Name: efficient and consistent generation of retinal pigment epithelium/choroid flatmounts from human eyes for histological analysis
Uploaded: 2022-10-28T15:00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis at JoVE.com

Vi tackar National Eye Institute (NEI) histologikärna för användningen av Zeiss Axio Scan.Z1. Vi tackar också givarna, deras familjer, Advancing Sight Network och Lions Eye Institute för deras generositet. Detta arbete stöddes av NEI IRP-medel (bidragsnummer ZIA EY000533-04).

Cadaver mänskliga jordklot erhölls från Advanced Sight Network (Birmingham, AL). Arbete som utförs på kadavervävnad är av NIH:s institutionella granskningsnämnd undantaget från den forskningsetiska kommittén.
1. Försändelse av ögonglob
<ol><li>Efter enucleation, skicka färska ögonglober i en behållare fylld med iskall DPBS 1x med Ca 2+ och Mg2+. OBS: Det är bättre att dissekera ögat inom 24 timmar efter enucleation. RPE-morfologin ändras inte under detta tidsfönster.</li>
</ol>2. Beredning av silikonform
<ol><li>Skär botten 20 mm av ett 25 mm diameter runt bottenrör. Placera den vid basen av en fyrkantig vägningsbåt (81 mm x 81 mm x 25 mm).</li>
	<li>Blanda de två komponenterna i Silicon Elastomer Kit i förhållandet 10: 1, var uppmärksam på att inte fånga luft. Häll blandningen i vägningsbåten som innehåller den sfäriska biten av det runda bottenröret.</li>
	<li>Bota silikonet vid rumstemperatur över natten. Ta bort vägbåten och det rundbottnade röret från den härdade silikonformen.</li>
</ol>3. RPE-dissektion
<ol><li>Rengör sclera av det färska ögonklotet av muskler och bindväv. Fäst ögat på silikonformen med 27 G nålar som träs genom sclera. Fyll formens hålighet med DPBS 1x med Ca 2+ och Mg2+. OBS: Var uppmärksam på att inte bryta ögonkammaren. Nålarna ska bara passera genom sclera.</li>
	<li>Använd en 1 ml spruta och en 21 G nål för att injicera ~400 μl 1 700 mOsm D-mannitollösning i glaskroppen. För in nålen genom pars plana för att undvika att punktera den främre kammaren i ögat. Låt ögat stå i rumstemperatur i ~45 min.</li>
	<li>Skär upp den främre kammaren i nivå med pars plana med en fin sax och pincett. Fyll den bakre ögonkammaren med DPBS 1x med Ca 2+ och Mg2+. Under stereomikroskopet, lokalisera makula (den gula fläcken på näthinnan).</li>
	<li>Om en kirurgisk glasskärare är tillgänglig, ta bort glaskroppen och ersätt den med DPBS 1x med Ca 2+ och Mg2+. Alternativt kan du försöka lyfta glaskroppen med pincett och klippa den med fin sax.</li>
	<li>Var uppmärksam på att bevara den makulära regionen, skär ögat i kvadranter: nasal, temporal, överlägsen och underlägsen. Ta bort nålarna om de är i vägen.</li>
	<li>Överför den smörfläckiga bakre kammaren i ögat till en 100 mm petriskål som innehåller DPBS 1x med Ca 2+ och Mg2+. Innan du tar bort näthinnan, markera kronbladet som innehåller makula genom att göra ett litet snitt (V-format) i ciliärmarginalen. Lyft och skär alla glasögon som ligger på näthinnan.</li>
	<li>Lyft försiktigt näthinnan från flera sidor med en krökt spatel eller ett par pincett för att kontrollera om näthinnan har lossnat från RPE och för att låta lite vätska cirkulera mellan de två skikten. OBS: Näthinnan kommer fortfarande att fästas i periferin (ciliary marginaler) och vid optisk nerv.</li>
	<li>Skär näthinnan från ciliärmarginalerna i alla kronblad, se till att du inte kliar på RPE. Placera vävnaden i 4% PFA och inkubera i ~ 1 h. Tvätta 3x med DPBS 1x med Ca 2+ och Mg2+. Överför vävnaden till en behållare fylld med DPBS 1x med Ca 2+ och Mg2+ och förvara den vid 4 °C. OBS: Vid denna tidpunkt är näthinnan endast fäst vid synnerven. Detta är en pauspunkt i detta experiment.</li>
	<li>Överför provet till en 100 mm petriskål som innehåller DPBS 1x med Ca 2+ och Mg2+. Stansa ut det optiska nervhuvudet med en 1,5 mm biopsistans och samla näthinnan. Förvara den neurala näthinnan i DPBS 1x med Ca 2+ och Mg2+ vid 4 °C. OBS: Innan du stansar ut synnervhuvudet, se till att skära synnerven så mycket som möjligt på skleralsidan. Detta ökar stansens precision. Stansning av synnerven efter att flatmount är fixerad i 4% PFA minskar skadorna på RPE-cellerna som ligger runt synnerven.</li>
