Name: efficient and consistent generation of retinal pigment epithelium/choroid flatmounts from human eyes for histological analysis
Uploaded: 2022-10-28T15:00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis at JoVE.com

Мы благодарим гистологическое ядро Национального института глаз (NEI) за использование Zeiss Axio Scan.Z1. Мы также благодарим доноров, их семьи, сеть Advancing Sight Network и Институт Львиного Глаза за их щедрость. Эта работа была поддержана фондами NEI IRP (номер гранта ZIA EY000533-04).

<ol>
	<li>Endo, E. G., Yao, X. Y., Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pigment+adherence+as+a+measure+of+retinal+adhesion:+Dependence+on+temperature.">Pigment adherence as a measure of retinal adhesion: Dependence on temperature.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (9), 1390-1396 (1988).</li><li>Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+detachment+from+hyperosmotic+intravitreal+injection.">Retinal detachment from hyperosmotic intravitreal injection.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 18 (12), 1237-1244 (1979).</li><li>Marmor, M. F., Martin, L. J., Tharpe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotically+induced+retinal+detachment+in+the+rabbit+and+primate.+Electron+microscopy+of+the+pigment+epithelium.">Osmotically induced retinal detachment in the rabbit and primate. Electron microscopy of the pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 19 (9), 1016-1029 (1980).</li><li>Ban, Y., Rizzolo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+model+of+development+reveals+multiple+properties+of+RPE+tight+junctions.">A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions.</a> Molecular Vision. 3, 18 (1997).</li><li>Ortolan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-resolution+map+of+human+retinal+pigment+epithelium+helps+discover+subpopulations+with+differential+disease+sensitivity.">Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (19), 2117553119 (2022).</li><li>Schaub, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+learning+predicts+function+of+live+retinal+pigment+epithelium+from+quantitative+microscopy.">Deep learning predicts function of live retinal pigment epithelium from quantitative microscopy.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 1010-1023 (2020).</li><li>Beatty, S., Koh, H. -. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration.">The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).</li><li>Liu, Z., Kocaoglu, O. P., Miller, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+retinal+pigment+epithelial+cells+in+the+living+human+retina.">3D imaging of retinal pigment epithelial cells in the living human retina.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (9), 533-543 (2016).</li><li>Bhatia, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RPE+morphometry+in+human+eyes.">Analysis of RPE morphometry in human eyes.</a> Molecular Vision. 22, 898-916 (2016).</li><li>vonder Emde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+cell+shape+descriptors+for+the+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration:+A+comparison+to+unaffected+eyes.">Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes.</a> Translational Vision Science &amp; Technology. 11 (8), 19 (2022).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Последовательное и эффективное разделение RPE человека и сетчатки может быть достигнуто с помощью этого протокола. Этот метод позволяет изучать региональные различия в форме RPE по всей сетчатке человека5. Решающим шагом в протоколе является физическое разделение RPE и сетчатки. Если две ткани не полностью отделились в некоторых областях, следует осторожно приподнять сетчатку, следя за тем, чтобы не сломать ткани. Анализ REShAPE больших плоских креплений может потребовать использования систем со значительными ресурсами оперативной памяти. В этом случае повторная сборка всего изображения может быть отключена, чтобы позволить программному обеспечению успешно завершить анализ, несмотря на нехватку ресурсов обработки.
Основным ограничением использования REShAPE для сегментации плоских маунтов RPE человека является то, что алгоритм ИИ был в основном обучен на изображениях индуцированного плюрипотентного RPE, полученного из стволовых клеток. Как следствие, сегментация плоских маунтов RPE человека менее точна. Клетки RPE от пожилых доноров содержат большое количество липофусцина7, а широкий спектр его аутофуоресценции препятствует сегментации границ клеток. В будущем для улучшения сегментации границ ячеек в этом виде будет использоваться больше изображений плоских маунтов RPE. Несмотря на это ограничение, REShAPE был специально обучен распознавать и сегментировать границы клеток RPE и работает лучше, чем другие существующие методы, такие как сегментация клеток RPE Voronoi8 и CellProfiler9 .
Более того, по сравнению с ручной сегментацией10, REShAPE обеспечивает преимущество быстрого анализа больших изображений (было протестировано ~ 130 000 пикселей x 130 000 пикселей). В заключение, этот метод рассечения является высоковоспроизводимым и может быть легко распространен на другие модели животных. Кроме того, программное обеспечение может быть использовано для изучения формы RPE в плоских горах глаз или в моделях клеточных культур для изучения эффекта определенных методов лечения. Наконец, универсальность REShAPE делает его широко применимым для анализа других типов эпителиальных клеток.

