Name: efficient and consistent generation of retinal pigment epithelium/choroid flatmounts from human eyes for histological analysis
Uploaded: 2022-10-28T15:00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis at JoVE.com

हम ज़ीस एक्सियो स्कैन.जेड 1 के उपयोग के लिए नेशनल आई इंस्टीट्यूट (एनईआई) हिस्टोलॉजी कोर को धन्यवाद देते हैं। हम दानदाताओं, उनके परिवारों, एडवांसिंग साइट नेटवर्क और लायंस आई इंस्टीट्यूट को उनकी उदारता के लिए भी धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनईआई आईआरपी फंड (अनुदान संख्या ज़िया ईवाई000533-04) द्वारा समर्थित किया गया था।

<ol>
	<li>Endo, E. G., Yao, X. Y., Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pigment+adherence+as+a+measure+of+retinal+adhesion:+Dependence+on+temperature.">Pigment adherence as a measure of retinal adhesion: Dependence on temperature.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (9), 1390-1396 (1988).</li><li>Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+detachment+from+hyperosmotic+intravitreal+injection.">Retinal detachment from hyperosmotic intravitreal injection.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 18 (12), 1237-1244 (1979).</li><li>Marmor, M. F., Martin, L. J., Tharpe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotically+induced+retinal+detachment+in+the+rabbit+and+primate.+Electron+microscopy+of+the+pigment+epithelium.">Osmotically induced retinal detachment in the rabbit and primate. Electron microscopy of the pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 19 (9), 1016-1029 (1980).</li><li>Ban, Y., Rizzolo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+model+of+development+reveals+multiple+properties+of+RPE+tight+junctions.">A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions.</a> Molecular Vision. 3, 18 (1997).</li><li>Ortolan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-resolution+map+of+human+retinal+pigment+epithelium+helps+discover+subpopulations+with+differential+disease+sensitivity.">Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (19), 2117553119 (2022).</li><li>Schaub, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+learning+predicts+function+of+live+retinal+pigment+epithelium+from+quantitative+microscopy.">Deep learning predicts function of live retinal pigment epithelium from quantitative microscopy.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 1010-1023 (2020).</li><li>Beatty, S., Koh, H. -. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration.">The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).</li><li>Liu, Z., Kocaoglu, O. P., Miller, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+retinal+pigment+epithelial+cells+in+the+living+human+retina.">3D imaging of retinal pigment epithelial cells in the living human retina.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (9), 533-543 (2016).</li><li>Bhatia, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RPE+morphometry+in+human+eyes.">Analysis of RPE morphometry in human eyes.</a> Molecular Vision. 22, 898-916 (2016).</li><li>vonder Emde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+cell+shape+descriptors+for+the+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration:+A+comparison+to+unaffected+eyes.">Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes.</a> Translational Vision Science &amp; Technology. 11 (8), 19 (2022).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके मानव आरपीई और रेटिना के सुसंगत और कुशल पृथक्करण को प्राप्त किया जा सकता है। यह विधि पूरे मानव रेटिना 5 में आरपीई आकार में क्षेत्रीय अंतरके अध्ययन की अनुमति देती है। प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम आरपीई और रेटिना का भौतिक पृथक्करण है। यदि कुछ क्षेत्रों में दो ऊतक पूरी तरह से अलग नहीं हैं, तो किसी को धीरे से रेटिना को उठाना चाहिए, यह सुनिश्चित करना चाहिए कि ऊतकों को तोड़ा न जाए। बड़े फ्लैटमाउंट के RESHAPE विश्लेषण को काफी रैम संसाधनों वाले सिस्टम के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है। इस मामले में, प्रसंस्करण संसाधनों की कमी के बावजूद सॉफ्टवेयर को सफलतापूर्वक विश्लेषण पूरा करने की अनुमति देने के लिए पूरी छवि के पुनर्संयोजन को अक्षम किया जा सकता है।
मानव आरपीई फ्लैटमाउंट को विभाजित करने के लिए आरईएसएचएपीई का उपयोग करने की मुख्य सीमा यह है कि एआई एल्गोरिदम को ज्यादातर प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न आरपीई की छवियों पर प्रशिक्षित किया गया था। नतीजतन, मानव आरपीई फ्लैटमाउंट का विभाजन कम सटीक है। वृद्ध दाताओं से आरपीई कोशिकाओं में बड़ी मात्रा में लिपोफसिन7 होता है, और इसके ऑटोफ्लोरेसेंस का व्यापक स्पेक्ट्रम सेल सीमा विभाजन में हस्तक्षेप करता है। भविष्य में, इस तरह के नमूने में सेल सीमा विभाजन को बेहतर बनाने के लिए आरपीई फ्लैटमाउंट की अधिक छवियों का उपयोग किया जाएगा। इस सीमा के बावजूद, RESHAPE को विशेष रूप से आरपीई सेल सीमाओं को पहचानने और विभाजित करने के लिए प्रशिक्षित किया गया था और अन्य मौजूदा तरीकों की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करता है, जैसे कि वोरोनोई8 और सेलप्रोफाइलर9 आरपीई कोशिकाओं का विभाजन।
इसके अलावा, मैनुअल विभाजन10 की तुलना में, RESHAPE बड़ी छवियों का जल्दी से विश्लेषण करने का लाभ प्रदान करता है (~ 130,000 पिक्सेल x 130,000 पिक्सेल का परीक्षण किया गया था)। अंत में, यह विच्छेदन विधि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और इसे आसानी से अन्य पशु मॉडल तक बढ़ाया जा सकता है। इसके अलावा, सॉफ्टवेयर का उपयोग आंखों के फ्लैटमाउंट में आरपीई आकार का अध्ययन करने या कुछ उपचारों के प्रभाव की जांच करने के लिए सेल कल्चर मॉडल में किया जा सकता है। अंत में, RESHAPE की बहुमुखी प्रतिभा इसे अन्य प्रकार के उपकला कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए व्यापक रूप से लागू करती है।

रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) और तंत्रिका रेटिना आरपीई पर फोटोरिसेप्टर की मजबूत शारीरिक निर्भरता के कारण एक दूसरे के साथ दृढ़ता से जुड़े हुए हैं। विच्छेदन के दौरान, आरपीई से तंत्रिका रेटिना का यांत्रिक पृथक्करण आरपीई कोशिकाओं के फटने का कारण बनता है, जिसमें आरपीई के एपिकल भाग रेटिना फोटोरिसेप्टर के बाहरी खंडों से जुड़े रहते हैं। आरपीई-रेटिना आसंजन की सीमा इतनी अधिक है कि अलगाव के बाद रेटिना पर शेष वर्णक की मात्रा का उपयोग रेटिना आसंजन1 की ताकत को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। विशेष रूप से, आरपीई तंग जंक्शन और एक्टिन संरचना जो उन्हें जोड़ती है, जो एपिकल साइड पर स्थित हैं, यांत्रिक पृथक्करण के दौरान टूट जाती हैं। इसलिए, सेल सीमाओं के लिए आरपीई फ्लैटमाउंट को धुंधला करने से एक पैची मोनोलेयर होता है जिसमें कई कोशिकाओं की सीमाएं गायब होती हैं। यह प्रभाव तब बढ़ जाता है जब ऊतक को विच्छेदन से पहले पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ तय किया जाता है, क्योंकि प्रोटीन क्रॉसलिंक हो जाते हैं।
इंट्राविट्रल दवा वितरण पर अध्ययन से पता चला है कि पीछे के कक्ष में हाइपरोस्मोटिक समाधान के इंजेक्शन रेटिना डिटेचमेंट 2,3 को प्रेरित करते हैं। इन प्रयोगों में, 1,000 mOsm से 2,400 mOsm तक के विभिन्न समाधानों के 50 μL, को मध्य-विट्रस में इंजेक्ट किया गया, जिससे मिनटों के भीतर रेटिना डिटेचमेंट हुआ। विशेष रूप से, उच्च-परासरण समाधानों के लंबे एक्सपोजर के बाद भी, आरपीई तंग जंक्शन खरगोश औरबंदर दोनों आंखों के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक छवियों में बरकरार दिखाई दिए। इसी तरह की रणनीति के बाद, हमने आरपीई विच्छेदन करने से पहले एक कुशल रेटिना डिटेचमेंट को प्रेरित करने के लिए डी-मैनिटोल के एक हाइपरोस्मोटिक समाधान को मध्य-विट्रियस में इंजेक्ट किया। चूंकि डी-मैनिटोल को आरपीई4 द्वारा नहीं ले जाया जाता है, इसलिए एक उच्च इंट्राविट्रल एकाग्रता बनाए रखी जाती है, जिससे आसमाटिक ढाल उत्पन्न होती है। पूरे पश्चवर्ती कक्ष में आरपीई और रेटिना का कुशल पृथक्करण आरपीई सेलुलर जंक्शनों के संरक्षण की गारंटी देता है और पूरे फ्लैटमाउंट पर आरपीई मॉर्फोमेट्री के अध्ययन की अनुमति देता है। इसके अलावा, हमने एक कृत्रिम बुद्धिमत्ता (एआई) -आधारित सॉफ्टवेयर विकसित किया है जो फ्लोरोसेंटली लेबल आरपीई सेल सीमाओं को पहचानता है और सेगमेंट करता है, 30 अलग-अलग आकार मैट्रिक्स को निर्धारित करता है, और विज़ुअलाइज़ेशन 5,6 के लिए प्रत्येक मीट्रिक के हीटमैप का उत्पादन करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.5 mm&#160;</td>
			<td>Acuderm Inc.</td>
			<td>P1525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>160069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness&#160;</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>5075-1.5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved spatula</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K3-6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14558-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluormount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 21 G x 1-1/2&#34; hypodermic</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 27 G x 1-1/4&#34; hypodermic</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>PAL (Personna)</td>
			<td>62-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom tubes 50 mL</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>9SIA4SR9M88854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Vitrectomy System</td>
			<td>BD Visitrec</td>
			<td>585100</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlack</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23007</td>
			<td>autofluorescence quencher&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>20605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 3 mm cutting edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and consistent generation of retinal pigment epithelium/choroid flatmounts from human eyes for histological analysis

रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) और रेटिना कार्यात्मक और संरचनात्मक रूप से जुड़े ऊतक हैं जो प्रकाश धारणा और दृष्टि को विनियमित करने के लिए एक साथ काम करते हैं। आरपीई एपिकल सतह पर प्रोटीन फोटोरिसेप्टर बाहरी खंड की सतह पर प्रोटीन के साथ कसकर जुड़े होते हैं, जिससे आरपीई को फोटोरिसेप्टर / रेटिना से लगातार अलग करना मुश्किल हो जाता है। हमने फोटोरिसेप्टर और आरपीई कोशिकाओं के अलग-अलग सेलुलर विश्लेषण के लिए पूर्ण आरपीई / कोरॉयड और रेटिना फ्लैटमाउंट उत्पन्न करने के लिए मानव आंखों के आरपीई से रेटिना को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए एक विधि विकसित की। डी-मैनिटोल के उच्च-परासरण समाधान के एक इंट्राविट्रल इंजेक्शन, आरपीई द्वारा परिवहन नहीं की गई चीनी, ने आरपीई सेल जंक्शनों को नुकसान पहुंचाए बिना पूरे पीछे के कक्ष में आरपीई और रेटिना के पृथक्करण को प्रेरित किया। रेटिना से जुड़ा कोई आरपीई पैच नहीं देखा गया। एक्टिन के फेलोइडिन लेबलिंग ने आरपीई आकार संरक्षण दिखाया और पूरे उपकला के मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण की अनुमति दी। आरपीई सेल सीमाओं को सटीक रूप से पहचानने और विभाजित करने और 30 विभिन्न आकार मैट्रिक्स को निर्धारित करने के लिए एक कृत्रिम बुद्धिमत्ता (एआई) आधारित सॉफ्टवेयर विकसित किया गया था। यह विच्छेदन विधि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और इसे आसानी से अन्य पशु मॉडल तक बढ़ाया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप एक फ्लैटमाउंट की एकल-विमान छवि होती है, जहां सेल स्थान और 30 आकार मैट्रिक्स को हर सही ढंग से पहचाने गए आरपीई सेल (चित्रा 2) के लिए मापा जाता है। इनपुट निर्देशिका के अंदर "संसाधित" नामक एक फ़ोल्डर स्वचालित रूप से उत्पन्न होता है। इस फ़ोल्डर में चार उप-निदेशक हैं, जिनका नाम "विश्लेषण," "रंग कोडित," "संयुक्त फ़ाइलें" और "खंडित छवियां" और विश्लेषण के दौरान उत्पन्न कुछ अस्थायी फ़ाइलें हैं। "संयुक्त फ़ाइलें" फ़ोल्डर में सभी आकार मापों के साथ एक स्प्रेडशीट और सभी फ़ाइलों की सेल पड़ोसी गणना की आवृत्तियों के साथ एक स्प्रेडशीट होती है। "विश्लेषण" फ़ोल्डर में सभी आकार मापों के साथ एक स्प्रेडशीट और प्रत्येक छवि के लिए अलग-अलग सेल पड़ोसी की आवृत्तियों के साथ एक स्प्रेडशीट होती है। "खंडित छवियां" निर्देशिका में आरपीई सेल सीमाओं के अंतिम बाइनरी मास्क शामिल हैं; इसका उपयोग विभाजन की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। "रंग कोडित" निर्देशिका में प्रत्येक छवि में आकार पैटर्न की कल्पना करने के लिए प्रत्येक आकार माप के लिए हीटमैप होते हैं। आकृति मीट्रिक परिभाषाएँ और संक्षिप्तीकरण तालिका 1 में पाए जा सकते हैं।