	<li>Ta bort sclera från RPE / choroid genom att försiktigt lyfta RPE / choroidskiktet från periferin och skära koroidkärlen och bindväven som ligger mellan sclera och RPE med ett par Vannas-fjädersaxar. När RPE/choroid är helt separerad från sclera, samla in RPE/choroidskiktet. Överför vävnaden till en behållare fylld med DPBS 1x med Ca 2+ och Mg2+ och förvara den vid 4 °C. OBS: För närvarande kan experimentet pausas.</li>
</ol>4. Färgning
<ol><li>Överför RPE/choroid till en brunn på en 6-brunnsplatta. Blockera och permeabilisera provet i DPBS 1x med Ca 2+ och Mg 2+ med 1% bovint serumalbumin (BSA), 0,5% Tween20 och 0,5% Triton X-100 i 1 h vid rumstemperatur.</li>
	<li>Inkubera provet med falloidin konjugerat med en 647 fluorofor vid en utspädning på 1:250 i DPBS 1x med Ca 2+ och Mg 2+ med 1% BSA, 0,5% Tween20 och 0,5% Triton X-100 i 1 timme vid rumstemperatur. Tvätta 3x i DPBS 1x med Ca 2+ och Mg2+.</li>
	<li>Överför RPE/choroidprovet till en 50 mm x 75 mm glasskiva och platta ut det. Skär varje "kronblad" i två för att göra provet plattare. Var uppmärksam på makula. Rita en kontur av flatmount med en hydrofob penna.</li>
	<li>För att släcka lipofuscinautofluorescensen, tillsätt 500 μL av autofluorescenssläckarlösningen utspädd till 1:20 i 70% etanol och inkubera vid rumstemperatur i 2 min.</li>
	<li>Tvätta noggrant (minst 3x) i DPBS 1x med Ca 2+ och Mg2+. Ta bort DPBS och lägg till monteringsmediet. Placera ett täckglas på flatmount och försegla med nagellack.</li>
	<li>Avbilda flatmount med ett fluorescensmikroskop (helst med ett 10x eller 20x mål).</li>
</ol>5. REShAPE-analys
OBS: Eftersom den REShAPE AI-baserade algoritmen tränades på 10x och 20x bilder rekommenderas det därför starkt att använda ett 10x eller 20x mål vid avbildning. Om inte, måste bilderna skalas om i enlighet därmed.
<ol><li>Om bilderna förvärvas med mer än en fluorescerande kanal, isolera kanalen som används för att förvärva cellgränserna. Exportera bilderna som 16-bitars TIF-filer i gråskala. Bilder som förvärvats med filtillägget .czi behöver inte exporteras som TIF-filer, men kanalen som innehåller cellkanterna måste fortfarande isoleras.</li>
	<li>Installera programvaran på Windows x64 eller Linux (Centos 7) plattformar. OBS: Programvaran och instruktionerna för installation finns på https://github.com/nih-nei/REShAPE.</li>
	<li>Öppna programvaran (bild 1).</li>
	<li>På fliken Kataloger väljer du indata- och utdatamapparna. I indatakatalogen väljer du den mapp som innehåller bilderna. I utdatakatalogen, låt programvaran automatiskt ändra sökvägen till "inmatningskatalog / bearbetad". Alternativt kan du ändra utdatakatalogen manuellt. OBS: Programvaran kommer att iterera genom alla bilder som finns i inmatningsmappen.</li>
	<li>På fliken NN-segmenteringsalternativ väljer du följande inställningar för bildsegmentering:<ol><li>Batchstorlek: Ange värdet 20 i textrutan som en bra utgångspunkt, men sänk det om systemet får slut på grafikprocessorer (GPU:er). OBS: Den ursprungliga bilden är uppdelad i mindre brickor för bearbetning. Batchstorleken anger hur många paneler som kan bearbetas samtidigt.</li>
		<li>Använd GPU?: Om systemet inte har tillräckligt med GPU-resurser markerar du rutan Nej.</li>
		<li>Intern skala: Använd rullgardinsmenyn och ändra den interna skalningen från Ingen i fall där bilderna inte förvärvades med ett mål på 10x eller 20x. Nedskala till exempel 40x bilder till hälften av storleken med 1 /2-knappen . Omskalningsalternativen som finns tillgängliga i rullgardinsmenyn är följande: 5x, 2x, Ingen, 1/2, 1/5. Maskininlärningen tränades med 10x och 20x bilder. Det kanske inte känner igen cellkanter från bilder som tagits vid andra förstoringar. I det här fallet kommer binära bilder att visas helt svarta.</li>
		<li>Arti Filter: Använd artefaktfilterfliken för att ta bort mycket ljusa partiklar (skräp eller små delar av näthinnan eller bindväv runt synnerven) som kan finnas i bilden och kan störa cellgränssegmenteringen. Inget filter används som standard. De konstgjorda filteralternativen i rullgardinsmenyn är följande: Vanlig, Stark och Svag.</li>
	</ol></li>
