Name: in vitro myelination of peripheral axons in a coculture of rat dorsal root ganglion explants and schwann cells
Uploaded: 2023-02-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells at JoVE.com

Vi takker Prof. Dr. Ralf Gold og PD Dr. Gisa Ellrichmann for deres råd og støtte.

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers rådsdirektiv om pasning og anvendelse af forsøgsdyr.
1. Schwann-cellekultur
<ol><li>Belægning til Schwann-cellekultur<ol><li>Overtræk cellekulturskålene under sterile forhold. Påfør 2 ml 0,01% poly-L-lysin (PLL) på to 60 mm vævskultur (TC) skåle hver og inkuber natten over ved 4 °C.</li>
		<li>PLL'en fjernes, TC-skålene vaskes 2x med destilleret vand, og der inkuberes med 2 ml 1 μg...

<ol>
	<li>Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+cell+body+size,+axon+size,+and+signal+conduction+velocity+for+individually+labelled+dorsal+root+ganglion+cells+in+the+cat.">Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).</li><li>Taveggia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells-axon+interaction+in+myelination.">Schwann cells-axon interaction in myelination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).</li><li>Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+regeneration+and+muscle+reinnervation.">Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).</li><li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury.">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).</li><li>Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+injury+and+myelination:+Potential+therapeutic+strategies.">Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).</li><li>Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+Schwann+cell+proliferation.+III.+Evidence+for+the+surface+localization+of+the+neurite+mitogen.">Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen.</a> The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).</li><li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells.">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li><li>Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+axon-related+Schwann+cells+in+vitro.+I.+Ascorbic+acid+regulates+basal+lamina+assembly+and+myelin+formation.">Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation.</a> The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).</li><li>Paivalainen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+in+mouse+dorsal+root+ganglion/Schwann+cell+cocultures.">Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140 (4), 898-913 (2017).</li><li>Taveggia, C., Bolino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRG+neuron/Schwann+cells+myelinating+cocultures.">DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).</li><li>Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+versatile+method+for+the+isolation,+purification+and+cryogenic+storage+of+Schwann+cells+from+adult+rodent+nerves.">A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves.</a> Scientific Reports. 6, 31781 (2016).</li><li>Pitarokoili, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+triamcinolone+acetonide+exerts+anti-inflammatory+effects+on+Lewis+rat+experimental+autoimmune+neuritis+and+direct+anti-oxidative+effects+on+Schwann+cells.">Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).</li><li>Gr&#252;ter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+and+anti-oxidative+effect+of+the+direct+TRPV1+receptor+agonist+capsaicin+on+Schwann+cells.">Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).</li><li>Lehmann, H. C., H&#246;ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+a+therapeutic+target+for+peripheral+neuropathies.">Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies.</a> CNS &amp; Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).</li><li>Joshi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Schwann+cell+plasticity+in+chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy+(CIDP).">Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP).</a> Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).</li><li>Klimas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+immunomodulatory+effects+of+bortezomib+in+experimental+autoimmune+neuritis.">Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis.</a> Brain Communications. 3 (4), (2021).</li><li>Szepanowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA1+signaling+drives+Schwann+cell+dedifferentiation+in+experimental+autoimmune+neuritis.">LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis.</a> Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).</li></ol>

Her præsenterer vi en hurtig og let protokol til generering af in vitro-myelinering ved at fusionere to separate celletypekulturer, Schwann-celler og dorsalrodganglion-eksplanter.
Et kritisk trin i protokollen er dyrkning af DRG-eksplanter, især i de første dage af kulturen. DRG er meget skrøbelige, før et stærkt aksonalt netværk er bygget og skal håndteres meget omhyggeligt, for eksempel når de tages ud af inkubatoren eller under skift af medium. DRG, der løsner sig fra bun...

