Name: efficient and consistent generation of retinal pigment epithelium/choroid flatmounts from human eyes for histological analysis
Uploaded: 2022-10-28T15:00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis at JoVE.com

Vi takker histologikjernen til National Eye Institute (NEI) for bruken av Zeiss Axio Scan.Z1. Vi takker også giverne, deres familier, Advancing Sight Network og Lions Eye Institute for deres generøsitet. Dette arbeidet ble støttet av NEI IRP-midler (tilskuddsnummer ZIA EY000533-04).

Cadaver menneskelige globuser ble hentet fra Advanced Sight Network (Birmingham, AL). Arbeid utført på kadavervev er unntatt av NIH Institutional Review Board fra forskningsetisk komité.
1. Forsendelse av Eye globe
<ol><li>Etter enukleasjon, send ferske øyekuler i en beholder fylt med iskald DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. NOTAT: Det er bedre å dissekere øyet innen 24 timer etter enukleasjon. RPE-morfologien endres ikke i løpet av dette tidsvinduet.</li>
</ol>2. Forberedelse av silikonform
<ol><li>Skjær bunnen 20 mm av et rundbunnsrør med diameter på 25 mm. Plasser den ved foten av en firkantet veiebåt (81 mm x 81 mm x 25 mm).</li>
	<li>Bland de to komponentene i Silicon Elastomer Kit i et 10: 1-forhold, og vær oppmerksom på ikke å fange luft. Hell blandingen i veiebåten som inneholder det sfæriske stykket av rundbunnsrøret.</li>
	<li>Herd silikonet ved romtemperatur over natten. Fjern veiebåten og rundbunnsrøret fra den herdede silikonformen.</li>
</ol>3. RPE disseksjon
<ol><li>Rengjør sclera av det friske øyet kloden av muskler og bindevev. Fest øyet til silikonformen ved hjelp av 27 G nåler tredd gjennom scleraen. Fyll hulrommet i formen med DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. MERK: Vær oppmerksom på at du ikke bryter øyekammeret. Nålene skal bare passere gjennom scleraen.</li>
	<li>Bruk en 1 ml sprøyte og en 21 G kanyle til å injisere ~400 μL med 1 700 mOsm D-mannitoloppløsning i glasslegemet. Stikk nålen gjennom pars plana for å unngå punktering av øyets fremre kammer. La øyet stå i romtemperatur i ~45 min.</li>
	<li>Klipp opp det fremre kammeret på nivået av pars plana ved hjelp av en fin saks og tang. Fyll det bakre øyekammeret med DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. Under stereomikroskopet lokaliserer du makulaen (den gule flekken på netthinnen).</li>
	<li>Hvis en kirurgisk glassplaten er tilgjengelig, fjern glasslegemet og erstatt det med DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. Alternativt kan du prøve å løfte glasslegemet med tang og klippe det med fin saks.</li>
	<li>Vær oppmerksom på å bevare makulærområdet, kutt øyet i kvadranter: nasal, temporal, overlegen og dårligere. Fjern nålene hvis de er i veien.</li>
	<li>Overfør øyets bakre smørkammer til en 100 mm petriskål som inneholder DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. Før du fjerner netthinnen, merk kronbladet som inneholder makulaen ved å lage et lite kutt (V-formet) i ciliary marginen. Løft og kutt alt glasslegemet som ligger på netthinnen.</li>
	<li>Løft netthinnen forsiktig fra flere sider med en buet slikkepott eller et par tang for å sjekke om netthinnen har løsnet fra RPE og for å la litt væske sirkulere mellom de to lagene. MERK: Netthinnen vil fortsatt være festet i selve periferien (ciliary marginer) og ved optisk nerve.</li>
	<li>Klipp netthinnen fra ciliary marginene i alle kronbladene, slik at du ikke riper på RPE. Plasser vevet i 4% PFA og inkuber i ~ 1 time. Vask 3x med DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. Overfør vevet til en beholder fylt med DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+ og oppbevar det ved 4 °C. MERK: På dette tidspunktet er netthinnen bare festet ved optisk nerve. Dette er et pausepunkt i dette eksperimentet.</li>
	<li>Overfør prøven til en 100 mm petriskål som inneholder DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. Slå ut optisk nervehode med en 1,5 mm biopsi punch og samle netthinnen. Oppbevar nevral retina i DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+ ved 4 °C. MERK: Før du slår ut optisk nervehodet, sørg for å kutte optisk nerve så mye som mulig på skleralsiden. Dette vil øke presisjonen til stansen. Punching ut optisk nerve etter flatmount er festet i 4% PFA reduserer skaden på RPE-cellene som ligger rundt optisk nerve.</li>