	<li>På fliken Alternativ för sida vid sida vid sida infogar du ett värde i textrutan för att ange mängden överlappning mellan bildpanelerna genom att justera parametern Pad Tiles By . En överlappning på 100 pixlar fungerar vanligtvis bra.</li>
	<li>På fliken Alternativ för grafik för utdata ställer du in inställningarna för generering av värmekartor:<ol><li>Rekonstruera kaklade bilder?: om systemet inte har tillräckligt med resurser för analys av stora bilder, markera rutan Nej för att låta programvaran slutföra analysen genom att spara enskilda brickor utan att rekonstruera hela bilden.</li>
		<li>Skapa färgbilder: Om du vill generera värmekartor väljer du Alla i rullgardinsmenyn.</li>
		<li>För Färgning, välj någon av de olika färgpaletter som finns i rullgardinsmenyn: Termisk, Grön, Mpl-magma, Fas, Eld, Jet, Cyan Hot.</li>
		<li>För Bildformat sparar du bilderna som TIF eller PNG genom att välja ett av alternativen på fliken.</li>
		<li>När det gäller funktionen Använd manuella gränser? markerar du rutan Nej för att låta programvaran använda de lägsta och högsta värden som upptäcks i varje bild. Markera rutan Ja för att manuellt justera värdeintervallet för varje formmåttvärmekarta och klicka på knappen Ställ in gränser för att välja intervall för de enskilda parametrarna genom att infoga värden i textrutorna. När du har ändrat värdena av intresse klickar du på Spara. Klicka på Ladda standardvärden för att återställa alla gränser. OBS: Använd manuella gränser om värmekartor från flera bilder behöver jämföras, till exempel när du jämför effekterna av olika föreningar på cellform. På så sätt används samma värdeintervall. Den uppsättning värden som ska anges manuellt varierar beroende på typen av prov. Vi rekommenderar att du kör några iterationer för att välja det optimala intervallet.</li>
	</ol></li>
	<li>På fliken Cellstorleksbegränsningar för analys väljer du en cellstorlekströskel för analysen:<ol><li>I Lägre cellstorlek infogar du i textrutan storleken på den minsta cell som ska ingå i analysen.</li>
		<li>I Övre cellstorlek infogar du i textrutan storleken på den största cellen som ska ingå i analysen. Enheten för cellstorlek ändras från pixlar till mikrometer i kvadrat beroende på vilket alternativ som valts på fliken Automatiserad enhetskonvertering .</li>
	</ol></li>
	<li>På fliken Automatiserad enhetskonvertering väljer du önskad enhet för analysen:<ol><li>I Konvertera pixlar till verkliga enheter?, markera rutan Nej för att köra analysen i pixelenheter. Markera rutan Ja för att köra analysen i mikrometer.</li>
		<li>I Skalstreckets längd (pixlar) anger du pixelvärdet i textrutan.</li>
		<li>I Skalstreckets längd (mikron) anger du motsvarande avstånd i mikrometer i textrutan.</li>
	</ol></li>
	<li>Starta analysen genom att trycka på Go For It. OBS: Programvaran kan också mäta cellviabilitet när cellerna är färgade med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och propidiumjodid (fliken CZI-alternativ ), men detta gäller inte RPE-flatmounts.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig01.jpg"> Bild 1: ReshAPE grafiskt användargränssnitt. GUI har olika flikar för att välja arbetskataloger (fliken Kataloger ), ändra segmenteringsalternativen (flikarna NN-segmenteringsalternativ och Panelbildalternativ ), ange parametrarna för analys (Cellstorleksbegränsningar för analys och Automatiserad enhetskonvertering) och för generering av värmekarta (fliken Alternativ för utdatagrafik). Förkortning: GUI = grafiskt användargränssnitt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<ol>