कभी-कभी आरपीई फ्लैटमाउंट में रेटिना के अवशिष्ट टुकड़े हो सकते हैं जिन्हें साफ रूप से हटाया नहीं गया था, खासकर ऑप्टिक तंत्रिका के आसपास। नमूने के फेलोइडिन धुंधला होने के परिणामस्वरूप रेटिना से एक मजबूत संकेत आता है, और इससे आरपीई सेल सीमा विभाजन के लिए समस्याएं हो सकती हैं। कुछ टाइलें पूरी तरह से काली दिखाई देंगी, जबकि आसपास की टाइलें सामान्य विभाजन दिखाएंगी। अन्य उज्ज्वल वस्तुएं जो छवि में मौजूद हो सकती हैं, वे भी काली टाइलों की पीढ़ी का कारण बनेंगी (चित्रा 3)। इन मामलों में, आरती फ़िल्टर ड्रॉपडाउन मेनू में उपलब्ध फ़िल्टरिंग विकल्पों (कमजोर, नियमित, मजबूत) में से एक चुनने से काली टाइलों के गठन को रोका जा सकेगा।
RESHAPE इनपुट के रूप में 8-बिट या 16-बिट ग्रेस्केल छवियों को लेता है लेकिन RGB छवियों को नहीं। RESHAPE विश्लेषण के लिए RGB छवियों का उपयोग पूरी तरह से काले बाइनरी छवियों का उत्पादन करेगा। यदि ऐसा होता है, तो आरजीबी छवियों को ग्रेस्केल में परिवर्तित करने से सही ढंग से खंडित द्विआधारी छवियां उत्पन्न होंगी (चित्रा 4)। कुछ अवसरों पर जहां आरपीई सीमाओं को सही ढंग से पहचाना नहीं जाता है, उदाहरण के लिए, यदि धुंधलापन इष्टतम नहीं है या यदि नमूना खरोंच (चित्रा 5 ए) से क्षतिग्रस्त हो जाता है, तो कोशिकाओं के बड़े झुरमुट को एकल बहुत बड़े सेल (चित्रा 5 बी) के रूप में पहचाना जा सकता है। इस मामले में, बड़ी वस्तुओं को सेल आकार सीमा (चित्रा 5 सी) को कम करके विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है। यह ऊपरी सेल आकार पाठ बॉक्स में निम्न मान सम्मिलित करके प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, इसके परिणामस्वरूप हीटमैप की सीमा में बदलाव होगा। यदि कोई शोधकर्ता ऐसा करना चुनता है, तो उपयोग मैनुअल सीमा सुविधा में बॉक्स हां की जांच करके मूल हीटमैप रेंज (चित्रा 5 डी) को बनाए रखना भी संभव है। इसके बाद, शोधकर्ता को सीमा सेट बटन पर बाएं-क्लिक करना होगा और मैन्युअल सीमाओं को निर्दिष्ट करने के लिए टेक्स्ट बॉक्स में वांछित मान सम्मिलित करना होगा।
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig02.jpg"> चित्र 2: एक संपूर्ण मानव आरपीई मोनोलेयर का पूर्ण मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण। (ए) एक संपूर्ण मानव आरपीई / कोरॉयड फ्लैटमाउंट (मैजेंटा: फेलोइडिन) का एक कम आवर्धन दृश्य। (बी) फेलोइडिन-दाग वाले आरपीई कोशिकाओं के दृश्य में एक ज़ूम-इन। (ग) संपूर्ण मानव आरपीई/कोरॉयड फ्लैटमाउंट के लिए आरपीई सेल सीमाओं का आरईएसएचएपीई-जनित विभाजन और (डी) तदनुरूपी ज़ूम-इन दृश्य। (ई) एक सॉफ्टवेयर-जनित हीटमैप जो पूरे मानव फ्लैटमाउंट में व्यक्तिगत आरपीई कोशिकाओं के सेल क्षेत्र को दर्शाता है। ऊपरी-बाएं कोने पर थर्मल स्केल उपयोग किए गए मूल्यों की सीमा को दर्शाता है। (एफ) संबंधित ज़ूम-इन दृश्य क्षेत्र द्वारा रंगीन अलग-अलग आरपीई कोशिकाओं को दर्शाता है। स्केल बार = (बी, डी, एफ) 50 μm, (A, C, E) 5 मिमी। संक्षिप्त नाम: आरपीई = रेटिना वर्णक उपकला। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig03.jpg"> चित्र 3: उज्ज्वल कलाकृतियों की फ़िल्टरिंग। (A) सेल सीमाओं (Magenta: fhalloidin) के लिए सना हुआ एक मानव RPE फ्लैटमाउंट उज्ज्वल क्षेत्रों (हरे आयताकार) को प्रस्तुत कर सकता है जो विभाजन में हस्तक्षेप करते हैं। (बी) पूरे फ्लैटमाउंट के आरपीई सेल सीमा विभाजन में प्रतिदीप्ति के उज्ज्वल क्षेत्रों के अनुरूप तीन पूरी तरह से काली टाइलें (हरे तीर) होती हैं। (C, E) काली टाइलों में से दो उज्ज्वल बिंदुओं वाले क्षेत्रों के अनुरूप हैं, जो संभवतः कुछ मलबे हैं। (डी) काली टाइलों में से एक ऑप्टिक तंत्रिका के चारों ओर तंत्रिका रेटिना के एक टुकड़े द्वारा उत्पन्न किया गया था जिसे सही ढंग से नहीं हटाया गया था। तंत्रिका रेटिना के टुकड़े आरपीई परत की तुलना में काफी उज्जवल होते हैं और सेल विभाजन में बाधा डालते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig04.jpg"> चित्रा 4: इनपुट छवि आवश्यकता। सेल सीमाओं के लिए दागदार आरपीई कोशिकाओं को (ए) आरजीबी या (बी) ग्रेस्केल 16-बिट छवियों के रूप में RESHAPE विश्लेषण के लिए सहेजा गया था। (सी) आरबीजी छवि विश्लेषण का आउटपुट एक काली द्विआधारी छवि है, (डी) जबकि ग्रेस्केल छवि का विश्लेषण सेल सीमाओं के सही ढंग से खंडित बाइनरी का उत्पादन करता है। RESHAPE केवल 8-बिट या 16-बिट ग्रेस्केल छवियों का विश्लेषण कर सकता है। स्केल पट्टियाँ = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig05v2.jpg"> चित्र 5: उप-मानक परिणाम. (A) RPE मोनोलेयर के एक हिस्से की एक छवि जहां फेलोइडिन से दागी कोशिकाओं को गलती से खरोंच दिया गया था. (बी) सेल क्षेत्र के आयाम द्वारा रंगीन आरपीई कोशिकाओं का एक हीटमैप। एक बड़े ऊपरी सेल आकार की सीमा में विश्लेषण में बड़ी वस्तुएं शामिल हैं। (सी) एक सेल क्षेत्र हीटमैप जिसमें विश्लेषण से बड़ी वस्तुओं को बाहर करने के लिए एक छोटी ऊपरी सेल आकार सीमा चुनी गई थी। (डी) एक सेल क्षेत्र हीटमैप जिसमें एक छोटी ऊपरी सेल आकार सीमा चुनी गई थी और मूल रूप से उपयोग किए जाने वाले हीटमैप रेंज को बनाए रखने के लिए मैनुअल सीमा निर्धारित की गई थी। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig05largev2.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
तालिका 1: RESHAPE पैरामीटर। तालिका प्रत्येक पैरामीटर की परिभाषा और कच्चे स्प्रेडशीट ("_Data.csv" फ़ाइलों) और हीटमैप्स के लिए उपयोग किए जाने वाले संक्षिप्तीकरण की रिपोर्ट करती है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761_Table-1.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