	<li>Fjern scleraen fra RPE / choroid ved å forsiktig løfte RPE / choroid-laget fra periferien og kutte choroidalkarene og bindevevet som er mellom sclera og RPE med et par Vannas fjærsaks. Når RPE / choroid er helt skilt fra sclera, samle RPE / choroid laget. Overfør vevet til en beholder fylt med DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+ og oppbevar det ved 4 °C. MERK: På dette tidspunktet kan eksperimentet settes på pause.</li>
</ol>4. Farging
<ol><li>Overfør RPE / choroid til en brønn på en 6-brønns plate. Blokker og permeabiliser prøven i DPBS 1x med Ca 2+ og Mg 2+ med 1 % bovint serumalbumin (BSA), 0,5 % mellom20 og 0,5 % Triton X-100 i 1 time ved romtemperatur.</li>
	<li>Inkuber prøven med phalloidin konjugert med en 647 fluorofor ved en 1:250 fortynning i DPBS 1x med Ca 2+ og Mg 2+ med 1% BSA, 0,5% Tween20 og 0,5% Triton X-100 i 1 time ved romtemperatur. Vask 3x i DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+.</li>
	<li>Overfør RPE / choroid-prøven til en 50 mm x 75 mm glassglass og flat den ut. Skjær hvert "kronblad" i to for å gjøre prøven flatere. Vær oppmerksom på makulaen. Tegn en kontur av flatfjellet med en hydrofob penn.</li>
	<li>For å slukke lipofuscin autofluorescens, tilsett 500 μL av autofluorescensoppløsningen fortynnet til 1:20 i 70% etanol og inkuber ved romtemperatur i 2 minutter.</li>
	<li>Vask grundig (minst 3x) i DPBS 1x med Ca 2+ og Mg2+. Fjern DPBS og legg til monteringsmediet. Plasser et dekselglass på flatmontert og forsegle med neglelakk.</li>
	<li>Bilde flatmount med et fluorescensmikroskop (helst ved hjelp av et 10x eller 20x objektiv).</li>
</ol>5. REShAPE-analyse
MERK: Siden REShAPE AI-basert algoritme ble trent på 10x og 20x bilder, anbefales det derfor sterkt å bruke et 10x eller 20x mål når du avbilder. Hvis ikke, må bildene skaleres tilsvarende.
<ol><li>Hvis bildene hentes med mer enn én fluorescerende kanal, isolerer du kanalen som brukes til å hente cellekantlinjene. Eksporter bildene som 16-biters TIF-filer i gråtoner. MERK: Bilder som er anskaffet med filtypen .czi trenger ikke å eksporteres som TIF-filer, men kanalen som inneholder cellekantene må fortsatt isoleres.</li>
	<li>Installer programvaren på Windows x64- eller Linux-plattformer (Centos 7). MERK: Programvaren og instruksjonene for installasjon finner du på https://github.com/nih-nei/REShAPE.</li>
	<li>Åpne programvaren (figur 1).</li>
	<li>I kategorien Kataloger velger du inngangs- og utdatamappene. I inndatakatalogen velger du mappen som inneholder bildene. I utdatakatalogen, la programvaren automatisk endre banen til "input directory / Processed". Alternativt kan du endre utdatakatalogen manuelt. MERK: Programvaren vil iterere gjennom alle bildene i inndatamappen.</li>
	<li>I kategorien Alternativer for NN-segmentering velger du følgende innstillinger for bildesegmentering:<ol><li>Batchstørrelse: Skriv inn en verdi på 20 i tekstboksen som et godt utgangspunkt, men senk den hvis systemet går tom for grafikkbehandlingsenheter (GPUer). MERK: Det opprinnelige bildet er delt inn i mindre fliser for behandling. Batchstørrelsen angir hvor mange fliser som kan behandles samtidig.</li>
		<li>Bruk GPU?: Hvis systemet ikke har nok GPU-ressurser, merker du av i boksen Nei.</li>
		<li>Intern skala: Bruk rullegardinmenyen til å endre den interne skaleringen fra Ingen i tilfeller der bildene ikke ble anskaffet med et 10x eller 20x mål. Du kan for eksempel nedskalere 40x bilder til halvparten av størrelsen ved hjelp av 1/2-knappen . Reskaleringsalternativene som er tilgjengelige i rullegardinmenyen er som følger: 5x, 2x, Ingen, 1/2, 1/5. MERK: Maskinlæringen ble trent med 10x og 20x bilder. Det kan hende at den ikke gjenkjenner cellekantlinjer fra bilder tatt med andre forstørrelser. I dette tilfellet vil binære bilder vises helt svarte.</li>
		<li>Artifact Filter: Bruk artefaktfilterfanen for å fjerne svært lyse partikler (rusk eller små deler av netthinnen eller bindevevet rundt optisk nerve) som kan være tilstede i bildet og kan forstyrre cellegrensesegmentering. Ingen filtre brukes som standard. De kunstige filteralternativene i rullegardinmenyen er som følger: Vanlig, sterk og svak.</li>