Пигментный эпителий сетчатки (RPE) и нервная сетчатка тесно взаимосвязаны друг с другом из-за сильной физиологической зависимости фоторецепторов от RPE. Во время рассечения механическое отделение нервной сетчатки от RPE вызывает разрыв клеток RPE, при этом апикальные части RPE остаются прикрепленными к внешним сегментам фоторецепторов сетчатки. Степень адгезии RPE-сетчатки настолько велика, что количество пигмента, оставшегося на сетчатке после разделения, используется для количественной оценки силы адгезии сетчатки1. В частности, плотные соединения RPE и соединяющая их актиновая структура, которые расположены на апикальной стороне, разрываются при механическом разделении. Таким образом, окрашивание плоских креплений RPE для границ ячеек приводит к образованию пятнистого монослоя, в котором многие ячейки имеют отсутствующие границы. Этот эффект усугубляется, когда ткань фиксируется параформальдегидом (PFA) перед рассечением, поскольку белки становятся сшитыми.
Исследования по интравитреальной доставке препарата показали, что инъекции гиперосмотических растворов в заднюю камеру индуцируют отслоение сетчатки 2,3. В этих экспериментах 50 мкл различных растворов, в диапазоне от 1000 мОсм до 2 400 мОсм, введенных в середину стекловидного тела, вызывали отслоение сетчатки в течение нескольких минут. Примечательно, что даже после длительного воздействия высокоосмолярных растворов плотные соединения RPE оказались нетронутыми на просвечивающих электронных микроскопических изображениях глаз кролика иобезьяны 3. Следуя аналогичной стратегии, мы ввели в середину стекловидного тела гиперосмотический раствор D-маннитола, чтобы вызвать эффективное отслоение сетчатки перед выполнением рассечения RPE. Поскольку D-маннит не транспортируется RPE4, поддерживается высокая интравитреальная концентрация, генерирующая осмотический градиент. Эффективное разделение RPE и сетчатки по всей задней камере гарантирует сохранение клеточных соединений RPE и позволяет изучать морфометрию RPE на всей плоской горе. Кроме того, мы разработали программное обеспечение на основе искусственного интеллекта (ИИ), которое распознает и сегментирует флуоресцентно помеченные границы ячеек RPE, количественно оценивает 30 различных показателей формы и создает тепловые карты каждой метрики для визуализации 5,6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.5 mm&#160;</td>
			<td>Acuderm Inc.</td>
			<td>P1525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>160069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness&#160;</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>5075-1.5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved spatula</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K3-6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14558-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluormount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 21 G x 1-1/2&#34; hypodermic</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 27 G x 1-1/4&#34; hypodermic</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>PAL (Personna)</td>
			<td>62-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom tubes 50 mL</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>9SIA4SR9M88854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Vitrectomy System</td>
			<td>BD Visitrec</td>
			<td>585100</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlack</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23007</td>
			<td>autofluorescence quencher&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>20605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 3 mm cutting edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and consistent generation of retinal pigment epithelium/choroid flatmounts from human eyes for histological analysis