I det perifere nervesystem (PNS) medieres hurtig informationstransduktion af myelinindpakkede axoner. Myelinering af axoner er afgørende for at muliggøre hurtig udbredelse af elektriske impulser, da ledningshastigheden af nervefibrene korrelerer med axondiameteren og myelintykkelsen1. Sensorisk signalering fra periferien til centralnervesystemet (CNS) er afhængig af aktiveringen af førsteordens sensoriske neuroner, der befinder sig i udvidelser af dorsalroden, kaldet dorsale rodganglier (DRG). Til dannelse og vedligeholdelse af myelin er kontinuerlig kommunikation mellem axoner og Schwann-celler, som er de myeliniserende gliaceller i PNS, obligatorisk2.
Mange sygdomme i PNS forstyrrer transduktionen af information ved enten primær aksonal eller demyeliniserende skade, hvilket resulterer i hypestesi eller dysestesi. Førsteordens sensoriske neuroner har evnen til at regenerere i et omfang efter neuronal skade ved en kompleks interaktion mellem neuronen og omgivende Schwann-celler3. I dette tilfælde kan Schwann-celler gennemgå cellulær omprogrammering for at rydde aksonalt såvel som myelinaffald og fremme aksonal regenerering, hvilket resulterer i remyelinering4. Det er vigtigt at forstå mekanismerne for myelinering i sundhed og sygdom for at finde mulige behandlingsmuligheder for demyeliniserende lidelser i PNS. Myelin kan også blive beskadiget af akut neurotrauma, og tilgange til at fremme myelinering for at fremme funktionel genopretning efter perifer nerveskade er under undersøgelse5.
Vores viden om perifer myelinering har i høj grad haft gavn af myeliniserende cokulturer af Schwann-celler og sensoriske neuroner. Siden de første metoder blev anvendt 6,7,8, er myelinering blevet undersøgt intenst ved brug af forskellige samkultursystemer9,10,11. Her leverer vi en hurtig og let protokol til robust in vitro myelinering af dorsale rodganglionaxoner. Protokollen for Schwann-celleforberedelse er baseret på protokollen af Andersen et al.12, tidligere offentliggjort i Pitarokoili et al.13. Vi bruger Schwann-celler fra unge rotter og embryonale DRG-eksplantatkulturer til samkulturen, hvor myelinering forekommer omkring dag 14. Målet med metoden er at tilvejebringe et system til at undersøge dannelsen af myelin som følge af direkte axon-Schwann-celleinteraktion og at studere modulatorer af PNS-myelinisering. I sammenligning med dissocierede neuronale cellekulturer er DRG-eksplanter mere anatomisk bevaret og danner lange aksonale processer. Kvantificering af det myelinerede axonområde giver en tilstrækkelig aflæsning til myelinering i samkulturen. Metoden er et værdifuldt værktøj til at screene terapeutiske forbindelser for deres potentielle virkning på PNS-myelinering og kan også anvendes som supplement til in vivo-undersøgelser i dyremodeller14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-MBP, rabbit</td>
			<td>Novus Biologicals, Centannial, USA</td>
			<td>ABIN446360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#223;III-tubulin, mouse&#160;</td>
			<td>Biolegend, San Diego, USA</td>
			<td>657402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>A4403-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 100 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>70760212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 1250 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>701186210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 20 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>701114210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 300 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>70765210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany&#160;</td>
			<td>8076.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 100 &#181;M</td>
			<td>BD Bioscience, Heidelberg, Germany</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>5811000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator Heracell</td>
			<td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany&#160;</td>
			<td>51017865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 12 mm</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany&#160;</td>
			<td>P231.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11370-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI fluoromount-G(R)</td>
			<td>Biozol, Eching, Germany</td>
			<td>SBA-0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water (Water Purification System)&#160;</td>
			<td>Millipore, Molsheim, France</td>
			<td>ZLXS5010Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>31331093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>D8537-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>VWR, Radnor, USA&#160;</td>
			<td>1009862500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>F7524</td>
			<td>FCS must be tested for Schwann cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>F6886-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>G1393-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td>5710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>14170138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Incubator</td>
			<td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany&#160;</td>
			<td>51017865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraguard ECO 1.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>51029882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Pan-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P30-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>HIH, Bethesda, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#180;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130042303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Motic, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Motic BA 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio observer 7</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany&#160;</td>
			<td>491917-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR, Radnor, USA&#160;</td>
			<td>630-1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130091632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber&#160;</td>
			<td>Assistant, Erlangen, Germany</td>
			<td>40441 &#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuregulin</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, USA</td>
			<td>100-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>N1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Biozol, Eching, Germany</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon &#916; multidishes, 4 well</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>D6789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics, New Jersey, USA&#160;</td>
			<td>10342243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>4430000018&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>2231300004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 15&#160;mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 50&#160;mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>62547254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction vessels, 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>72690001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Cabinet S2020 1.8</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>51026640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14083-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 10 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861254025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861685001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861253001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>10094-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Discovery.V8</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany&#160;</td>
			<td>495015-0012-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 100, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833902300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 35, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833900300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 60, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833901300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thy-1 Microbeads (MACS Kit)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-094-523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I Collagenase</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>C1639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath type 1008</td>
			<td>GFL, Burgwedel, Germany&#160;</td>
			<td>4285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro myelination of peripheral axons in a coculture of rat dorsal root ganglion explants and schwann cells

