Name: in vitro myelination of peripheral axons in a coculture of rat dorsal root ganglion explants and schwann cells
Uploaded: 2023-02-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells at JoVE.com

نشكر الأستاذ الدكتور رالف جولد والأستاذة الدكتورة جيسا إلريشمان على نصائحهم ودعمهم.

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لتوجيه مجلس الجماعات الأوروبية لرعاية واستخدام المختبر.
1. ثقافة خلية شوان
<ol><li>طلاء لثقافة خلية شوان<ol><li>معطف أطباق ثقافة الخلية تحت ظروف معقمة. ضع 2 مل من 0.01٪ بولي-ل-ليسين (PLL) على طبقين لزراعة الأنسجة (TC) مقاس 60 مم لكل منهما واحتضان طوال ...

<ol>
	<li>Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+cell+body+size,+axon+size,+and+signal+conduction+velocity+for+individually+labelled+dorsal+root+ganglion+cells+in+the+cat.">Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).</li><li>Taveggia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells-axon+interaction+in+myelination.">Schwann cells-axon interaction in myelination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).</li><li>Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+regeneration+and+muscle+reinnervation.">Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).</li><li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury.">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).</li><li>Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+injury+and+myelination:+Potential+therapeutic+strategies.">Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).</li><li>Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+Schwann+cell+proliferation.+III.+Evidence+for+the+surface+localization+of+the+neurite+mitogen.">Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen.</a> The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).</li><li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells.">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li><li>Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+axon-related+Schwann+cells+in+vitro.+I.+Ascorbic+acid+regulates+basal+lamina+assembly+and+myelin+formation.">Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation.</a> The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).</li><li>Paivalainen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+in+mouse+dorsal+root+ganglion/Schwann+cell+cocultures.">Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140 (4), 898-913 (2017).</li><li>Taveggia, C., Bolino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRG+neuron/Schwann+cells+myelinating+cocultures.">DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).</li><li>Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+versatile+method+for+the+isolation,+purification+and+cryogenic+storage+of+Schwann+cells+from+adult+rodent+nerves.">A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves.</a> Scientific Reports. 6, 31781 (2016).</li><li>Pitarokoili, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+triamcinolone+acetonide+exerts+anti-inflammatory+effects+on+Lewis+rat+experimental+autoimmune+neuritis+and+direct+anti-oxidative+effects+on+Schwann+cells.">Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).</li><li>Gr&#252;ter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+and+anti-oxidative+effect+of+the+direct+TRPV1+receptor+agonist+capsaicin+on+Schwann+cells.">Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).</li><li>Lehmann, H. C., H&#246;ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+a+therapeutic+target+for+peripheral+neuropathies.">Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies.</a> CNS &amp; Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).</li><li>Joshi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Schwann+cell+plasticity+in+chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy+(CIDP).">Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP).</a> Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).</li><li>Klimas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+immunomodulatory+effects+of+bortezomib+in+experimental+autoimmune+neuritis.">Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis.</a> Brain Communications. 3 (4), (2021).</li><li>Szepanowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA1+signaling+drives+Schwann+cell+dedifferentiation+in+experimental+autoimmune+neuritis.">LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis.</a> Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).</li></ol>

هنا ، نقدم بروتوكولا سريعا وسهلا لتوليد الميالين في المختبر عن طريق دمج ثقافتين منفصلتين من نوع الخلية ، خلايا شوان ونباتات العقدة الجذرية الظهرية.
تتمثل الخطوة الحاسمة في البروتوكول في زراعة نباتات DRG ، خاصة في الأيام الأولى للثقافة. DRG هشة للغاية قبل بناء شبكة محورية ...