	<li>Endo, E. G., Yao, X. Y., Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pigment+adherence+as+a+measure+of+retinal+adhesion:+Dependence+on+temperature.">Pigment adherence as a measure of retinal adhesion: Dependence on temperature.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (9), 1390-1396 (1988).</li><li>Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+detachment+from+hyperosmotic+intravitreal+injection.">Retinal detachment from hyperosmotic intravitreal injection.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 18 (12), 1237-1244 (1979).</li><li>Marmor, M. F., Martin, L. J., Tharpe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotically+induced+retinal+detachment+in+the+rabbit+and+primate.+Electron+microscopy+of+the+pigment+epithelium.">Osmotically induced retinal detachment in the rabbit and primate. Electron microscopy of the pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 19 (9), 1016-1029 (1980).</li><li>Ban, Y., Rizzolo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+model+of+development+reveals+multiple+properties+of+RPE+tight+junctions.">A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions.</a> Molecular Vision. 3, 18 (1997).</li><li>Ortolan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-resolution+map+of+human+retinal+pigment+epithelium+helps+discover+subpopulations+with+differential+disease+sensitivity.">Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (19), 2117553119 (2022).</li><li>Schaub, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+learning+predicts+function+of+live+retinal+pigment+epithelium+from+quantitative+microscopy.">Deep learning predicts function of live retinal pigment epithelium from quantitative microscopy.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 1010-1023 (2020).</li><li>Beatty, S., Koh, H. -. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration.">The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).</li><li>Liu, Z., Kocaoglu, O. P., Miller, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+retinal+pigment+epithelial+cells+in+the+living+human+retina.">3D imaging of retinal pigment epithelial cells in the living human retina.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (9), 533-543 (2016).</li><li>Bhatia, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RPE+morphometry+in+human+eyes.">Analysis of RPE morphometry in human eyes.</a> Molecular Vision. 22, 898-916 (2016).</li><li>vonder Emde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+cell+shape+descriptors+for+the+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration:+A+comparison+to+unaffected+eyes.">Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes.</a> Translational Vision Science &amp; Technology. 11 (8), 19 (2022).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Den konsekventa och effektiva separationen av mänsklig RPE och näthinnor kan uppnås med hjälp av detta protokoll. Denna metod möjliggör studier av regionala skillnader i RPE-form över hela mänskliga näthinnor5. Ett viktigt steg i protokollet är den fysiska separationen av RPE och näthinnan. Om de två vävnaderna inte är helt lossnade i vissa områden, bör man försiktigt lyfta näthinnan och se till att inte bryta vävnaderna. REShAPE-analysen av stora flatmounts kan kräva användning av system med betydande RAM-resurser. I det här fallet kan återmonteringen av hela bilden inaktiveras så att programvaran framgångsrikt kan slutföra analysen trots brist på bearbetningsresurser.
Den huvudsakliga begränsningen med att använda REShAPE för att segmentera mänskliga RPE-flatmounts är att AI-algoritmen mestadels tränades på bilder av inducerad pluripotent stamcellsbaserad RPE. Som en konsekvens är segmenteringen av mänskliga RPE-flatmounts mindre exakt. RPE-celler från åldrade givare innehåller en stor mängd lipofuscin7, och det breda spektrumet av dess autofluorescens stör cellgränssegmenteringen. I framtiden kommer fler bilder av RPE-flatmounts att användas för att förbättra cellgränssegmenteringen i denna typ av prov. Trots denna begränsning utbildades REShAPE specifikt för att känna igen och segmentera RPE-cellgränser och presterar bättre än andra befintliga metoder, såsom Voronoi8 och CellProfiler9-segmentering av RPE-celler.
Dessutom, jämfört med manuell segmentering 10, ger REShAPE fördelen att analysera stora bilder snabbt (~ 130 000 pixlar x130 000 pixlar testades). Sammanfattningsvis är denna dissektionsmetod mycket reproducerbar och kan enkelt utvidgas till andra djurmodeller. Dessutom kan programvaran användas för att studera RPE-form i ögonflator eller i cellodlingsmodeller för att undersöka effekten av vissa behandlingar. Slutligen gör REShAPE: s mångsidighet det i stort sett tillämpligt för analys av andra typer av epitelceller.