Myelineringsprocessen er afgørende for at muliggøre hurtig og tilstrækkelig signaltransduktion i nervesystemet. I det perifere nervesystem engagerer neuroner og Schwann-celler sig i en kompleks interaktion for at kontrollere myelinering af axoner. Forstyrrelser af denne interaktion og nedbrydning af myelinskeden er kendetegnende for inflammatoriske neuropatier og forekommer sekundært i neurodegenerative lidelser. Her præsenterer vi en samkulturmodel af dorsalrodganglioneksplanter og Schwann-celler, som udvikler en robust myelinering af perifere axoner for at undersøge myelineringsprocessen i det perifere nervesystem, studere axon-Schwann-celleinteraktioner og evaluere de potentielle virkninger af terapeutiske midler på hver celletype separat. Metodisk blev dorsale rodganglioner af embryonale rotter (E13.5) høstet, adskilt fra deres omgivende væv og dyrket som hele eksplanter i 3 dage. Schwann-celler blev isoleret fra 3 uger gamle voksne rotter, og iskiasnerverne blev enzymatisk fordøjet. De resulterende Schwann-celler blev renset ved magnetisk aktiveret cellesortering og dyrket under neuregulin- og forskolin-berigede betingelser. Efter 3 dages dorsal rodganglion explant kultur blev 30.000 Schwann-celler tilsat til en dorsal rodganglion explant i et medium indeholdende ascorbinsyre. De første tegn på myelinisering blev påvist på dag 10 af cokultur gennem spredte signaler for myelinbasisk protein i immunocytokemisk farvning. Fra dag 14 og fremefter blev myelinskeder dannet og formeret langs axonerne. Myelinering kan kvantificeres ved myelinbasisk proteinfarvning som et forhold mellem myelineringsområdet og axonarealet for at tage højde for forskellene i aksonal densitet. Denne model giver eksperimentelle muligheder for at studere forskellige aspekter af perifer myelinering in vitro, hvilket er afgørende for at forstå patologien og mulige behandlingsmuligheder for demyelinering og neurodegeneration i inflammatoriske og neurodegenerative sygdomme i det perifere nervesystem.

Myelinering i samkulturen blev vurderet på dag 10, 12, 14, 16, 18 og 20. DRG-eksplanterne og Schwann-cellerne blev farvet for MBP, βIII-tubulin og DAPI. Det aksonale netværk i samkulturen var tæt og ændrede sig ikke synligt i observationsforløbet. De første tegn på myelin, i form af små fragmenter, kunne påvises på dag 10 og steg på dag 12 (figur 2). De MBP-positive områder steg over tid indtil dag 20 af kulturen. Myeliniseringen blev kvantificeret som forholdet mellem MBP- og ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells at JoVE.com

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

I samkultursystemet af dorsale rodganglier og Schwann-celler kan myelinering af det perifere nervesystem undersøges. Denne model giver eksperimentelle muligheder for at observere og kvantificere perifer myelinering og studere virkningerne af forbindelser af interesse på myelinskeden.