في الجهاز العصبي الطرفي (PNS) ، يتم نقل المعلومات السريع بوساطة محاور مغلفة بالمايلين. يعد الميالين في المحاور العصبية ضروريا لتمكين الانتشار السريع للنبضات الكهربائية ، لأن سرعة توصيل الألياف العصبية ترتبط بقطر المحور العصبي وسمكالمايلين 1. تعتمد الإشارات الحسية من المحيط إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) على تنشيط الخلايا العصبية الحسية من الدرجة الأولى الموجودة في تضخم الجذر الظهري ، والتي تسمى العقد الجذرية الظهرية (DRG). لتكوين الميالين وصيانته ، يكون الاتصال المستمر بين المحاور العصبية وخلايا شوان ، وهي خلايا الخلايا الدبقية الميالينية في الجهاز العصبي الطرفي ، إلزاميا2.
تزعج العديد من أمراض الجهاز العصبي الطرفي نقل المعلومات إما عن طريق تلف محوري أولي أو مزيل للميالين ، مما يؤدي إلى نقص الحس أو خلل الحس. تتمتع الخلايا العصبية الحسية من الدرجة الأولى بالقدرة على التجدد إلى حد ما بعد تلف الخلايا العصبية ، من خلال تفاعل معقد بين الخلايا العصبية وخلايا شوان المحيطة3. في هذه الحالة ، يمكن أن تخضع خلايا شوان لإعادة البرمجة الخلوية لإزالة حطام المحور العصبي وكذلك المايلين وتعزيز تجديد المحور العصبي ، مما يؤدي إلى إعادة الميالين4. من المهم فهم آليات الميالين في الصحة والمرض ، من أجل إيجاد خيارات العلاج الممكنة لاضطرابات إزالة الميالين في الجهاز العصبي الطرفي. يمكن أيضا أن يتلف المايلين بسبب الصدمات العصبية الحادة ، والأساليب لتعزيز الميالين لتعزيز الانتعاش الوظيفي بعد إصابة الأعصاب الطرفية قيد التحقيق5.
استفادت معرفتنا بالميالين المحيطي إلى حد كبير من الزراعات المشتركة الميالينية لخلايا شوان والخلايا العصبية الحسية. منذ تطبيق الأساليب الأولى6،7،8 ، تمت دراسة الميالين بشكل مكثف باستخدام أنظمة الاستزراع المشتركالمختلفة 9،10،11. هنا ، نقدم بروتوكولا سريعا وسهلا للميالين القوي في المختبر لمحاور العقدة الجذرية الظهرية. يعتمد بروتوكول تحضير خلية شوان على بروتوكول Andersen et al.12 ، الذي نشر سابقا في Pitarokoili et al.13. نحن نستخدم خلايا شوان المشتقة من الفئران اليافعة ومزارع DRG الجنينية للزراعة المشتركة ، حيث يحدث الميالين في حوالي اليوم 14. الهدف من هذه الطريقة هو توفير نظام للتحقيق في تكوين المايلين نتيجة للتفاعل المباشر بين خلية محور عصبي وشوان ، ودراسة معدلات الميالين PNS. بالمقارنة مع مزارع الخلايا العصبية المنفصلة ، يتم الحفاظ على نباتات DRG تشريحيا بشكل أكبر وتشكل عمليات محورية طويلة. يوفر القياس الكمي لمنطقة المحور العصبي المياليني قراءة كافية للميالين في الزراعة المشتركة. هذه الطريقة هي أداة قيمة لفحص المركبات العلاجية لتأثيرها المحتمل على الميالين العصبي الطرفي ، ويمكن استخدامها أيضا بالإضافة إلى الدراسات في الجسم الحي في النماذج الحيوانية14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-MBP, rabbit</td>
			<td>Novus Biologicals, Centannial, USA</td>
			<td>ABIN446360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#223;III-tubulin, mouse&#160;</td>
			<td>Biolegend, San Diego, USA</td>
			<td>657402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>A4403-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 100 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>70760212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 1250 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>701186210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 20 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>701114210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 300 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>70765210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany&#160;</td>
			<td>8076.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 100 &#181;M</td>
			<td>BD Bioscience, Heidelberg, Germany</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>5811000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator Heracell</td>
			<td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany&#160;</td>
			<td>51017865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 12 mm</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany&#160;</td>
			<td>P231.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11370-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI fluoromount-G(R)</td>
			<td>Biozol, Eching, Germany</td>
			<td>SBA-0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water (Water Purification System)&#160;</td>
			<td>Millipore, Molsheim, France</td>
			<td>ZLXS5010Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>31331093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>D8537-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>VWR, Radnor, USA&#160;</td>
			<td>1009862500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>F7524</td>
			<td>FCS must be tested for Schwann cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>F6886-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>G1393-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td>5710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>14170138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Incubator</td>
			<td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany&#160;</td>
			<td>51017865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraguard ECO 1.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>51029882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Pan-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P30-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>HIH, Bethesda, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#180;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130042303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Motic, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Motic BA 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio observer 7</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany&#160;</td>
			<td>491917-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR, Radnor, USA&#160;</td>
			<td>630-1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130091632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber&#160;</td>
			<td>Assistant, Erlangen, Germany</td>
			<td>40441 &#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuregulin</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, USA</td>
			<td>100-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>N1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Biozol, Eching, Germany</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon &#916; multidishes, 4 well</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>D6789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics, New Jersey, USA&#160;</td>
			<td>10342243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>4430000018&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>2231300004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 15&#160;mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 50&#160;mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>62547254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction vessels, 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>72690001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Cabinet S2020 1.8</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>51026640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14083-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 10 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861254025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861685001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861253001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>10094-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Discovery.V8</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany&#160;</td>
			<td>495015-0012-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 100, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833902300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 35, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833900300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 60, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833901300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thy-1 Microbeads (MACS Kit)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-094-523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I Collagenase</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>C1639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath type 1008</td>
			<td>GFL, Burgwedel, Germany&#160;</td>
			<td>4285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro myelination of peripheral axons in a coculture of rat dorsal root ganglion explants and schwann cells