Retinal pigmentepitel (RPE) och neural retina är starkt sammankopplade med varandra på grund av fotoreceptorernas starka fysiologiska beroende av RPE. Under dissektion orsakar den mekaniska separationen av den neurala näthinnan från RPE rivning av RPE-cellerna, med de apikala delarna av RPE kvar fästa vid de yttre segmenten av retinala fotoreceptorer. Omfattningen av RPE-retinal vidhäftning är så stor att mängden pigment som finns kvar på näthinnan efter separation används för att kvantifiera styrkan hos retinal vidhäftning1. Specifikt bryts RPE täta korsningar och aktinstrukturen som förbinder dem, som ligger på den apikala sidan, av under mekanisk separation. Därför resulterar färgning av RPE-flatmounts för cellgränser i ett ojämnt monolager där många celler saknar gränser. Denna effekt förvärras när vävnaden fixeras med paraformaldehyd (PFA) före dissektion, eftersom proteinerna blir tvärbundna.
Studier på intravitreal läkemedelstillförsel har visat att injektioner av hyperosmotiska lösningar i den bakre kammaren inducerar näthinneavlossning 2,3. I dessa experiment orsakade 50 μL av olika lösningar, allt från 1 000 mOsm till 2 400 mOsm, injicerad i mitten av glaskroppen näthinneavlossning inom några minuter. Noterbart är att även efter långa exponeringar för lösningar med hög osmolaritet verkade RPE-täta korsningar intakta i överföringselektronmikroskopiska bilder av både kanin- och apögon3. Efter en liknande strategi injicerade vi i mitten av glaskroppen en hyperosmotisk lösning av D-mannitol för att inducera en effektiv retinalavskiljning innan vi utför RPE-dissektion. Eftersom D-mannitol inte transporteras av RPE4 upprätthålls en hög intravitreal koncentration, vilket genererar en osmotisk gradient. Den effektiva separationen av RPE och näthinnan över hela den bakre kammaren garanterar bevarandet av RPE-cellulära korsningar och möjliggör studier av RPE-morfometri på hela plattfästet. Dessutom utvecklade vi en artificiell intelligens (AI)-baserad programvara som känner igen och segmenterar fluorescerande märkta RPE-cellgränser, kvantifierar 30 olika formmått och producerar värmekartor för varje mått för visualisering 5,6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.5 mm&#160;</td>
			<td>Acuderm Inc.</td>
			<td>P1525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>160069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness&#160;</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>5075-1.5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved spatula</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K3-6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14558-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluormount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 21 G x 1-1/2&#34; hypodermic</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 27 G x 1-1/4&#34; hypodermic</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>PAL (Personna)</td>
			<td>62-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom tubes 50 mL</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>9SIA4SR9M88854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Vitrectomy System</td>
			<td>BD Visitrec</td>
			<td>585100</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlack</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23007</td>
			<td>autofluorescence quencher&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>20605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 3 mm cutting edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and consistent generation of retinal pigment epithelium/choroid flatmounts from human eyes for histological analysis

Retinal pigmentepitel (RPE) och näthinnan är funktionellt och strukturellt anslutna vävnader som arbetar tillsammans för att reglera ljusuppfattning och syn. Proteiner på RPE-apikalytan är tätt associerade med proteiner på fotoreceptorns yttre segmentyta, vilket gör det svårt att konsekvent separera RPE från fotoreceptorerna / näthinnan. Vi utvecklade en metod för att effektivt separera näthinnan från RPE för mänskliga ögon för att generera kompletta RPE / choroid- och retina-flatmounts för separat cellulär analys av fotoreceptorerna och RPE-cellerna. En intravitreal injektion av en lösning med hög osmolaritet av D-mannitol, ett socker som inte transporteras av RPE, inducerade separationen av RPE och näthinnan över hela den bakre kammaren utan att orsaka skador på RPE-cellkorsningarna. Inga RPE-plåster observerades fästa vid näthinnan. Falloidinmärkning av aktin visade RPE-formbevarande och möjliggjorde morfometrisk analys av hela epitelet. En artificiell intelligens (AI) -baserad programvara utvecklades för att exakt känna igen och segmentera RPE-cellgränserna och kvantifiera 30 olika formmätvärden. Denna dissektionsmetod är mycket reproducerbar och kan enkelt utvidgas till andra djurmodeller.

