmekort over hver måling til visualisering 5,6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.5 mm&#160;</td>
			<td>Acuderm Inc.</td>
			<td>P1525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>160069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness&#160;</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>5075-1.5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved spatula</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K3-6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14558-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluormount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 21 G x 1-1/2&#34; hypodermic</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 27 G x 1-1/4&#34; hypodermic</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>PAL (Personna)</td>
			<td>62-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom tubes 50 mL</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>9SIA4SR9M88854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Vitrectomy System</td>
			<td>BD Visitrec</td>
			<td>585100</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlack</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23007</td>
			<td>autofluorescence quencher&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>20605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 3 mm cutting edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and consistent generation of retinal pigment epithelium/choroid flatmounts from human eyes for histological analysis

Det retinale pigmentepitel (RPE) og nethinden er funktionelt og strukturelt forbundne væv, der arbejder sammen for at regulere lysopfattelse og syn. Proteiner på RPE's apikale overflade er tæt forbundet med proteiner på fotoreceptorens ydre segmentoverflade, hvilket gør det vanskeligt konsekvent at adskille RPE fra fotoreceptorerne/nethinden. Vi udviklede en metode til effektivt at adskille nethinden fra RPE i menneskelige øjne for at generere komplette RPE / choroid og retina flatmounts til separat cellulær analyse af fotoreceptorer og RPE-celler. En intravitreal injektion af en højosmolaritetsopløsning af D-mannitol, et sukker, der ikke transporteres af RPE, inducerede adskillelsen af RPE og nethinden over hele det bageste kammer uden at forårsage skade på RPE-cellekrydsene. Ingen RPE patches blev observeret fastgjort til nethinden. Phalloidin mærkning af actin viste RPE form bevarelse og tilladt morfometrisk analyse af hele epitelet. En kunstig intelligens (AI) -baseret software blev udviklet til nøjagtigt at genkende og segmentere RPE-cellegrænserne og kvantificere 30 forskellige formmålinger. Denne dissektionsmetode er meget reproducerbar og kan let udvides til andre dyremodeller.