	</ol></li>
	<li>I kategorien Tiled Image Option setter du inn en verdi i tekstboksen for å angi hvor mye overlapping mellom bildeflisene ved å justere parameteren Pad Tiles etter . En overlapping på 100 piksler fungerer vanligvis bra.</li>
	<li>I kategorien Alternativer for utskrift justerer du innstillingene for varmekartgenerering:<ol><li>Reconstruct Tiled Images?: Hvis systemet ikke har nok ressurser til analyse av store bilder, merk av i boksen Nei for å la programvaren fullføre analysen ved å lagre individuelle fliser uten å rekonstruere hele bildet.</li>
		<li>Lag fargebilder: For å generere varmekart, velg Alle fra rullegardinmenyen.</li>
		<li>For Fargelegging, velg en av de forskjellige fargepalettene som er tilgjengelige i rullegardinmenyen: Termisk, Grønn, Mpl-magma, Fase, Brann, Jet, Cyan Hot.</li>
		<li>For Bildeformat lagrer du bildene som TIF eller PNG ved å velge ett av alternativene i fanen.</li>
		<li>Når det gjelder funksjonen Bruk manuelle grenser, merker du av i boksen Nei for å la programvaren bruke minimums- og maksimumsverdiene som er oppdaget i hvert bilde. Merk av i boksen Ja for å justere verdiområdet manuelt for hvert metrisk varmekart, og klikk på Angi grenser-knappen for å velge områder for de enkelte parameterne ved å sette inn verdier i tekstboksene. Etter å ha endret verdiene av interesse, klikk på Lagre. Klikk på Last inn standardinnstillinger for å tilbakestille alle grensene. MERK: Bruk manuelle grenser hvis varmekart fra flere bilder må sammenlignes, for eksempel når du sammenligner effekten av forskjellige forbindelser på celleform. På denne måten brukes det samme verdiområdet. Settet med verdier som skal angis manuelt, varierer avhengig av utvalgstypen. Det anbefales å kjøre noen iterasjoner for å velge det optimale området.</li>
	</ol></li>
	<li>I kategorien Begrensninger for cellestørrelse for analyse velger du en terskel for cellestørrelse for analysen:<ol><li>I Lavere cellestørrelse setter du inn i tekstboksen størrelsen på den minste cellen som skal inkluderes i analysen.</li>
		<li>I Øvre cellestørrelse setter du inn i tekstboksen størrelsen på den største cellen som skal inkluderes i analysen. MERK: Enheten for cellestørrelse endres fra piksler til mikrometer i kvadrat, avhengig av alternativet som er valgt i kategorien Automatisert enhetskonvertering .</li>
	</ol></li>
	<li>I kategorien Automatisert enhetskonvertering velger du ønsket enhet for analysen:<ol><li>I Konverter bildepunkter til reelle enheter?merker du av for Nei for å kjøre analysen i pikselenheter. Merk av i Ja-boksen for å kjøre analysen i mikrometer.</li>
		<li>I Lengde på skalalinje (piksler) skriver du inn bildepunktverdien i tekstboksen.</li>
		<li>I Lengde på skalalinje (Microns) skriver du inn den tilsvarende avstanden i mikrometer i tekstboksen.</li>
	</ol></li>
	<li>For å starte analysen, trykk Gå for det. MERK: Programvaren kan også måle cellens levedyktighet når cellene er farget med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) og propidiumjodid (CZI-alternativfanen ), men dette gjelder ikke RPE-flatmonteringer.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig01.jpg"> Figur 1: REShAPE grafisk brukergrensesnitt. GUI har forskjellige faner for å velge arbeidskatalogene (kategorien Kataloger ), endre segmenteringsalternativene (kategoriene Alternativer for NN-segmentering og Alternativer for flislagt bilde ), angi parametrene for analyse (kategoriene Cellestørrelsesbegrensninger for analyse og Automatisert enhetskonvertering ) og for generering av varmekart (kategorien Alternativer for utgangsgrafikk ). Forkortelse: GUI = grafisk brukergrensesnitt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<ol>