عملية الميالين ضرورية لتمكين نقل إشارة سريعة وكافية في الجهاز العصبي. في الجهاز العصبي الطرفي، تشارك الخلايا العصبية وخلايا شوان في تفاعل معقد للتحكم في ميالين المحاور العصبية. اضطرابات هذا التفاعل وانهيار غمد المايلين هي السمات المميزة لاعتلالات الأعصاب الالتهابية وتحدث بشكل ثانوي في الاضطرابات التنكسية العصبية. نقدم هنا نموذجا للاستزراع المشترك لنباتات العقدة الجذرية الظهرية وخلايا شوان ، والتي تطور ميالين قويا للمحاور العصبية الطرفية لدراسة عملية الميالين في الجهاز العصبي الطرفي ، ودراسة تفاعلات الخلايا المحورية وشوان ، وتقييم التأثيرات المحتملة للعوامل العلاجية على كل نوع من الخلايا على حدة. من الناحية المنهجية ، تم حصاد العقد الجذرية الظهرية للفئران الجنينية (E13.5) ، وفصلها عن الأنسجة المحيطة بها ، واستزراعها كنباتات كاملة لمدة 3 أيام. تم عزل خلايا شوان من الفئران البالغة من العمر 3 أسابيع ، وتم هضم الأعصاب الوركية إنزيميا. تم تنقية خلايا شوان الناتجة عن طريق فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا واستزراعها في ظل ظروف تخصيب النيوريجولين وفورسكولين. بعد 3 أيام من زراعة العقدة الجذرية الظهرية ، تمت إضافة 30000 خلية شوان إلى مزرعة واحدة من العقدة الجذرية الظهرية في وسط يحتوي على حمض الأسكوربيك. تم الكشف عن العلامات الأولى للميالين في اليوم 10 من الزراعة المشتركة ، من خلال إشارات متفرقة لبروتين المايلين الأساسي في تلطيخ الخلايا المناعية الكيميائية. من اليوم 14 فصاعدا، تكونت أغلفة الميالين وانتشرت على طول المحاور. يمكن قياس الميالين كميا عن طريق تلطيخ البروتين الأساسي للمايلين كنسبة بين مساحة الميالين والمنطقة المحورية، لحساب الاختلافات في الكثافة المحورية. يوفر هذا النموذج فرصا تجريبية لدراسة الجوانب المختلفة للميالين المحيطي في المختبر ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم علم الأمراض وفرص العلاج الممكنة لإزالة الميالين والتنكس العصبي في الأمراض الالتهابية والتنكسية العصبية في الجهاز العصبي المحيطي.

تم تقييم الميالين في الزراعة المشتركة في الأيام 10 و 12 و 14 و 16 و 18 و 20. تم تلطيخ نباتات DRG وخلايا Schwann من أجل MBP و βIII-tubulin و DAPI. كانت الشبكة المحورية في الثقافة المشتركة كثيفة ولم تتغير بشكل واضح في المسار الزمني للملاحظة. كانت العلامات الأولى للمايلين ، في شكل شظايا صغيرة ، قابلة للاكتشاف في الي?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells at JoVE.com

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

في نظام الاستزراع المشترك للعقد الجذرية الظهرية وخلايا شوان ، يمكن دراسة الميالين في الجهاز العصبي المحيطي. يوفر هذا النموذج فرصا تجريبية لمراقبة الميالين المحيطي وقياسه ودراسة تأثيرات المركبات ذات الأهمية على غمد الميالين.