Detta protokoll resulterar i en enplansbild av en flatmount, där cellens placering och 30 formmätvärden mäts för varje korrekt identifierad RPE-cell (figur 2). En mapp med namnet "Bearbetad" genereras automatiskt i inmatningskatalogen. Den här mappen innehåller fyra underkataloger med namnen "Analys", "Färgkodade", "Kombinerade filer" och "Segmenterade bilder" och några tillfälliga filer som genererats under analysen. Mappen "Kombinerade filer" innehåller ett kalkylblad med alla formmätningar och ett kalkylblad med frekvenserna för cellgrannantalet för alla filer tillsammans. Mappen "Analys" innehåller ett kalkylblad med alla formmätningar och ett kalkylblad med frekvenserna för cellgrannen räknas för varje bild separat. Katalogen "Segmenterade bilder" innehåller de slutliga binära maskerna i RPE-cellgränserna; Den kan användas för att utvärdera segmenteringens kvalitet. Katalogen "Färgkodad" innehåller värmekartor för varje formmätning för att visualisera formmönstren i varje bild. Formmåttdefinitionerna och förkortningarna finns i tabell 1.
Ibland kan RPE-flatmounts innehålla kvarvarande bitar av näthinnan som inte avlägsnades rent, särskilt runt synnerven. Falloidinfärgning av provet resulterar i en stark signal som kommer från näthinnan, och detta kan orsaka problem för RPE-cellgränssegmentering. Vissa brickor kommer att se helt svarta ut, medan de omgivande plattorna visar normal segmentering. Andra ljusa föremål som kan finnas i bilden kommer också att orsaka generering av svarta plattor (figur 3). I dessa fall kommer du att välja ett av filtreringsalternativen (Svag, Vanlig, Stark) som finns tillgänglig i rullgardinsmenyn Arti Filter för att förhindra bildandet av svarta plattor.
REShAPE tar 8-bitars eller 16-bitars gråskalebilder som indata men inte RGB-bilder. Att använda RGB-bilder för REShAPE-analysen ger helt svarta binära bilder. Om detta inträffar kommer konvertering av RGB-bilderna till gråskala att producera korrekt segmenterade binära bilder (bild 4). Vid vissa tillfällen där RPE-gränserna inte känns igen korrekt, till exempel om färgningen inte är optimal eller om provet skadas av en repa (figur 5A), kan stora klumpar av celler identifieras som en enda mycket stor cell (figur 5B). I detta fall kan stora objekt uteslutas från analysen genom att minska cellstorlekströskeln (figur 5C). Detta kan uppnås genom att infoga ett lägre värde i textrutan Övre cellstorlek . Detta kommer dock att resultera i en förändring av värmekartans intervall. Om en forskare väljer att göra det är det också möjligt att behålla det ursprungliga värmekartområdet (figur 5D) genom att markera rutan Ja i funktionen Använd manuella gränser?. Därefter måste forskaren vänsterklicka på knappen Ställ in gränser och infoga önskade värden i textrutorna för att ange de manuella gränserna.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig02.jpg"> Figur 2: Fullständig morfometrisk analys av ett helt mänskligt RPE-monolager. (A) En låg förstoringsvy av en hel mänsklig RPE / choroid flatmount (magenta: phalloidin). (B) En inzoomad vy av falloidinfärgade RPE-celler. (C) REShAPE-genererad segmentering av RPE-cellgränserna för en hel human RPE/choroid flatmount och (D) motsvarande inzoomade vy. (E) En mjukvarugenererad värmekarta som illustrerar cellområdet för de enskilda RPE-cellerna i hela den mänskliga flatmounten. Den termiska skalan i det övre vänstra hörnet visar det använda värdeintervallet. (F) Motsvarande inzoomad vy som visar enskilda RPE-celler färgade efter område. Skalstänger = (B,D,F) 50 μm, (A,C,E) 5 mm. Förkortning: RPE = retinal pigmentepitel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig03.jpg"> Figur 3: Filtrering av ljusa artefakter. (A) En mänsklig RPE-flatmount färgad för cellgränser (magenta: phalloidin) kan presentera ljusa områden (gröna rektanglar) som stör segmenteringen. (B) RPE-cellkantsegmenteringen av hela flatmount innehåller tre helt svarta plattor (gröna pilar) som motsvarar ljusa områden av fluorescens. (C,E) Två av de svarta plattorna motsvarar områden som innehåller ljusa prickar, som möjligen är lite skräp. (D) En av de svarta plattorna genererades av en bit neural näthinna runt synnerven som inte avlägsnades korrekt. Bitarna av neural näthinna är betydligt ljusare än RPE-skiktet och hindrar cellsegmentering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig04.jpg"> Bild 4: Inmatningsbild krävs. RPE-cellerna färgade för cellkantlinjer sparades som (A) RGB eller som (B) gråskala 16-bitars bilder för REShAPE-analys. (C) Utgången från RBG-bildanalysen är en svart binär bild, (D) medan analysen av gråskalebilden ger en korrekt segmenterad binär av cellgränserna. REShAPE kan bara analysera 8-bitars eller 16-bitars gråskalebilder. Skalstänger = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig05v2.jpg"> Figur 5: Suboptimala resultat . (A) En bild av en del av RPE-monolagret där cellerna färgade med falloidin av misstag repades. (B) En värmekarta över RPE-celler färgade av cellområdets dimension. En stor övre cellstorlekströskel inkluderar stora objekt i analysen. (C) En värmekarta för cellområdet där en mindre övre cellstorlekströskel valdes för att utesluta stora objekt från analysen. (D) En värmekarta för cellområdet där en mindre övre cellstorlekströskel valdes och manuella gränser ställdes in för att bibehålla det värmekartområde som ursprungligen användes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig05largev2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Tabell 1: REShAPE-parametrar. Tabellen rapporterar definitionen av varje parameter och förkortningarna som används i råa kalkylblad ("_Data.csv" -filer) och för värmekartorna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761_Table-1.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis at JoVE.com

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Vi beskriver en metod för att effektivt separera retinal pigmentepitel (RPE) från näthinnan i mänskliga ögon och generera hela RPE/choroid flatmounts för histologiska och morfometriska analyser av RPE.