Пигментный эпителий сетчатки (RPE) и сетчатка являются функционально и структурно связанными тканями, которые работают вместе, чтобы регулировать восприятие света и зрение. Белки на апикальной поверхности RPE тесно связаны с белками на поверхности наружного сегмента фоторецептора, что затрудняет последовательное отделение RPE от фоторецепторов / сетчатки. Мы разработали метод эффективного отделения сетчатки от RPE человеческих глаз для генерации полных RPE / сосудистой оболочки и плоской сетчатки для раздельного клеточного анализа фоторецепторов и клеток RPE. Интравитреальная инъекция высокоосмолярного раствора D-маннита, сахара, не транспортируемого RPE, индуцировала разделение RPE и сетчатки по всей задней камере, не вызывая повреждения клеточных соединений RPE. Никаких пятен RPE, прикрепленных к сетчатке, не наблюдалось. Фаллоидиновая маркировка актина показала сохранение формы RPE и позволила провести морфометрический анализ всего эпителия. Программное обеспечение на основе искусственного интеллекта (ИИ) было разработано для точного распознавания и сегментирования границ ячеек RPE и количественной оценки 30 различных показателей формы. Этот метод рассечения является высоковоспроизводимым и может быть легко распространен на другие модели животных.

Этот протокол приводит к одноплоскостному изображению плоского крепления, где местоположение ячейки и 30 показателей формы измеряются для каждой правильно идентифицированной ячейки RPE (рисунок 2). Папка с именем "Processed" автоматически генерируется внутри входного каталога. Эта папка содержит четыре подкаталога с именами «Анализ», «Цветовая кодировка», «Объединенные файлы» и «Сегментированные изображения», а также некоторые временные файлы, созданные во время анализа. Папка «Объединенные файлы» содержит электронную таблицу со всеми измерениями формы и электронную таблицу с частотами количества соседей ячеек всех объединенных файлов. Папка «Анализ» содержит электронную таблицу со всеми измерениями формы и электронную таблицу с частотами подсчета соседей ячеек для каждого изображения отдельно. Каталог "Сегментированные изображения" содержит окончательные двоичные маски границ ячеек RPE; его можно использовать для оценки качества сегментации. Каталог "Color Coded" содержит тепловые карты для каждого измерения фигуры для визуализации узоров фигур на каждом изображении. Определения и сокращения метрик формы можно найти в таблице 1.
Иногда плоские крепления RPE могут содержать остаточные кусочки сетчатки, которые не были удалены чисто, особенно вокруг зрительного нерва. Окрашивание образца фаллоидином приводит к сильному сигналу, поступающему от сетчатки, и это может вызвать проблемы с сегментацией границы клеток RPE. Некоторые плитки будут выглядеть полностью черными, в то время как окружающие плитки будут демонстрировать нормальную сегментацию. Другие яркие объекты, которые могут присутствовать на изображении, также вызовут генерацию черных плиток (рисунок 3). В этих случаях выбор одного из вариантов фильтрации (Слабый, Обычный, Сильный), доступных в раскрывающемся меню Фильтр Арти , предотвратит образование черных плиток.
REShAPE принимает 8-битные или 16-битные изображения в градациях серого в качестве входных данных, но не RGB-изображения. Использование RGB-изображений для анализа REShAPE приведет к созданию полностью черных двоичных изображений. Если это произойдет, преобразование изображений RGB в оттенки серого приведет к правильно сегментированным двоичным изображениям (рисунок 4). В некоторых случаях, когда границы RPE распознаются неправильно, например, если окрашивание не является оптимальным или если образец поврежден царапиной (рисунок 5A), большие скопления клеток могут быть идентифицированы как одна очень большая ячейка (рисунок 5B). В этом случае крупные объекты могут быть исключены из анализа путем уменьшения порога размера ячейки (рисунок 5C). Этого можно достичь, вставив меньшее значение в текстовое поле Верхний размер ячейки . Однако это приведет к изменению диапазона тепловой карты. Если исследователь решит сделать это, можно также сохранить исходный диапазон тепловой карты (рисунок 5D), установив флажок Да в функции Use Manual Limits? . Впоследствии исследователь должен щелкнуть левой кнопкой мыши кнопку «Установить пределы» и вставить нужные значения в текстовые поля, чтобы указать ручные ограничения.