الميالين في المختبر للمحاور المحيطية في زراعة مشتركة لنباتات العقدة الجذرية الظهرية للفئران وخلايا شوان

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

يوفر هذا النموذج فرصا تجريبية لدراسة الجوانب المختلفة لميالين الجهاز العصبي المحيطي في المختبر. إنه يتيح القياس الكمي للمايلين وفحص تفاعلات خلايا Axon-Schwann. تطور الثقافة المشتركة ميالين قويا من اليوم 14 فصاعدا.توفر الثقافات المزروعة DRG ميزة العمارة الهيكلية السليمة مقارنة بالثقافات العصبية المنفصلة. هذه الطريقة متاحة للكشف عن المركبات الاستوائية للأمراض الالتهابية والتنكسية العصبية في الجهاز العصبي المحيطي. للبدء ، تعقيم منطقة العمل في جذع الفئران القتل الرحيم مع 70 ٪ من الإيثانول.افتح الطرف الأيسر السفلي الظهري للفأر بالمقص ، وقم بإزالة العضلة الفخذية للعضلة ذات الرأسين بعناية. قم بفك العصب الوركي عن طريق الارتفاع السلس بالملقط المنحني ، مع ضمان عدم كدمات العصب. باستخدام ملقط ، انقل الأعصاب المقطوعة إلى طبق زراعة الأنسجة مع وسط L-15 البارد من Leibovitz مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الجنتاميسين.ثم ، باستخدام مجهر ستيريو ، قم بإزالة الدهون والعضلات والأوعية الدموية من الأعصاب باستخدام زوجين من الملقط الدقيق. حدد الأطراف القريبة والبعيدة للعصب الوركي وقم بإزالة العصب العلوي بزوج واحد من الملقط الرفيع في الاتجاه القريب إلى البعيد مع إمساك نهاية العصب القريب بالزوج الثاني من الملقط الدقيق. بعد نقل الأعصاب النقية إلى طبق آخر لزراعة الأنسجة مع وسط L-15 البارد من Leibovitz مع Gentamycin ، ندف الحزم العصبية المعزولة لفصل وعزل الألياف العصبية المفردة باستخدام زوجين من الملقط الدقيق.انقل الألياف العصبية إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر ، وتناول أقل قدر ممكن من الوسط. ثم أضف 50 ملليلتر من وسط Leibovitz's L 15 مع الجنتاميسين إلى الألياف العصبية عدة مرات. جهاز طرد مركزي الأنبوب الذي يحتوي على الألياف العصبية عند 188 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.بعد إزالة المادة الطافية ، انقل الحبيبات مع وسيط Leibovitz L-15 المتبقي إلى طبق زراعة الأنسجة 60 ملم. شطف أنبوب 50 ملليلتر مع 10 ملليلتر من محلول الهضم الأنزيمي وإضافته إلى طبق الألياف العصبية. توزيع الألياف العصبية في الطبق بعناية مع طرف ماصة.احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 18 ساعة. ووقف الهضم الأنزيمي عن طريق إضافة 10 ملليلتر في 40٪ FCS في HBSS. نقل الأعصاب المهضومة إلى أنبوب 50 ملليلتر إلى جهاز طرد مركزي عند 188 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من DMEM تحتوي على 10٪ FCS و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الجنتاميسين. بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر. بعد الطرد المركزي عند 188 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، أعد تعليق الحبيبات بأربعة ملليلتر من DMEM تحتوي على FCS و gentamycin.أضف ملليلتر من معلق الخلية إلى كل من أطباق زراعة الأنسجة المغلفة بالبوليسين واللامينين 60 ملم. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون ، وترك لوحات دون أن يمسها لمدة يومين في الحاضنة. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية شوان عند 188 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية لكل واحد في 10 إلى الخلايا السابعة.ثم أضف 10 ميكرولتر من حبات ti1 الصغيرة لكل مرة 10 إلى الخلايا السابعة. احتضان المحلول المعلق لمدة 15 دقيقة في الظلام عند ثماني درجات مئوية. بعد ذلك ، أضف ملليلتر في المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية إلى تعليق الخلية.بعد الطرد المركزي عند 300 جيجا لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية. ضع عمود فصل الخلايا المغناطيسية في فاصل الخلايا ، ورطب العمود بملليلتر واحد من المخزن المؤقت لفصل الخلايا المغناطيسية. ثم قم بتطبيق الخلايا عليها لجمع التدفق من خلال الطرد المركزي.قم بإزالة الرحم بعناية من الفئران الحامل الرحيمة ووضعه في طبق زراعة الأنسجة 100 ملم مع HBSS البارد المثلج. عقد الرحم باستخدام ملقط منحني ، وفتح جدار الرحم مع ملقط غرامة. قم بإزالة كيس أمنيوسي واحد وافتحه بعناية عن طريق قرص ثقب بالملقط الرفيع.