हम मानव आंखों में रेटिना से रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) को कुशलतापूर्वक अलग करने और आरपीई के हिस्टोलॉजिकल और मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पूरे आरपीई / कोरॉयड फ्लैटमाउंट उत्पन्न करने की एक विधि का वर्णन करते हैं।

हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए मानव आंखों से रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम / कोरॉयड फ्लैटमाउंट की कुशल और सुसंगत पीढ़ी

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

यह विधि पूरे मानव रेटिना में आरपी कोशिकाओं के फेनोटाइपिक अंतर को समझने में मदद करती है। डेविड ओर्टोलन ने जो विच्छेदन तकनीक विकसित की है, वह आरपी और रेटिना के बीच एक अलगाव पैदा करने में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। और RESHAPE सॉफ्टवेयर आरपी फ्लैट माउंट की बड़ी छवियों का विश्लेषण करने में वास्तव में सराहनीय है।डेविड ने जो विधि विकसित की है, उसका उपयोग विभिन्न प्रकार के रेटिना अपक्षयी रोगों वाले रोगियों से आरपी फेनोटाइप में क्षेत्रीय अंतर का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। शुरू करने के लिए, 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को 5 मिलीलीटर निशान से थोड़ा नीचे काट लें। गर्म गोंद का उपयोग करके, ट्यूब टिप को वजन वाली नाव के तल पर संलग्न करें।फिर सिलिकॉन इलास्टोमेर किट के दो घटकों को 10-टू-1 अनुपात में मिलाएं, जो हवा को फंसाने से बचें। मिश्रण को गोल तल ट्यूब के इस गोलाकार टुकड़े वाले वजन वाली नाव में डालें। रात भर कमरे के तापमान पर सिलिकॉन का इलाज करें।ठीक सिलिकॉन मोल्ड से वजन करने वाली नाव और गोल निचले ट्यूब को हटा दें। सबसे पहले, डी-मैनिटोल समाधान के 1700 मिलीमोल्स के साथ 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें और इसे 21-गेज सुई से संलग्न करें। आंख के पूर्ववर्ती कक्ष को छिद्रित करने से बचने के लिए पार्स प्लाना के माध्यम से सुई डालें और घोल के 400 माइक्रोलीटर को विट्रियस में इंजेक्ट करें।आंख को कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए छोड़ दें। बारीक कैंची और बल की एक जोड़ी का उपयोग करके, पार्स प्लाना के स्तर पर पूर्ववर्ती कक्ष को खोलें। कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त डीपीबीएस के साथ पीछे की आंख कक्ष भरें।स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, रेटिना पर पीले धब्बे के रूप में कल्पना किए गए मैक्यूला को स्थानीयकृत करें। मैकुलर क्षेत्र को संरक्षित करते हुए आंख को क्वाड्रेंट्स, अर्थात् नाक, अस्थायी, बेहतर और हीन में काटें। सुइयों को हटा दें यदि वे रास्ते में हैं।तितली को कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ डीपीबीएस युक्त 100 मिलीमीटर पेट्री डिश में आंख के पीछे के कक्ष में स्थानांतरित करें। रेटिना को हटाने से पहले, सीलरी मार्जिन में वी-आकार का कट बनाकर उस पंखुड़ी को चिह्नित करें जिसमें मैक्युला होता है। रेटिना पर पड़े सभी विट्रियस को उठाएं और काट लें।सभी पंखुड़ियों में सिलियरी मार्जिन से रेटिना काटें ताकि आरपीई को खरोंच न हो। ऊतक को 4% पीएफए में रखें और एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त डीपीबीएस के साथ तीन बार धोएं।ऊतक को उसी बफर से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इसके बाद, नमूने को कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ डीपीबीएस युक्त 100 मिलीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। ऑप्टिक तंत्रिका सिर को 1.5 मिलीमीटर बायोप्सी पंच के साथ बाहर निकालें।रेटिना को इकट्ठा करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर उसी बफर में स्टोर करें। आरपीई कोरॉयड से श्वेतपटल को हटाने के लिए, धीरे से आरपीई कोरॉयड परत को परिधि से उठाएं। फिर वन्नास स्प्रिंग कैंची की एक जोड़ी के साथ, कोरॉइडल वाहिकाओं और संयोजी ऊतक को काटें जो श्वेतपटल और आरपीई के बीच हैं।श्वेतपटल से पूरी तरह से अलग होने के बाद, आरपीई कोरॉयड परत एकत्र करें। ऊतक को कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त डीपीबीएस से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। आरपीई कोरॉयड को छह-वेल प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें।कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए नमूने को ब्लॉक और परमेबिलाइज करें। नमूने को कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, जिसमें 647 फ्लोरोफोरे के साथ संयुग्मित फेलोइडिन के साथ पर्मेबिलाइजेशन बफर में 1-से-250 कमजोर पड़ने पर संयुग्मित किया गया है। कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त डीपीबीएस में तीन बार धोएं।आरपीई कोरॉयड नमूने को 50 x 75 मिलीमीटर ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें और इसे चपटा करें। नमूना चापलूसी बनाने के लिए प्रत्येक पंखुड़ी को दो में काट लें। हाइड्रोफोबिक पेन के साथ फ्लैट माउंट की एक रूपरेखा खींचें।लिपोफसिन ऑटोफ्लोरेसेंस को बुझाने के लिए, ऑटोफ्लोरेसेंस बुझाने वाले समाधान के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, और दो मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त डीपीबीएस में अच्छी तरह से धो लें। DPBS निकालें और माउंटिंग माध्यम जोड़ें।फ्लैट माउंट पर एक कवर ग्लास रखें और नेल पॉलिश से सील करें। सॉफ़्टवेयर खोलें. निर्देशिका टैब में, इनपुट और आउटपुट फ़ोल्डरका चयन करें।आउटपुट निर्देशिका में, सॉफ़्टवेयर को स्वचालित रूप से इनपुट निर्देशिका या प्रक्रिया के लिए पथ बदलने दें। वैकल्पिक रूप से, आउटपुट निर्देशिका मैन्युअल रूप से बदलें। गर्मी मानचित्र उत्पन्न करने के लिए, रंग छवियां टैब बनाने में ड्रॉपडाउन मेनू से सभी का चयन करें।सॉफ़्टवेयर को प्रत्येक छवि में पाए गए न्यूनतम और अधिकतम मानों का उपयोग करने देने के लिए उपयोग मैन्युअल सीमा सुविधा में बॉक्स संख्या की जाँच करें। प्रत्येक आकृति मीट्रिक गर्मी मानचित्र के लिए मानों की श्रेणी को मैन्युअल रूप से समायोजित करने के लिए बॉक्स हाँ चेक करें। फिर सेट सीमा बटन पर क्लिक करें और अलग-अलग मापदंडों के लिए श्रेणियां चुनने के लिए टेक्स्ट बॉक्स में मान डालें।ब्याज के मूल्यों को बदलने के बाद, बचत पर क्लिक करें। सभी सीमाओं को रीसेट करने के लिए कम डिफ़ॉल्ट पर क्लिक करें। निचले सेल आकार में सेल आकार सीमा का चयन करने के लिए, विश्लेषण में शामिल किए जाने वाले सबसे छोटे सेल का आकार डालें।ऊपरी सेल आकार में, शामिल किए जाने वाले सबसे बड़े सेल का आकार डालें। पिक्सेल को वास्तविक इकाइयों में परिवर्तित करने में, पिक्सेल इकाइयों में विश्लेषण चलाने के लिए नहीं की जांच करें, माइक्रोमीटर में विश्लेषण चलाने के लिए हाँ जांचें। स्केल बार पिक्सेल की लंबाई में, पाठ बॉक्स में पिक्सेल मान दर्ज करें.स्केल बार माइक्रोन की लंबाई में, माइक्रोमीटर में संबंधित दूरी दर्ज करें। विश्लेषण शुरू करने के लिए, इसके लिए जाएं दबाएं। इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप एक फ्लैट माउंट की एकल-विमान छवि होती है जहां सेल स्थान को आरपीई सेल सीमाओं के आरईएसएचएपीई-जनित विभाजन द्वारा पहचाना जाता है।इसके अलावा, व्यक्तिगत आरपीई कोशिकाओं के सेल क्षेत्र सहित 30 आकार मैट्रिक्स, प्रत्येक सही ढंग से पहचाने गए आरपीई सेल के लिए मापा जाता है। रेटिना या अन्य उज्ज्वल वस्तुओं के अवशिष्ट टुकड़ों से उत्पन्न काली टाइलों को आरटी फ़िल्टर ड्रॉपडाउन मेनू में उपलब्ध फ़िल्टरिंग विकल्पों में से एक चुनकर हटाया जा सकता है। रीशेप विश्लेषण के लिए आरबीजी छवियों का उपयोग पूरी तरह से काले बाइनरी छवियों का उत्पादन करेगा।यदि ऐसा होता है, तो आरजीबी छवियों को ग्रे स्केल में परिवर्तित करने से सही ढंग से खंडित बाइनरी छवियां उत्पन्न होंगी। यदि धुंधलापन इष्टतम नहीं है या यदि नमूना खरोंच से क्षतिग्रस्त हो जाता है, तो कोशिकाओं के बड़े झुरमुट को एकल बहुत बड़ी कोशिका के रूप में पहचाना जा सकता है। इस मामले में, बड़ी वस्तुओं को सेल आकार सीमा को बदलकर विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है।एक सपाट ऊतक प्राप्त करने के लिए, आरपी और कोरॉयड को श्वेतपटल से अलग करने की आवश्यकता होती है, भले ही इन चरणों में लंबा समय लग सकता है। आरपी फ्लैट माउंट की पीढ़ी के बाद, अतिरिक्त आरपीई मार्करों के लिए दाग लगाना संभव है ताकि आप आरपी मोनोलेयर के विभिन्न क्षेत्रों का अध्ययन कर सकें। इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने पांच अलग-अलग आरपी आबादी की खोज की है जो विभिन्न रेटिना अपक्षयी रोगों के प्रति अलग-अलग संवेदनशील हैं।