Denne protokol resulterer i et enkeltplanbillede af en flatmount, hvor celleplaceringen og 30 formmålinger måles for hver korrekt identificeret RPE-celle (figur 2). En mappe med navnet "Behandlet" genereres automatisk inde i inputmappen. Denne mappe indeholder fire undermapper med navnene "Analyse", "Farvekodet", "Kombinerede filer" og "Segmenterede billeder" og nogle midlertidige filer, der genereres under analysen. Mappen "Kombinerede filer" indeholder et regneark med alle formmålinger og et regneark med frekvenserne for cellenabotællingerne for alle filerne kombineret. Mappen "Analyse" indeholder et regneark med alle formmålinger og et regneark med frekvenserne af cellenabotællingerne for hvert billede separat. Mappen "Segmented Images" indeholder de endelige binære masker af RPE-cellegrænserne; Det kan bruges til at evaluere kvaliteten af segmenteringen. Mappen "Farvekodet" indeholder varmekort for hver formmåling for at visualisere formmønstrene i hvert billede. Definitionerne og forkortelserne af formmetrik findes i tabel 1.
Nogle gange kan RPE flatmounts indeholde resterende stykker nethinden, der ikke blev fjernet rent, især omkring synsnerven. Phalloidinfarvning af prøven resulterer i et stærkt signal, der kommer fra nethinden, og dette kan forårsage problemer for RPE-cellegrænsesegmentering. Nogle fliser vises helt sorte, mens de omgivende fliser viser normal segmentering. Andre lyse objekter, der kan være til stede i billedet, vil også forårsage generering af sorte fliser (figur 3). I disse tilfælde forhindrer valg af en af filtreringsindstillingerne (Svag, Regelmæssig, Stærk), der er tilgængelig i rullemenuen Arti-filter , dannelsen af sorte fliser.
REShAPE tager 8-bit eller 16-bit gråtonebilleder som input, men ikke RGB-billeder. Brug af RGB-billeder til REShAPE-analysen producerer helt sorte binære billeder. Hvis dette sker, vil konvertering af RGB-billeder til gråtoner producere korrekt segmenterede binære billeder (figur 4). Ved nogle lejligheder, hvor RPE-grænserne ikke genkendes korrekt, for eksempel hvis farvningen ikke er optimal, eller hvis prøven er beskadiget af en ridse (figur 5A), kan store klumper af celler identificeres som en enkelt meget stor celle (figur 5B). I dette tilfælde kan store objekter udelukkes fra analysen ved at reducere cellestørrelsestærsklen (figur 5C). Dette kan opnås ved at indsætte en lavere værdi i tekstfeltet Øverste cellestørrelse . Dette vil dog resultere i en ændring i varmekortets rækkevidde. Hvis en forsker vælger at gøre det, er det også muligt at opretholde det originale varmekortområde (figur 5D) ved at markere afkrydsningsfeltet Ja i funktionen Brug manuelle grænser?. Derefter skal forskeren venstreklikke på knappen Indstil grænser og indsætte de ønskede værdier i tekstfelterne for at angive de manuelle grænser .
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig02.jpg"> Figur 2: Komplet morfometrisk analyse af et helt humant RPE-monolag. (A) Et billede med lav forstørrelse af en hel human RPE/choroid flatmount (magenta: phalloidin). (B) Et zoomet billede af phalloidin-farvede RPE-celler. (C) REShAPE-genereret segmentering af RPE-cellegrænserne for en hel human RPE/choroid flatmount og (D) den tilsvarende zoomede visning. (E) Et softwaregenereret varmekort, der illustrerer cellearealet af de enkelte RPE-celler i hele den menneskelige flatmount. Den termiske skala i øverste venstre hjørne viser det anvendte værdiområde. (F) Den tilsvarende zoomede visning, der viser individuelle RPE-celler farvet efter område. Skalastænger = (B, D, F) 50 μm, (A, C, E) 5 mm. Forkortelse: RPE = retinal pigmentepitel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig03.jpg"> Figur 3: Filtrering af lyse artefakter. (A) En human RPE flatmount farvet til cellegrænser (magenta: phalloidin) kan præsentere lyse områder (grønne rektangler), der forstyrrer segmentering. (B) RPE-cellekantsegmenteringen af hele flatmount indeholder tre helt sorte fliser (grønne pile) svarende til lyse fluorescensområder. (C,E) To af de sorte fliser svarer til områder, der indeholder lyse prikker, som muligvis er noget affald. (D) En af de sorte fliser blev genereret af et stykke neurale nethinden omkring synsnerven, der ikke blev fjernet korrekt. Stykkerne af neurale nethinden er betydeligt lysere end RPE-laget og hindrer cellesegmentering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig04.jpg"> Figur 4: Input billede påkrævet. RPE-cellerne, der er farvet til cellekanter, blev gemt som (A) RGB eller som (B) gråtonede 16-bit billeder til REShAPE-analyse. (C) Resultatet af RBG-billedanalysen er et sort binært billede, (D), mens analysen af gråtonebilledet frembringer en korrekt segmenteret binær af cellekanterne. REShAPE kan kun analysere 8-bit eller 16-bit gråtonebilleder. Skalabjælker = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig05v2.jpg"> Figur 5: Suboptimale resultater . (A) Et billede af en del af RPE-monolaget, hvor cellerne farvet med phalloidin ved et uheld blev ridset. (B) Et varmekort over RPE-celler farvet af dimensionen af cellearealet. En stor øvre cellestørrelsestærskel inkluderer store objekter i analysen. (C) Et varmekort for celleområdet, hvor en mindre øvre cellestørrelsestærskel blev valgt for at udelukke store objekter fra analysen. (D) Et varmekort for celleområdet, hvor der blev valgt en mindre øvre cellestørrelsestærskel, og manuelle grænser blev indstillet for at opretholde det varmekortområde, der oprindeligt blev brugt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig05largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Tabel 1: REShAPE-parametre. Tabellen rapporterer definitionen af hver parameter og de forkortelser, der bruges i de rå regneark ("_Data.csv" -filer) og for varmekortene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761_Table-1.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis at JoVE.com

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Vi beskriver en metode til effektivt at adskille retinal pigmentepitel (RPE) fra nethinden i menneskets øjne og generere hele RPE/choroid flatmounts til histologiske og morfometriske analyser af RPE.