Effektiv och konsekvent generering av retinal pigmentepitel / choroid flatmounts från mänskliga ögon för histologisk analys

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Denna metod hjälper till att förstå fenotypiska skillnader i RP-celler över hela den mänskliga näthinnan. Dissektionstekniken som Davide Ortolan har utvecklat är mycket reproducerbar för att generera en frigöring mellan RP och näthinnan. Och REShAPE-programvaran är verkligen märkbar när det gäller att analysera stora bilder av RP-platta fästen.Metoden som Davide har utvecklat kan användas för att studera regionala skillnader i RP-fenotypen från patienter med olika typer av retinala degenerativa sjukdomar. För att börja, skär 50 ml koniskt rör något under 5 milliliter-märket. Fäst rörspetsen på botten av vägbåten med varmt lim.Blanda sedan de två komponenterna i silikonelastomersatsen i förhållandet 10 till 1 för att undvika att fånga in luft. Häll blandningen i vägningsbåten som innehåller denna sfäriska bit av det runda bottenröret. Bota silikonet vid rumstemperatur över natten.Ta bort vägbåten och det runda bottenröret från den härdade silikonformen. Fyll först en 1 ml spruta med 1700 millimol D-Mannitol-lösning och fäst den på en 21-gauge nål. För in nålen genom pars plana för att undvika att punktera den främre kammaren i ögat och injicera 400 mikroliter av lösningen i glaskroppen.Låt ögat stå i rumstemperatur i 45 minuter. Skär upp den främre kammaren med en sax och pincett med en sax och pincett på nivån av pars plana. Fyll den bakre ögonkammaren med DPBS som innehåller kalcium och magnesium.Under stereomikroskopet, lokalisera makula visualiserad som en gul fläck på näthinnan. Skär ögat i kvadranter, nämligen nasal, temporal, överlägsen och underlägsen, samtidigt som du ser till att bevara makularegionen. Ta bort nålarna om de är i vägen.Överför fjärilen till den bakre kammaren i ögat till en 100 millimeter petriskål som innehåller DPBS med kalcium och magnesium. Innan du tar bort näthinnan, markera kronbladet som innehåller makula genom att göra ett V-format snitt i ciliärmarginalen. Lyft och skär alla glasögon som ligger på näthinnan.Skär näthinnan från ciliärmarginalerna i alla kronblad och se till att inte repa RPE. Placera vävnaden i 4% PFA och inkubera i en timme. Tvätta tre gånger med DPBS som innehåller kalcium och magnesium.Överför vävnaden till en behållare fylld med samma buffert och förvara den vid 4 grader Celsius. Överför sedan provet till en 100 millimeter petriskål innehållande DPBS med kalcium och magnesium. Stansa ut synnervhuvudet med en 1,5 millimeter biopsistans.Samla näthinnan och förvara den i samma buffert vid 4 grader Celsius. För att ta bort sclera från RPE-koroiden, lyft försiktigt RPE-koroidskiktet från periferin. Skär sedan med ett par Vannas Spring Scissors koroidkärlen och bindväven som ligger mellan sclera och RPE.Efter fullständig separation från sclera, samla RPE-koroidskiktet. Överför vävnaden till en behållare fylld med DPBS som innehåller kalcium och magnesium och förvara den vid 4 grader Celsius. Överför RPE-koroiden till en brunn på en sexbrunnsplatta.Blockera och permeabilisera provet i en timme vid rumstemperatur. Inkubera provet i en timme vid rumstemperatur med falloidin konjugerat med 647 fluorofor vid en utspädning från 1 till 250 i permeabiliseringsbufferten. Tvätta tre gånger i DPBS som innehåller kalcium och magnesium.