In vitro myelinering af perifere axoner i en samkultur af rotte, dorsalrod, ganglioneksplanter og Schwann-celler

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Denne model giver eksperimentelle muligheder for at studere forskellige aspekter af myelinering af det perifere nervesystem in vitro. Det muliggør myelinkvantificering og undersøgelse af Axon-Schwann-celleinteraktioner. Cokulturen udvikler en robust myelinering fra dag 14 og fremefter.DRG-eksplantatkulturerne giver fordelen ved intakt strukturel arkitektur sammenlignet med dissocierede neuronale kulturer. Denne metode er tilgængelig til screening for tropotiske forbindelser for inflammatoriske og neurodegenerative sygdomme i det perifere nervesystem. Til at begynde med steriliseres arbejdsområdet i den aflivede rottes torso med 70% ethanol.Åbn rottens dorsale nederste venstre lem med en saks, og fjern forsigtigt bicepsens lårbensmuskel. Løsn iskiasnerven ved glat højde med buede tang, og sørg for ikke at blå mærker nerven. Brug tang, Overfør de klippede nerver til en vævskulturskål med iskold Leibovitzs L-15-medium med 50 mikrogram pr. Milliliter gentamycin.Brug derefter et stereomikroskop til at fjerne fedt, muskler og blodkar fra nerverne med to par fine tang. Identificer de proksimale og distale ender af iskiasnerven og fjern epineurium med et par fine tang i proksimal til distal retning, mens du holder den proksimale nerveende med det andet par fine tang. Efter overførsel af de rensede nerver til en anden vævskulturskål med iskold Leibovitzs L-15-medium med Gentamycin, driller de isolerede nervefascikler for at adskille og isolere enkelte nervefibre ved hjælp af to par fine tang.Overfør nervefibrene til et 50 ml rør ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette, og tag så lidt medium som muligt. Derefter tilsættes 50 ml leibovitz's L 15-medium med gentamycin til nervefibrene i slew et par gange. Centrifuger røret indeholdende nervefibrene ved 188 G i fem minutter ved fire grader Celsius.Efter fjernelse af supernatanten overføres pellet med det resterende Leibovitz's L-15-medium til en 60 millimeter vævskulturskål. Skyl 50 ml røret med 10 ml af den enzymatiske fordøjelsesopløsning og tilsæt det til nervefiberskålen. Fordel nervefibrene i skålen forsigtigt med spidsen af en pipette.Inkuber ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 18 timer. Og stop den enzymatiske fordøjelse ved at tilføje 10 ml ved 40%FCS i HBSS. Overfør de fordøjede nerver til et 50 ml rør for at centrifugere ved 188 G i 10 minutter ved fire grader Celsius.Efter bortskaffelse af supernatanten genopslæmmes pellet i 10 ml DMEM indeholdende 10 % FCS og 50 mikrogram pr. ml gentamycin. Derefter filtreres cellesuspensionen gennem en 100 mikrometer cellesil. Efter centrifugering ved 188 G i 10 minutter ved fire grader Celsius resuspenderes pelleten med fire ml DMEM indeholdende FCS og gentamycin.Tilsæt to ml af cellesuspensionen til hver af de to polylysin- og lamininbelagte 60 millimeter vævskulturskåle. Inkuber ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, og lad pladerne være uberørte i to dage i inkubatoren. Schwann-cellesuspensionen centrifugeres ved 188 G i 10 minutter ved fire grader Celsius, og cellepelleten resuspenderes i 90 mikroliter magnetisk celleseparationsbuffer pr. En gange 10 til den syvende celle.Derefter tilsættes 10 mikroliter ti1 mikroperler pr. En gange 10 til de syvende celler. Den resuspenderede opløsning inkuberes i 15 minutter i mørke ved otte grader Celsius. Derefter tilsættes to milliliter i magnetcelleseparationsbufferen til cellesuspensionen.Efter centrifugering ved 300 G i 10 minutter ved fire grader Celsius resuspenderes pelleten i 500 mikroliter magnetisk celleseparationsbuffer. Placer den magnetiske celleseparationskolonne i celleseparatoren, og fugt søjlen med en milliliter magnetisk celleseparationsbuffer. Påfør derefter cellerne på det for at opsamle strømmen igennem til centrifugering.Fjern forsigtigt livmoderen fra en aflivet gravid rotte og læg den i en 100 millimeter vævskulturskål med iskold HBSS. Hold livmoderen ved hjælp af buede tang, åbn