قم بإزالة جميع الأجنة بسرعة من الرحم ونقلها إلى طبق مليء ب HBSS. برفق ، ضع جذع جنين واحد في طبق 35 ملم مملوء ب HBSS. تحت مجهر ستيريو ، افتح الجزء الظهري من الجذع لتقسيم الجنين إلى نصفين.أدر نصفا إلى الجانب وحدد حبلا العقد الجذرية الظهرية ، أو DRG ، الموجودة في الخط الموجود في الجزء الظهري من الجنين. اقطع DRG كخصلة كاملة باستخدام ملقط ناعم ومقص صغير. بعد وضع DRG في طبق طازج مملوء بمليلتر من HBSS ، افصل DRG واحدا عن الأنسجة المتبقية باستخدام ملقط دقيق ومقص صغير.خذ صفيحة 4 آبار تحتوي على 190 ميكرولتر من وسط نمو DRG في كل بئر ، وانقل DRG واحدا بعناية إلى وسط كل بئر باستخدام ملقط دقيق وملعقة. ثم ضع مزارع DRG في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، أضف بعناية 50 ميكرولترا من وسط نمو DRG إلى كل بئر ولاحظ التصاق DRG ونمو المحور باستخدام المجهر يوميا.للزراعة المشتركة في اليوم الثالث من زراعة DRG ، استبدل بعناية وسط نمو DRG ب 250 ميكرولتر من وسط الاستزراع المشترك الذي يحتوي على 30،000 خلية شوان لكل بئر. لإجراء تلطيخ كيميائي مناعي ، قم بتثبيت الخلايا الموجودة على زلات الغطاء عن طريق احتضان الخلايا المغسولة DPBS في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق. التقط صورا للعينات الملطخة كيميائيا في ثماني مناطق محددة تحيط بمصنع DRG في المركز باستخدام مجهر مقلوب.يصور هنا مظهر خلايا شوان ذات مورفولوجيا ممدودة وشكل مغزل ومحاور DRG الرفيعة في ثقافة مشتركة. تم تقييم الميالين في الثقافة المشتركة في أيام مختلفة عن طريق تلطيخ نباتات DRG وخلايا شوان لبروتين المايلين الأساسي أو MBP ، وبيتا ثلاثة توبولين ، و DAPI. كانت الشبكة المحورية في الثقافة المشتركة كثيفة ، ولم تتغير بشكل واضح في المسار الزمني للملاحظة.كانت العلامات الأولى للميالين مرئية في اليومين 10 و 12 من الثقافة المشتركة. من اليوم 14 ، كانت إشارة MVP أكثر وضوحا ، وتم اكتشاف محاور مغلفة بالمايلين. زاد الميالين مع وقت الاستزراع المشترك حتى اليوم 20.تم قياس الميالين كنسبة من MVP وبيتا ثلاث مناطق إيجابية توبولين. لوحظت زيادة كبيرة في الميالين في اليومين 18 و 20 مقارنة باليوم 10. ثقافات زراعة DRG هشة ، وتحتاج إلى التعامل معها بعناية.على سبيل المثال ، عند إخراجها من الحاضنة أو أثناء التغيير المتوسط والتثبيت. يمكن تشكيل تحليل التعبير الجيني لعينات الثقافة المشتركة لدراسة المايلين بمزيد من التفصيل. هنا ، اكتشفنا علامات المايلين PMP22 و MAG و Oct6 و Egr2 و Olig1 في اليوم 22.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

يعيش بين محاور التصوير الجذر الظهرية بعد بضع الجذور

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

دراسة وراثية من التجديد أكسون مع الكبار الظهرية مثقف الخلايا العصبية العقدة الجذر

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

الظهرية جذر العقد الخلايا العصبية والخلايا الجذعية المتباينة الدهنية المشتقة: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك الثقافة نموذج لدراسة الأعصاب الطرفية التجديد

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

في المختبر نمذجة السرطانية العصبية الغزو: وظهري الجذر العقدة نموذج

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

مدخل لتعزيز التوافق وتكون الميالين في ظهري الجذر العقدة العصبية

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

الظهرية جذر حقن العقدة وظهري الجذر سحق إصابة نموذجا لالحسية أكسون التجديد

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

و Laminotomy للوصول إلى العقدة الجذر الظهرية القطنية وحقن في الخنازير

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

تحليل للخلايا المناعية في واحد الوركي الأعصاب والعقدة الظهرية الجذرية من ماوس واحدة باستخدام التدفق الخلوي

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

التحقيق إكسون الثدييات التجديد: في فيفو انهانسر من العقدة الجذر الظهرية الماوس الكبار

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

العزلة السريعة للضامة الجذرية الدجورة

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...