Överför RPE-koroidprovet till en 50 x 75 millimeter glasskiva och platta ut det. Skär varje kronblad i två för att göra provet plattare. Rita en kontur av det platta fästet med en hydrofob penna.För att släcka lipofuscinautofluorescensen, tillsätt 500 mikroliter av autofluorescenssläckarlösningen och inkubera vid rumstemperatur i två minuter. Tvätta noggrant i DPBS som innehåller kalcium och magnesium. Ta bort DPBS och lägg till monteringsmediet.Placera ett täckglas på det platta fästet och försegla med nagellack. Öppna programvaran. På fliken kataloger väljer du indata- och utdatamapparna.I utgångskatalogen, låt programvaran automatiskt ändra sökvägen till inmatningskatalogen eller processen. Alternativt kan du ändra utdatakatalogen manuellt. För att generera värmekartor, välj alla från rullgardinsmenyn på fliken Skapa färgbilder.Markera rutan nr i funktionen använd manuella gränser för att låta programvaran använda de lägsta och högsta värden som upptäcks i varje bild. Markera rutan ja för att manuellt justera värdeintervallet för varje formmetrisk värmekarta. Klicka sedan på knappen ställ in gränser och infoga värden i textrutorna för att välja intervall för de enskilda parametrarna.När du har ändrat värdena av intresse klickar du på spara. Klicka på låga standardvärden för att återställa alla gränser. Om du vill välja en cellstorlekströskel i lägre cellstorlek infogar du storleken på den minsta cellen som ska ingå i analysen.I den övre cellstorleken infogar du storleken på den största cellen som ska inkluderas. I konvertera pixlar till verkliga enheter, kontrollera nej för att köra analysen i pixelenheter, kontrollera ja för att köra analysen i mikrometer. I längden på skalstreckspixlar anger du pixelvärdet i textrutan.I längden på skalstångsmikronerna anger du motsvarande avstånd i mikrometer. För att starta analysen, tryck på gå för den. Detta protokoll resulterar i en enplansbild av ett platt fäste där cellens placering identifieras genom REShAPE-genererad segmentering av RPE-cellgränserna.Dessutom mäts 30 formmått, inklusive cellområdet för de enskilda RPE-cellerna, för varje korrekt identifierad RPE-cell. Svarta plattor som härrör från kvarvarande bitar av näthinnan eller andra ljusa föremål kan tas bort genom att välja ett av de filtreringsalternativ som finns tillgängliga i rullgardinsmenyn RT-filter. Att använda RBG-bilder för omformningsanalysen ger helt svarta binära bilder.Om detta inträffar skapas korrekt segmenterade binära bilder om RGB-bilderna konverteras till gråskala. Om färgningen inte är optimal eller om provet skadas av en repa, kan stora klumpar av celler identifieras som en enda mycket stor cell. I det här fallet kan stora objekt uteslutas från analysen genom att ändra cellstorlekströskeln.För att få en platt vävnad måste RP och choroid separeras från sclera även om dessa steg kan ta lång tid. Efter genereringen av RP-plattfästet är det möjligt att fläcka för ytterligare RPE-markörer så att du kan studera olika regioner i RP-monolagret. Med hjälp av denna metod har vi upptäckt fem olika RP-populationer som är differentiellt känsliga för olika retinala degenerativa sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Snabb och effektiv generering av nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller i en Multititre Plate format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Snabb och effektiv Zebrafish Genotyping Använda PCR med hög upplösning Smält Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effektiv Produktion och rening av rekombinant Murina Kindlin-3 från insektsceller för biofysikalisk Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Human inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MikroRNA Expression Profiler av Human iPS-celler, pigmentepitelet härledas från iPS, och Fetal pigmentepitelet

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinal Transplantation av mänskliga embryonala stamceller härstammar-retinal Pigment epitelial celler till en stor-eyed modell av geografisk atrofi

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primära cellkulturer från mus Retinal pigmentepitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Effektiv dissekering och kultur av primära mus retinal pigment epitelceller

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Generering av humana njurslanguloider från vävnad och urin

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Primär odling av svin retinala pigmentepitelceller

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...