	<li>Endo, E. G., Yao, X. Y., Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pigment+adherence+as+a+measure+of+retinal+adhesion:+Dependence+on+temperature.">Pigment adherence as a measure of retinal adhesion: Dependence on temperature.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (9), 1390-1396 (1988).</li><li>Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+detachment+from+hyperosmotic+intravitreal+injection.">Retinal detachment from hyperosmotic intravitreal injection.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 18 (12), 1237-1244 (1979).</li><li>Marmor, M. F., Martin, L. J., Tharpe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotically+induced+retinal+detachment+in+the+rabbit+and+primate.+Electron+microscopy+of+the+pigment+epithelium.">Osmotically induced retinal detachment in the rabbit and primate. Electron microscopy of the pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 19 (9), 1016-1029 (1980).</li><li>Ban, Y., Rizzolo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+model+of+development+reveals+multiple+properties+of+RPE+tight+junctions.">A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions.</a> Molecular Vision. 3, 18 (1997).</li><li>Ortolan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-resolution+map+of+human+retinal+pigment+epithelium+helps+discover+subpopulations+with+differential+disease+sensitivity.">Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (19), 2117553119 (2022).</li><li>Schaub, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+learning+predicts+function+of+live+retinal+pigment+epithelium+from+quantitative+microscopy.">Deep learning predicts function of live retinal pigment epithelium from quantitative microscopy.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 1010-1023 (2020).</li><li>Beatty, S., Koh, H. -. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration.">The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).</li><li>Liu, Z., Kocaoglu, O. P., Miller, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+retinal+pigment+epithelial+cells+in+the+living+human+retina.">3D imaging of retinal pigment epithelial cells in the living human retina.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (9), 533-543 (2016).</li><li>Bhatia, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RPE+morphometry+in+human+eyes.">Analysis of RPE morphometry in human eyes.</a> Molecular Vision. 22, 898-916 (2016).</li><li>vonder Emde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+cell+shape+descriptors+for+the+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration:+A+comparison+to+unaffected+eyes.">Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes.</a> Translational Vision Science &amp; Technology. 11 (8), 19 (2022).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Den konsekvente og effektive separasjonen av menneskelig RPE og netthinner kan oppnås ved hjelp av denne protokollen. Denne metoden gjør det mulig å studere regionale forskjeller i RPE-form over hele menneskelige netthinner5. Et avgjørende skritt i protokollen er den fysiske separasjonen av RPE og netthinnen. Hvis de to vevene ikke er helt løsrevet i enkelte områder, bør man forsiktig løfte netthinnen, slik at man ikke bryter vevet. REShAPE-analysen av store flatmounts kan kreve bruk av systemer med betydelige RAM-ressurser. I dette tilfellet kan remontering av hele bildet deaktiveres slik at programvaren kan fullføre analysen til tross for mangel på behandlingsressurser.
Hovedbegrensningen ved å bruke REShAPE til å segmentere menneskelige RPE-flatmounts er at AI-algoritmen for det meste ble trent på bilder av indusert pluripotent stamcelleavledet RPE. Som en konsekvens er segmenteringen av menneskelige RPE-flatmounts mindre nøyaktig. RPE-celler fra eldre givere inneholder en stor mengde lipofuscin7, og det brede spekteret av autofluorescens forstyrrer cellegrensesegmentering. I fremtiden vil flere bilder av RPE-flatmounts bli brukt til å forbedre cellegrensesegmentering i denne typen prøve. Til tross for denne begrensningen ble REShAPE spesielt opplært til å gjenkjenne og segmentere RPE-cellegrenser og presterer bedre enn andre eksisterende metoder, for eksempel Voronoi8 og CellProfiler9-segmentering av RPE-celler.
Sammenlignet med manuell segmentering 10 gir REShAPE dessuten fordelen av å analysere store bilder raskt (~130 000 piksler x130 000 piksler ble testet). Avslutningsvis er denne disseksjonsmetoden svært reproduserbar og kan lett utvides til andre dyremodeller. I tillegg kan programvaren brukes til å studere RPE-form i øyeflatmonterte eller i cellekulturmodeller for å undersøke effekten av visse behandlinger. Endelig gjør REShAPEs allsidighet det bredt anvendelig for analyse av andre typer epitelceller.