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig02.jpg"> Рисунок 2: Полный морфометрический анализ всего монослоя RPE человека. (A) Вид с низким увеличением всего человеческого RPE / сосудистой оболочки плоской горы (пурпурный: фаллоидин). (B) Увеличенный вид окрашенных фаллоидином клеток RPE. (C) Сгенерированная REShAPE сегментация границ клеток RPE для всего плоского расстояния RPE/сосудистой оболочки человека и (D) соответствующего увеличенного представления. (E) Созданная программным обеспечением тепловая карта, иллюстрирующая площадь отдельных клеток RPE во всей плоской горе человека. Тепловая шкала в левом верхнем углу показывает диапазон используемых значений. (F) Соответствующее увеличенное представление, показывающее отдельные ячейки RPE, окрашенные по площади. Шкала стержней = (B,D,F) 50 мкм, (A,C,E) 5 мм. Аббревиатура: RPE = пигментный эпителий сетчатки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig03.jpg"> Рисунок 3: Фильтрация ярких артефактов. (A) Человеческий RPE, окрашенный для границ клеток (пурпурный: фаллоидин), может представлять яркие области (зеленые прямоугольники), которые мешают сегментации. (B) Сегментация границы ячейки RPE всего плоского крепления содержит три полностью черные плитки (зеленые стрелки), соответствующие ярким областям флуоресценции. (С,Э) Две черные плитки соответствуют областям, содержащим яркие точки, которые, возможно, являются каким-то мусором. (D) Одна из черных плиток была сгенерирована куском нервной сетчатки вокруг зрительного нерва, который не был правильно удален. Кусочки нервной сетчатки значительно ярче слоя RPE и препятствуют сегментации клеток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig04.jpg"> Рисунок 4: Требование входного изображения. Ячейки RPE, окрашенные для границ ячеек, были сохранены в виде (A) RGB или (B) 16-битных изображений в оттенках серого для анализа REShAPE. (C) Результатом анализа изображения RBG является черное двоичное изображение (D), в то время как анализ изображения в оттенках серого создает правильно сегментированный двоичный файл границ ячеек. REShAPE может анализировать только 8-битные или 16-битные изображения в оттенках серого. Шкала = 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig05v2.jpg"> Рисунок 5: Неоптимальные результаты. (A) Изображение части монослоя RPE, где клетки, окрашенные фаллоидином, были случайно поцарапаны. (B) Тепловая карта ячеек RPE, окрашенных размером площади ячейки. Большой верхний порог размера ячейки включает в анализ большие объекты. (C) Тепловая карта площади ячейки, в которой был выбран меньший порог верхнего размера ячейки для исключения крупных объектов из анализа. (D) Тепловая карта площади ячеек, в которой был выбран меньший верхний порог размера ячейки и установлены ручные ограничения для поддержания диапазона тепловой карты, используемого первоначально. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig05largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Таблица 1: Параметры REShAPE. В таблице указано определение каждого параметра и аббревиатуры, используемые в необработанных электронных таблицах (файлы «_Data.csv») и для тепловых карт. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761_Table-1.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis at JoVE.com

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Описан метод эффективного отделения пигментного эпителия сетчатки (RPE) от сетчатки в глазах человека и генерации целых RPE/хориоидных плоских маунтов для гистологического и морфометрического анализа RPE.