Effektiv og konsistent generering af retinal pigmentepitel / choroid flatmounts fra menneskelige øjne til histologisk analyse

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Denne metode hjælper med at forstå fænotypiske forskelle i RP-celler på tværs af hele den menneskelige nethinden. Dissektionsteknikken, som Davide Ortolan har udviklet, er meget reproducerbar til at generere en løsrivelse mellem RP og nethinden. Og REShAPE-softwaren er virkelig mærkbar ved analyse af store billeder af RP-flade monteringer.Metoden, som Davide har udviklet, kan bruges til at studere regionale forskelle i RP-fænotypen fra patienter med forskellige typer retinale degenerative sygdomme. Til at begynde med skal du skære det 50 ml koniske rør lidt under 5 ml-mærket. Brug varm lim til at fastgøre rørspidsen til bunden af vejebåden.Bland derefter de to komponenter i silikoneelastomersættet i forholdet 10 til 1 og undgå at fange luft. Hæld blandingen i vejebåden, der indeholder dette sfæriske stykke af det rundbundede rør. Hærd silikonen ved stuetemperatur natten over.Fjern vejebåden og det runde bundrør fra den hærdede silikoneform. Fyld først en 1 ml sprøjte med 1700 millimol D-mannitolopløsning og fastgør den til en 21-gauge nål. Indsæt nålen gennem pars plana for at undgå punktering af øjets forreste kammer og injicer 400 mikroliter af opløsningen i glaslegemet.Lad øjet stå ved stuetemperatur i 45 minutter. Brug en fin saks og tang til at åbne det forreste kammer på niveau med pars plana. Fyld det bageste øjenkammer med DPBS indeholdende calcium og magnesium.Under stereomikroskopet lokaliseres makulaen visualiseret som en gul plet på nethinden. Skær øjet i kvadranter, nemlig nasal, tidsmæssig, overlegen og ringere, samtidig med at man sørger for at bevare makularegionen. Fjern nålene, hvis de er i vejen.Overfør sommerfuglen til øjets bageste kammer i en 100 millimeter petriskål indeholdende DPBS med calcium og magnesium. Før du fjerner nethinden, skal du markere kronbladet, der indeholder makulaen, ved at lave et V-formet snit i ciliarymargenen. Løft og skær alt det glasagtige, der ligger på nethinden.Skær nethinden fra ciliarymargenerne i alle kronblade, og sørg for ikke at ridse RPE. Placer vævet i 4%PFA og inkuber i en time. Vask tre gange med DPBS indeholdende calcium og magnesium.Overfør vævet til en beholder fyldt med samme buffer og opbevar det ved 4 grader Celsius. Overfør derefter prøven til en 100 millimeter petriskål indeholdende DPBS med calcium og magnesium. Stans det optiske nervehoved ud med en 1,5 millimeter biopsistans.Saml nethinden og opbevar den i samme buffer ved 4 grader Celsius. For at fjerne sclera fra RPE-choroiden skal du forsigtigt løfte RPE-choroidlaget fra periferien. Derefter klippes koroidalkarrene og bindevævet, der er mellem sclera og RPE, med en Vannas fjedersaks.Efter fuldstændig adskillelse fra scleraen samles RPE-choroidlaget. Overfør vævet til en beholder fyldt med DPBS indeholdende calcium og magnesium, og opbevar det ved 4 grader Celsius. Overfør RPE-choroid til en brønd på en plade med seks brønde.Prøven blokeres og permeabiliseres i en time ved stuetemperatur. Prøven inkuberes i en time ved stuetemperatur med phalloidin konjugeret med 647 fluorofor ved en 1-til-250 fortynding i permeabiliseringsbufferen. Vask tre gange i DPBS indeholdende calcium og magnesium.Overfør RPE-choroidprøven til et 50 x 75 millimeter glasglas og flad den. Skær hvert kronblad i to for at gøre prøven fladere. Tegn en kontur af den flade montering med en hydrofob pen.For at slukke lipofuscinautofluorescensen tilsættes 500 mikroliter autofluorescensdæmperopløsning og inkuberes ved stuetemperatur i to minutter. Vask grundigt i DPBS indeholdende calcium og magnesium. Fjern DPBS, og tilføj monteringsmediet.Placer et dækglas på den flade holder og forsegl med neglelak. Åbn softwaren. På fanen mapper skal du vælge input- og outputmapperne.Lad softwaren automatisk ændre stien til inputmappen eller