Retinalpigmentepitelet (RPE) og nevrale retina er sterkt sammenkoblet med hverandre på grunn av den sterke fysiologiske avhengigheten av fotoreceptorene på RPE. Under disseksjon forårsaker den mekaniske separasjonen av nevrale retina fra RPE rive av RPE-cellene, med de apikale delene av RPE igjen festet til de ytre segmentene av retinale fotoreceptorer. Omfanget av RPE-retinal adhesjon er så stor at mengden pigment som er igjen på netthinnen etter separasjon, brukes til å kvantifisere styrken av retinal adhesjon1. Spesielt bryter RPE tette kryss og aktinstrukturen som forbinder dem, som er plassert på den apikale siden, av under mekanisk separasjon. Derfor vil farging av RPE-flatmontering for cellekantlinjer resultere i et ujevnt monolag der mange celler mangler kantlinjer. Denne effekten forverres når vevet er festet med paraformaldehyd (PFA) før disseksjon, da proteinene blir tverrbundet.
Studier på intravitreal legemiddellevering har vist at injeksjoner av hyperosmotiske løsninger i bakre kammer induserer retinal detachment 2,3. I disse forsøkene ble 50 μL forskjellige løsninger, alt fra 1,000 mOsm til 2,400 mOsm, injisert i midten av glasslegemet forårsaket retinal detachment i løpet av få minutter. Spesielt, selv etter lange eksponeringer for løsninger med høy osmolaritet, virket RPE-tette kryss intakte i transmisjonselektronmikroskopiske bilder av både kanin- og apeøyne3. Etter en lignende strategi injiserte vi i midten av glasslegemet en hyperosmotisk løsning av D-mannitol for å indusere en effektiv retinal detachment før du utfører RPE-disseksjon. Siden D-mannitol ikke transporteres av RPE4, opprettholdes en høy intravitreal konsentrasjon, noe som genererer en osmotisk gradient. Den effektive separasjonen av RPE og netthinnen over hele det bakre kammeret garanterer bevaring av RPE-cellekryssene og muliggjør studier av RPE-morfometri på hele flatfjellet. I tillegg utviklet vi en kunstig intelligens (AI)-basert programvare som gjenkjenner og segmenterer fluorescerende merkede RPE-cellegrenser, kvantifiserer 30 forskjellige formberegninger og produserer varmekart over hver beregning for visualisering 5,6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.5 mm&#160;</td>
			<td>Acuderm Inc.</td>
			<td>P1525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>160069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness&#160;</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>5075-1.5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved spatula</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K3-6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14558-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluormount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 21 G x 1-1/2&#34; hypodermic</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 27 G x 1-1/4&#34; hypodermic</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>PAL (Personna)</td>
			<td>62-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom tubes 50 mL</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>9SIA4SR9M88854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Vitrectomy System</td>
			<td>BD Visitrec</td>
			<td>585100</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlack</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23007</td>
			<td>autofluorescence quencher&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>20605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 3 mm cutting edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and consistent generation of retinal pigment epithelium/choroid flatmounts from human eyes for histological analysis

Retinalpigmentepitelet (RPE) og netthinnen er funksjonelt og strukturelt forbundet vev som jobber sammen for å regulere lysoppfattelse og syn. Proteiner på RPE-apikaloverflaten er tett forbundet med proteiner på fotoreseptorens ytre segmentoverflate, noe som gjør det vanskelig å konsekvent skille RPE fra fotoreceptorene / netthinnen. Vi utviklet en metode for effektivt å skille netthinnen fra RPE i menneskelige øyne for å generere komplette RPE / choroid og retina flatmounts for separat cellulær analyse av fotoreceptorer og RPE-celler. En intravitreal injeksjon av en høy-osmolaritet løsning av D-mannitol, et sukker som ikke transporteres av RPE, induserte separasjonen av RPE og netthinnen over hele bakre kammer uten å forårsake skade på RPE-cellekryssene. Ingen RPE-patcher ble observert festet til netthinnen. Phalloidin-merking av aktin viste bevaring av RPE-form og tillot morfometrisk analyse av hele epitelet. En kunstig intelligens (AI)-basert programvare ble utviklet for å nøyaktig gjenkjenne og segmentere RPE-cellegrensene og kvantifisere 30 forskjellige formberegninger. Denne disseksjonsmetoden er svært reproduserbar og kan enkelt utvides til andre dyremodeller.

Denne protokollen resulterer i et enkeltplanbilde av en flatmontering, der celleplasseringen og 30-formberegningene måles for hver korrekt identifisert RPE-celle (figur 2). En mappe som heter "Behandlet" genereres automatisk i inndatakatalogen. Denne mappen inneholder fire underkataloger, kalt "Analyse", "Fargekodet", "Kombinerte filer" og "Segmenterte bilder", og noen midlertidige filer som ble generert under analysen. Mappen "Kombinerte filer" inneholder et regneark med alle formmålene og et regneark med frekvensene til cellenaboen teller av alle filene kombinert. "Analyse" -mappen inneholder et regneark med alle formmålene og et regneark med frekvensene til cellenaboen teller for hvert bilde separat. Katalogen "Segmenterte bilder" inneholder de endelige binære maskene til RPE-cellegrensene; Den kan brukes til å evaluere kvaliteten på segmenteringen. Katalogen "Fargekodet" inneholder varmekart for hver formmåling for å visualisere formmønstrene i hvert bilde. Formdefinisjonene og forkortelsene finnes i tabell 1.