Эффективная и последовательная генерация пигментных эпителиев сетчатки / плоских гор сосудистой оболочки из глаз человека для гистологического анализа

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Этот метод помогает понять фенотипические различия RP-клеток по всей сетчатке человека. Техника рассечения, разработанная Давиде Ортоланом, очень воспроизводима в создании отслоения между RP и сетчаткой. И программное обеспечение REShAPE действительно заметно при анализе больших изображений плоских креплений RP.Метод, который разработал Давиде, может быть использован для изучения региональных различий в фенотипе РП у пациентов с различными типами дегенеративных заболеваний сетчатки. Для начала отрежьте 50-миллилитровую коническую трубку чуть ниже отметки в 5 миллилитров. С помощью горячего клея прикрепите наконечник трубки к дну весовой лодки.Затем смешайте два компонента комплекта силиконовых эластомеров в соотношении 10 к 1, избегая захвата воздуха. Налейте смесь в весовую лодку, содержащую этот сферический кусок трубки с круглым дном. Отверните силикон при комнатной температуре на ночь.Снимите весовую лодку и трубку с круглым дном из отвержденной силиконовой формы. Сначала заполните шприц объемом 1 миллилитр 1700 миллимолей раствора D-маннита и прикрепите его к игле 21-го калибра. Вставьте иглу через pars plana, чтобы избежать прокола передней камеры глаза и введите 400 микролитров раствора в стекловидное тело.Оставьте глаз при комнатной температуре на 45 минут. С помощью пары мелких ножниц и щипцов разрежьте переднюю камеру на уровне pars plana. Заполните заднюю камеру глаза DPBS, содержащим кальций и магний.Под стереомикроскопом локализуйте макулу, визуализируемую как желтое пятно на сетчатке. Разрезать глаз на квадранты, а именно носовые, височные, верхние и нижние, обеспечивая при этом сохранение макулярной области. Удалите иглы, если они мешают.Перенесите бабочку в заднюю камеру глаза в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую DPBS с кальцием и магнием. Перед удалением сетчатки отметьте лепесток, содержащий макулу, сделав V-образный разрез в цилиарном крае. Поднимите и срежьте все стекловидное тело, которое лежит на сетчатке.Вырежьте сетчатку от цилиарных краев во всех лепестках, чтобы не поцарапать RPE. Поместите ткань в 4% PFA и инкубируйте в течение одного часа. Трижды промыть DPBS, содержащим кальций и магний.Переложите ткань в контейнер, наполненный таким же буфером, и храните его при 4 градусах Цельсия. Далее переложите образец на 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую DPBS с кальцием и магнием. Выбить головку зрительного нерва 1,5-миллиметровым ударом биопсии.Соберите сетчатку и храните ее в том же буфере при 4 градусах Цельсия. Чтобы удалить склеру из сосудистой оболочки RPE, осторожно поднимите слой сосудистой оболочки RPE с периферии. Затем с помощью пары пружинных ножниц Vannas перережьте сосуды сосудистой оболочки и соединительную ткань, которые находятся между склерой и RPE.После полного отделения от склеры соберите слой сосудистой оболочки RPE. Переложите ткань в контейнер, наполненный DPBS, содержащим кальций и магний, и храните его при 4 градусах Цельсия. Перенесите сосудистую оболочку РПЭ в одну лунку из шестилуночной пластины.Блокируйте и пермеабилизируйте образец в течение одного часа при комнатной температуре. Инкубируют образец в течение одного часа при комнатной температуре с фаллоидином, сопряженным с флуорофором 647 при разведении от 1 до 250 в буфере пермеабилизации. Промыть три раза в DPBS, содержащих кальций и магний.Перенесите образец сосудистой оболочки RPE на стеклянный слайд размером 50 x 75 миллиметров и сгладите его. Разрежьте каждый лепесток на две части, чтобы образец был более плоским. Нарисуйте контур плоского крепления гидрофобной ручкой.Чтобы погасить автофлуоресценцию липофусцина, добавляют 500 микролитров раствора автофлуоресцентного гасителя и инкубируют при комнатной температуре в течение двух минут. Тщательно промыть в DPBS, содержащих кальций и магний. Извлеките DPBS и добавьте монтажный носитель.Поместите покровное стекло на плоское крепление и запечатайте лаком для ногтей. Откройте программное обеспечение. На вкладке Каталоги выберите входные и выходные папки.В выходном каталоге позвольте программному обеспечению автоматически изменить путь к входному каталогу или процессу. Кроме того, можно изменить выходной каталог вручную. Чтобы сгенерировать тепловые карты, выберите все из выпадающего меню на вкладке Создание цветных изображений.