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

मानव pluripotent स्टेम सेल से एक Multititre प्लेट प्रारूप में न्यूरॉन्स की तेजी से और कुशल जनरेशन

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

उच्च संकल्प पिघल विश्लेषण के साथ पीसीआर का उपयोग तेजी से और कुशल Zebrafish जीनोटाइपिंग

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

के कुशल उत्पादन और शोधन संयोजक Murine Kindlin -3 की biophysical अध्ययन के लिए कीट कोशिकाओं से

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

सेंडाइ वायरस के साथ मानव दैहिक कोशिकाओं से कुशल उत्पादन मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

मानव आईपीएस कोशिकाओं के microRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल, आईपीएस से व्युत्पन्न रेटिना वर्णक उपकला, और भ्रूण रेटिना वर्णक उपकला

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

भौगोलिक शोष की एक बड़ी आंखों मॉडल में मानव भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न-रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के रेटिना प्रत्यारोपण

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

माउस रेटिना वर्णक उपकला से प्राथमिक सेल संस्कृतियों

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

प्राथमिक माउस रेटिना वर्णक एपिथेलियल कोशिकाओं की कुशल विच्छेदन और संस्कृति

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

ऊतक और मूत्र से मानव गुर्दे ट्यूबुलॉइड की पीढ़ी

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

पोर्सिन रेटिना पिगमेंट एपिथेलियल कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...