Noen ganger kan RPE flatmounts inneholde resterende biter av netthinnen som ikke ble rent fjernet, spesielt rundt optisk nerve. Phalloidinfarging av prøven resulterer i et sterkt signal som kommer fra netthinnen, og dette kan forårsake problemer for RPE-cellegrensesegmentering. Noen fliser vil se helt svarte ut, mens de omkringliggende flisene vil vise normal segmentering. Andre lyse objekter som kan være til stede i bildet, vil også føre til generering av svarte fliser (figur 3). I disse tilfellene vil det å velge et av filtreringsalternativene (Svak, Vanlig, Sterk) som er tilgjengelig i rullegardinmenyen Arti Filter , forhindre dannelsen av svarte fliser.
REShAPE tar 8-biters eller 16-biters gråtonebilder som inndata, men ikke RGB-bilder. Bruk av RGB-bilder for REShAPE-analysen vil produsere helt svarte binære bilder. Hvis dette skjer, vil konvertering av RGB-bilder til gråtoner produsere riktig segmenterte binære bilder (figur 4). Ved noen anledninger der RPE-grensene ikke gjenkjennes riktig, for eksempel hvis fargingen ikke er optimal eller hvis prøven er skadet av en ripe (figur 5A), kan store klumper av celler identifiseres som en enkelt veldig stor celle (figur 5B). I dette tilfellet kan store objekter utelukkes fra analysen ved å redusere terskelen for cellestørrelse (figur 5C). Dette kan oppnås ved å sette inn en lavere verdi i tekstboksen Øvre cellestørrelse . Dette vil imidlertid resultere i en endring i varmekartets rekkevidde. Hvis en forsker velger å gjøre det, er det også mulig å opprettholde det opprinnelige varmekartområdet (figur 5D) ved å merke av i boksen Ja i funksjonen Bruk manuelle grenser. Deretter må forskeren venstreklikke på Set Limits-knappen og sette inn de ønskede verdiene i tekstboksene for å spesifisere de manuelle grensene.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig02.jpg"> Figur 2: Komplett morfometrisk analyse av et helt humant RPE-monolag. (A) En lav forstørrelse visning av en hel menneskelig RPE / choroid flatmount (magenta: phalloidin). (B) En zoomet inn visning av phalloidin-farget RPE-celler. (C) REShAPE-generert segmentering av RPE-cellegrensene for en hel menneskelig RPE / choroid flatmount og (D) den tilsvarende zoomede visningen. (E) Et programvaregenerert varmekart som illustrerer celleområdet til de enkelte RPE-cellene i hele menneskets flatmontering. Den termiske skalaen øverst til venstre viser verdiområdet som brukes. (F) Den tilsvarende innzoomede visningen som viser individuelle RPE-celler farget av område. Skalastenger = (B,D,F) 50 μm, (A,C,E) 5 mm. Forkortelse: RPE = retinal pigmentepitel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig03.jpg"> Figur 3: Filtrering av lyse artefakter. (A) En menneskelig RPE flatmontert farget for cellegrenser (magenta: phalloidin) kan presentere lyse områder (grønne rektangler) som forstyrrer segmentering. (B) RPE-cellegrensesegmenteringen av hele flatfjellet inneholder tre helt svarte fliser (grønne piler) som tilsvarer lyse områder med fluorescens. (C,E) To av de svarte flisene tilsvarer områder som inneholder lyse prikker, som muligens er noe rusk. (D) En av de svarte flisene ble generert av et stykke nevral retina rundt optisk nerve som ikke ble fjernet riktig. Bitene av nevral retina er betydelig lysere enn RPE-laget og hindrer cellesegmentering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig04.jpg"> Figur 4: Nødvendig for inndatabilde. RPE-cellene som er farget for cellekantlinjer, ble lagret som (A) RGB eller som (B) 16-biters gråtonebilder for REShAPE-analyse. (C) Resultatet av RBG-bildeanalysen er et svart binært bilde, (D) mens analysen av gråtonebildet produserer en riktig segmentert binær av cellegrensene. REShAPE kan bare analysere 8-biters eller 16-biters gråtonebilder. Skala barer = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig05v2.jpg"> Figur 5: Suboptimale resultater. (A) Et bilde av en del av RPE-monolaget der cellene farget med phalloidin ved et uhell ble riper. (B) Et varmekart over RPE-celler farget av dimensjonen til celleområdet. En stor øvre cellestørrelsesterskel inkluderer store objekter i analysen. (C) Et varmekart for celleområdet der en mindre øvre cellestørrelsesterskel ble valgt for å ekskludere store objekter fra analysen. (D) Et varmekart for celleområde der en mindre øvre cellestørrelsesterskel ble valgt og manuelle grenser ble satt for å opprettholde varmekartområdet som opprinnelig ble brukt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig05largev2.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 1: REShAPE-parametere. Tabellen rapporterer definisjonen av hver parameter og forkortelsene som brukes i råregnearkene ("_Data.csv" -filene) og for varmekartene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761_Table-1.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis at JoVE.com

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Vi beskriver en metode for effektivt å skille retinalt pigmentepitel (RPE) fra netthinnen i menneskelige øyne og generere hele RPE / choroid flatmounts for histologiske og morfometriske analyser av RPE.