livmodervæggen med fine tang. Fjern en fostervandspose og åbn den forsigtigt ved at klemme et hul med fine tang.Fjern hurtigt alle embryoner fra livmoderen og overfør dem til en skål fyldt med HBSS. Placer forsigtigt en embryotorso i en 35 millimeter skål fyldt med HBSS. under et stereomikroskop, Åbn den dorsale del af torsoen for at opdele embryoet i to halvdele.Drej den ene halvdel til siden og identificer strengen af dorsale rodganglier eller DRG, der er placeret i linjen ved den dorsale del af embryoet. Klip DRG ud som en hel streng ved hjælp af fine tang og mikrosaks. Efter at have anbragt DRG i en frisk skål fyldt med to ml HBSS, Adskil en enkelt DRG fra det resterende væv ved hjælp af fine tang og mikrosaks.Tag en 4-brøndsplade indeholdende 190 mikroliter DRG-vækstmedium i hver brønd, og overfør forsigtigt en enkelt DRG til midten af hver brønd ved hjælp af fine pincet og en spatel. Placer derefter DRG-eksplantatkulturerne i inkubatoren ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Den næste dag tilsættes forsigtigt 50 mikroliter DRG-vækstmedium til hver brønd og observerer DRG-udplantningsvedhæftning og axonudvækst ved hjælp af et mikroskop dagligt.Til samdyrkning på dag tre af DRG-eksplantagekulturen skal DRG-vækstmediet udskiftes forsigtigt med 250 mikroliter co-kulturmedium indeholdende 30.000 schwannceller pr. Brønd. For at udføre immuncytokemisk farvning skal cellerne på dækslerne fastgøres ved at inkubere DPBS-vaskede celler i 4% paraformaldehyd i 10 minutter. Tag billeder af de immuncytokemisk farvede prøver i otte definerede regioner omkring DRG-eksplantatet i midten ved hjælp af et omvendt mikroskop.Udseendet af schwann-celler med en langstrakt og spindelformet morfologi og de tynde DRG-axoner i en co-kultur er afbildet her. Myelinering i co-kulturen blev vurderet på forskellige dage ved farvning af DRG-eksplanter og Schwann-celler for myelinbasisk protein eller MBP, beta tre tubulin og DAPI. Det aksonale netværk i samkulturen var tæt og ændrede sig ikke synligt i observationsforløbet.De første tegn på myelinering var synlige på dag 10 og 12 i samkulturen. Fra dag 14 var MVP-signalet mere udtalt, og myelin-indpakkede axoner blev detekteret. Myeliniseringen steg med co-kulturtiden indtil dag 20.Myeliniseringen blev kvantificeret som et forhold mellem MVP og beta tre tubulinpositive områder. Der blev observeret en signifikant stigning i myelinering på dag 18 og 20 sammenlignet med dag 10. DRG explant kulturer er skrøbelige, og skal håndteres forsigtigt.For eksempel, når det tages ud af inkubatoren eller under medium forandring og fiksering. Genekspressionsanalyse af co-kulturprøver kan dannes for at undersøge myelin mere detaljeret. Her opdagede vi myelinmarkørerne PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 på dag 22.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetisk Undersøgelse af Axon Regeneration med dyrkede voksne dorsale rodganglie neuroner

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsalrodsganglier neuroner og differentierede adipøst afledte stamceller: An<em&gt; In vitro</em&gt; Co-kultur Model til Uddannelse Perifere nerveregenerering

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In vitro Modellering af Kræft Neural Invasion: Dorsal rodganglie Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

En tilgang til Forøge Justering og myelination af Dorsal rodganglieneuroner

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsalrodsganglion Injektion og Dorsal Root Crush Skade som en model for Sanse Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Laminotomy for lumbal dorsalrods Ganglion adgang og injektion i svin

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analyse af immunceller i enkelt ischiadicus nerver og dorsalrods Ganglion fra et enkelt museklik bruge flowcytometri

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Behandlende pattedyr Axon regenerering: In Vivo elektroporation af voksen mus dorsalrods Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Hurtig isolering af dorsale Rodganglion makrofager

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...