Установите флажок нет в функции ограничения использования вручную, чтобы программное обеспечение использовало минимальные и максимальные значения, обнаруженные в каждом изображении. Установите флажок да, чтобы вручную настроить диапазон значений для каждой метрической тепловой карты фигуры. Затем нажмите на кнопку установить ограничения и вставьте значения в текстовые поля, чтобы выбрать диапазоны для отдельных параметров.После изменения интересующих значений нажмите кнопку Сохранить. Нажмите на низкие значения по умолчанию, чтобы сбросить все ограничения. Чтобы выбрать пороговое значение размера ячейки при меньшем размере ячейки, вставьте размер самой маленькой ячейки, которая будет включена в анализ.В поле Верхний размер ячейки вставьте размер самой большой ячейки, которая должна быть включена. При преобразовании пикселей в реальные единицы установите флажок нет, чтобы выполнить анализ в пиксельных единицах, проверьте да, чтобы выполнить анализ в микрометрах. В поле Длина пикселов шкалы введите значение пикселя в текстовом поле.В длину шкалы бар микрон введите соответствующее расстояние в микрометрах. Чтобы начать анализ, нажмите кнопку Go for it. Этот протокол приводит к одноплокостному изображению плоского крепления, где местоположение ячейки идентифицируется с помощью сгенерированной REShAPE сегментации границ ячеек RPE.Кроме того, 30 показателей формы, включая площадь отдельных клеток RPE, измеряются для каждой правильно идентифицированной ячейки RPE. Черные плитки, образовавшиеся в остатках сетчатки или других ярких объектов, можно удалить, выбрав один из вариантов фильтрации, доступных в раскрывающемся меню фильтра RT. Использование изображений RBG для анализа измененной формы приведет к созданию полностью черных двоичных изображений.В этом случае при преобразовании RGB-изображений в оттенки серого будут получены правильно сегментированные двоичные изображения. Если окрашивание не является оптимальным или если образец поврежден царапиной, то большие скопления клеток могут быть идентифицированы как одна очень большая клетка. В этом случае крупные объекты могут быть исключены из анализа путем изменения порога размера ячейки.Чтобы получить плоскую ткань, RP и сосудистую оболочку нужно отделить от склеры, даже если эти шаги могут занять много времени. После генерации плоского крепления RP можно окрашивать дополнительные маркеры RPE, чтобы можно было изучать различные области монослоя RP. Используя этот метод, мы обнаружили пять различных популяций RP, которые дифференциально чувствительны к различным дегенеративным заболеваниям сетчатки.

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Быстрая и эффективная генерация нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных в Multititre Формат плиты

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Быстрое и эффективное данио рерио Генотипирование Использование ПЦР с высоким разрешением расплава анализа

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Эффективное производство и очистка рекомбинантного мышиного Kindlin-3 от клетках насекомых биофизической исследований

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Эффективная генерация человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из человеческих соматических клеток с Сендай-вируса

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Профили микроРНК выражение человеческой плюрипотентных клеток, пигментного эпителия сетчатки, полученных из IPS, и плода пигментного эпителия сетчатки

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Субретинальное трансплантации эмбриональных стволовых клеток человека производные сетчатки пигментного эпителиальных клеток в большой eyed модель географической атрофии

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Культуры главной ячейки от мыши пигментный эпителий сетчатки

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Эффективное рассечение и культура первичной мыши сетчатки Пигмент эпителиальных клеток

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Генерация почечных тубулоидов человека из тканей и мочи

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Первичная культура пигментных эпителиальных клеток свиньи свиней

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...