Effektiv og konsistent generering av retinal pigmentepitel / choroid flatmounts fra Human Eyes for histologisk analyse

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Denne metoden bidrar til å forstå fenotypiske forskjeller av RP-celler over hele menneskets netthinne. Disseksjonsteknikken som Davide Ortolan har utviklet, er svært reproduserbar når det gjelder å generere en løsrivelse mellom RP og netthinnen. Og REShAPE-programvaren er virkelig merkbar når det gjelder å analysere store bilder av RP-flatmonteringer.Metoden som Davide har utviklet kan brukes til å studere regionale forskjeller i RP-fenotypen fra pasienter med forskjellige typer retinale degenerative sykdommer. For å begynne, kutt 50 milliliter konisk rør litt under 5 milliliter merket. Bruk varmt lim til å feste rørspissen til bunnen av veiebåten.Bland deretter de to komponentene i silikonelastomersettet i et 10-til-1-forhold, og unngå å fange luft. Hell blandingen i veiebåten som inneholder dette sfæriske stykket av det runde bunnrøret. Herd silikonet ved romtemperatur over natten.Fjern veiebåten og det runde bunnrøret fra den spekede silikonformen. Fyll først en 1 milliliter sprøyte med 1700 millimol D-Mannitol-oppløsning og fest den til en 21-gauge nål. Sett nålen gjennom pars plana for å unngå punktering av øyets fremre kammer og injiser 400 mikroliter av løsningen i glasslegemet.La øyet stå i romtemperatur i 45 minutter. Bruk et par fine saks og tang, klipp opp det fremre kammeret på nivået av pars plana. Fyll det bakre øyekammeret med DPBS som inneholder kalsium og magnesium.Under stereomikroskopet lokaliserer du makulaen visualisert som en gul flekk på netthinnen. Klipp øyet i kvadranter, nemlig nasal, temporal, overlegen og dårligere, samtidig som du sørger for å bevare makulærområdet. Fjern nålene hvis de er i veien.Overfør sommerfuglen til øyets bakre kammer til en 100 millimeter petriskål som inneholder DPBS med kalsium og magnesium. Før du fjerner netthinnen, merk kronbladet som inneholder makulaen ved å lage et V-formet kutt i ciliary marginen. Løft og kutt alt glasslegemet som ligger på netthinnen.Klipp netthinnen fra ciliary marginene i alle kronbladene og sørg for ikke å skrape RPE. Plasser vevet i 4% PFA og inkuber i en time. Vask tre ganger med DPBS som inneholder kalsium og magnesium.Overfør vevet til en beholder fylt med samme buffer og oppbevar den ved 4 grader Celsius. Overfør deretter prøven til en 100 millimeter petriskål som inneholder DPBS med kalsium og magnesium. Slå ut optisk nervehode med et 1, 5 millimeter biopsislag.Samle netthinnen og lagre den i samme buffer ved 4 grader Celsius. For å fjerne sclera fra RPE choroid, løft forsiktig RPE choroid-laget fra periferien. Deretter med et par Vannas Spring Scissors, kutt choroidal fartøy og bindevev som er mellom sclera og RPE.Etter fullstendig separasjon fra sclera, samle RPE choroid-laget. Overfør vevet til en beholder fylt med DPBS som inneholder kalsium og magnesium, og oppbevar det ved 4 grader Celsius. Overfør RPE-årehinnen til en brønn på en seks-brønns plate.Blokker og permeabiliser prøven i en time ved romtemperatur. Inkuber prøven i en time ved romtemperatur med phalloidin konjugert med 647 fluorofor ved en 1 til 250 fortynning i permeabiliseringsbufferen. Vask tre ganger i DPBS som inneholder kalsium og magnesium.Overfør RPE choroid-prøven til et 50 x 75 millimeter glassglass og flat det ut. Skjær hvert kronblad i to for å gjøre prøven flatere. Tegn en kontur av det flate festet med en hydrofob penn.For å slukke lipofuscin autofluorescens, tilsett 500 mikroliter av autofluorescensoppløsningen, og inkuber ved romtemperatur i to minutter. Vask grundig i DPBS som inneholder kalsium og magnesium. Fjern DPBS og legg til monteringsmediet.Plasser et dekselglass på det flate festet og forsegl med neglelakk. Åpne programvaren. I katalogfanen velger du inngangs- og utdatamappene.I utdatakatalogen, la programvaren automatisk endre banen til