processen i outputmappen. Alternativt kan du ændre outputmappen manuelt. For at generere varmekort skal du vælge alle i rullemenuen i Opret farvebilleder fane.Marker afkrydsningsfeltet nej i funktionen Brug manuelle grænser for at lade softwaren bruge de minimums- og maksimumværdier, der er registreret i hvert billede. Marker afkrydsningsfeltet ja for manuelt at justere værdiområdet for hver form metrisk varmekort. Klik derefter på knappen Indstil grænser og indsæt værdier i tekstfelterne for at vælge intervaller for de enkelte parametre.Når du har ændret værdierne af interesse, skal du klikke på Gem. Klik på lave standardindstillinger for at nulstille alle grænserne. Hvis du vil vælge en cellestørrelsestærskel i lavere cellestørrelse, skal du indsætte størrelsen på den mindste celle, der skal medtages i analysen.Indsæt størrelsen på den største celle, der skal medtages, i øverste cellestørrelse. I konvertere pixels til reelle enheder skal du markere nej for at køre analysen i pixelenheder, markere ja for at køre analysen i mikrometer. Angiv pixelværdien i tekstfeltet i længden af pixel på skalalinjen.I længden af skalastangmikron skal du indtaste den tilsvarende afstand i mikrometer. For at starte analysen skal du trykke på go for it. Denne protokol resulterer i et enkeltplanbillede af en flad montering, hvor celleplaceringen identificeres ved REShAPE-genereret segmentering af RPE-cellekanterne.Der måles også 30 formmålinger, herunder cellearealet for de enkelte RPE-celler, for hver korrekt identificeret RPE-celle. Sorte fliser, der stammer fra resterende nethindestykker eller andre lyse genstande, kan fjernes ved at vælge en af de tilgængelige filtreringsindstillinger i rullemenuen RT-filter. Brug af RBG-billeder til omformningsanalysen producerer helt sorte binære billeder.Hvis dette sker, vil konvertering af RGB-billeder til gråskala producere korrekt segmenterede binære billeder. Hvis farvningen ikke er optimal, eller hvis prøven er beskadiget af en ridse, kan store klumper af celler identificeres som en enkelt meget stor celle. I dette tilfælde kan store objekter udelukkes fra analysen ved at ændre cellestørrelsestærsklen.For at opnå et fladt væv skal RP og choroid adskilles fra sclera, selvom disse trin kan tage lang tid. Efter genereringen af RP-fladmonteringen er det muligt at plette for yderligere RPE-markører, så du kan studere forskellige regioner i RP-monolaget. Ved hjælp af denne metode har vi opdaget fem forskellige RP-populationer, der er forskelligt følsomme over for forskellige retinale degenerative sygdomme.

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Hurtig og effektiv generering af neuroner fra humane pluripotente stamceller i en Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Hurtig og effektiv zebrafisk Genotypebestemmelse Brug PCR med høj opløsning Melt Analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effektiv Produktion og oprensning af rekombinant murin Kindlin-3 fra Insect Celler til Biofysiske Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelige induceret pluripotente stamceller fra humane somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MicroRNA Expression Profiler af menneskelige iPS celler, retinale pigmentepitel arvet fra iPS og Føtal retinale pigmentepitel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinal Transplantation af humane embryonale stamceller afledt retinal Pigment epitel celler ind i en stor-eyed Model af geografisk atrofi

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primære cellekulturer fra mus retinale Pigment epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Effektiv dissektion og kultur af primære mus Retinal Pigment Epitel celler

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Generation af humane nyre tubuloider fra væv og urin

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primær kultur af porcine retinale pigmentepitelceller

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...