inngangskatalogen eller prosessen. Alternativt kan du endre utdatakatalogen manuelt. Hvis du vil generere varmekart, velger du alt fra rullegardinmenyen i fanen Opprett fargebilder.Merk av i boksen nei i funksjonen bruk manuelle grenser for å la programvaren bruke minimums- og maksimumsverdiene som er oppdaget i hvert bilde. Merk av i boksen ja for å justere verdiområdet for hver form metrisk varmekart manuelt. Klikk deretter på angi grenser-knappen og sett inn verdier i tekstboksene for å velge områder for de enkelte parametrene.Etter å ha endret verdiene av interesse, klikk på lagre. Klikk på lave standarder for å tilbakestille alle grensene. Hvis du vil velge en terskel for cellestørrelse i lavere cellestørrelse, setter du inn størrelsen på den minste cellen som skal inkluderes i analysen.I øvre cellestørrelse setter du inn størrelsen på den største cellen som skal inkluderes. I konverter piksler til reelle enheter, sjekk nei for å kjøre analysen i pikselenheter, merk av ja for å kjøre analysen i mikrometer. I lengden på bildepunkter på skalalinjen skriver du inn pikselverdien i tekstboksen.I lengden på skala bar mikron, skriv inn den tilsvarende avstanden i mikrometer. For å starte analysen, trykk gå for det. Denne protokollen resulterer i et enkeltplanbilde av en flat montering der celleplasseringen identifiseres av REShAPE-generert segmentering av RPE-cellegrensene.I tillegg måles 30 formberegninger, inkludert celleområdet til de enkelte RPE-cellene, for hver korrekt identifiserte RPE-celle. Svarte fliser som er et resultat av gjenværende deler av netthinnen eller andre lyse gjenstander, kan fjernes ved å velge et av filtreringsalternativene som er tilgjengelige i rullegardinmenyen RT-filter. Bruk av RBG-bilder for omformingsanalysen vil produsere helt svarte binære bilder.Hvis dette skjer, vil konvertering av RGB-bilder til grå skala produsere riktig segmenterte binære bilder. Hvis fargingen ikke er optimal, eller hvis prøven er skadet av en ripe, kan store klumper av celler identifiseres som en enkelt veldig stor celle. I dette tilfellet kan store objekter utelukkes fra analysen ved å endre terskelen for cellestørrelse.For å få et flatt vev, må RP og choroid skilles fra sclera selv om disse trinnene kan ta lang tid. Etter genereringen av RP flat mount, er det mulig å beise for flere RPE-markører slik at du kan studere forskjellige regioner i RP-monolaget. Ved hjelp av denne metoden har vi oppdaget fem forskjellige RP-populasjoner som er differensielt følsomme for forskjellige retinale degenerative sykdommer.

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Rask og effektiv produksjon av nerveceller fra menneskelige pluripotente stamceller i en Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Rask og effektiv Sebrafisk Genotyping Bruke PCR med høy oppløsning Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effektiv produksjon og rensing av rekombinant mus Kindlin-3 fra insektceller for biofysiske studier

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelig indusert pluripotent stamceller fra menneskelige somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MikroRNA uttrykk profiler av menneskelige iPS celler, retinal pigment epitelet avledet fra iPS, og Fetal Netthinne Pigment Epitel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinal transplantasjon av menneskelige embryonale stamcelleforskningen avledet retinal Pigment epitelceller i store øyne modell av geografiske Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primært cellekulturer fra musen netthinnens Pigment epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Effektiv disseksjon og kultur av primære mus retinal pigment epitelceller

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Generering av humane nyre tubuoider fra vev og urin

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primær kultur av svin retinal pigment epitelceller

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...