Name: in vitro myelination of peripheral axons in a coculture of rat dorsal root ganglion explants and schwann cells
Uploaded: 2023-02-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells at JoVE.com

Vi takker Prof. Dr. Ralf Gold og PD Dr. Gisa Ellrichmann for deres råd og støtte.

Alle prosedyrer ble utført i samsvar med De europeiske fellesskaps rådsdirektiv for stell og bruk av forsøksdyr.
1. Schwann cellekultur
<ol><li>Belegg for Schwann cellekultur<ol><li>Belegg cellekulturfatene under sterile forhold. Påfør 2 ml 0,01 % poly-L-lysin (PLL) på to 60 mm vevskulturretter (TC) hver og rug over natten ved 4 °C.</li>
		<li>Fjern PLL, vask TC-oppvasken 2x med destillert vann og inkuber med 2 ml 1 μg/cm2 laminin over natten ved 4 °C. V...

<ol>
	<li>Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+cell+body+size,+axon+size,+and+signal+conduction+velocity+for+individually+labelled+dorsal+root+ganglion+cells+in+the+cat.">Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).</li><li>Taveggia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells-axon+interaction+in+myelination.">Schwann cells-axon interaction in myelination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).</li><li>Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+regeneration+and+muscle+reinnervation.">Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).</li><li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury.">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).</li><li>Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+injury+and+myelination:+Potential+therapeutic+strategies.">Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).</li><li>Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+Schwann+cell+proliferation.+III.+Evidence+for+the+surface+localization+of+the+neurite+mitogen.">Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen.</a> The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).</li><li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells.">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li><li>Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+axon-related+Schwann+cells+in+vitro.+I.+Ascorbic+acid+regulates+basal+lamina+assembly+and+myelin+formation.">Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation.</a> The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).</li><li>Paivalainen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+in+mouse+dorsal+root+ganglion/Schwann+cell+cocultures.">Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140 (4), 898-913 (2017).</li><li>Taveggia, C., Bolino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRG+neuron/Schwann+cells+myelinating+cocultures.">DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).</li><li>Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+versatile+method+for+the+isolation,+purification+and+cryogenic+storage+of+Schwann+cells+from+adult+rodent+nerves.">A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves.</a> Scientific Reports. 6, 31781 (2016).</li><li>Pitarokoili, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+triamcinolone+acetonide+exerts+anti-inflammatory+effects+on+Lewis+rat+experimental+autoimmune+neuritis+and+direct+anti-oxidative+effects+on+Schwann+cells.">Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).</li><li>Gr&#252;ter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+and+anti-oxidative+effect+of+the+direct+TRPV1+receptor+agonist+capsaicin+on+Schwann+cells.">Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).</li><li>Lehmann, H. C., H&#246;ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+a+therapeutic+target+for+peripheral+neuropathies.">Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies.</a> CNS &amp; Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).</li><li>Joshi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Schwann+cell+plasticity+in+chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy+(CIDP).">Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP).</a> Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).</li><li>Klimas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+immunomodulatory+effects+of+bortezomib+in+experimental+autoimmune+neuritis.">Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis.</a> Brain Communications. 3 (4), (2021).</li><li>Szepanowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA1+signaling+drives+Schwann+cell+dedifferentiation+in+experimental+autoimmune+neuritis.">LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis.</a> Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).</li></ol>

Her presenterer vi en rask og lettvint protokoll for generering av in vitro myelinisering ved å slå sammen to separate celletypekulturer, Schwann-celler og dorsale rotganglioneksplanter.
Et kritisk trinn i protokollen er dyrking av DRG-eksplanter, spesielt i kulturens første dager. DRG er svært skjøre før et sterkt aksonalt nettverk er bygget og må håndteres svært nøye, for eksempel når det tas ut av inkubatoren eller under skifte av medium. DRG som løsner fra bunnen av br...

I det perifere nervesystemet (PNS) medieres rask informasjonstransduksjon av myelininnpakkede aksoner. Myeliniseringen av aksoner er avgjørende for å muliggjøre rask forplantning av elektriske impulser, siden ledningshastigheten til nervefibrene korrelerer med aksondiameteren og myelintykkelsen1. Sensorisk signalering fra periferien til sentralnervesystemet (CNS) er avhengig av aktivering av førsteordens sensoriske nevroner som ligger i utvidelser av dorsalroten, kalt dorsalrotganglier (DRG). For dannelse og vedlikehold av myelin, er kontinuerlig kommunikasjon mellom aksoner og Schwann-celler, som er de myeliniserende Glia-cellene i PNS, obligatorisk2.
Mange sykdommer i PNS forstyrrer transduksjonen av informasjon ved enten primær aksonal eller demyeliniserende skade, noe som resulterer i hypestesi eller dysestesi. Førsteordens sensoriske nevroner har evnen til å regenerere i en grad etter nevronskader, ved et komplekst samspill mellom nevronet og omkringliggende Schwann-celler3. I dette tilfellet kan Schwann-celler gjennomgå cellulær omprogrammering for å fjerne aksonalt så vel som myelinrester og fremme aksonal regenerering, noe som resulterer i remyelinisering4. Å forstå mekanismene for myelinisering i helse og sykdom er viktig for å finne mulige behandlingsalternativer for demyeliniserende lidelser i PNS. Myelin kan også bli skadet av akutt nevrotrauma, og tilnærminger for å fremme myelinisering for å fremme funksjonell gjenoppretting etter perifer nerveskade er under utredning5.
Vår kunnskap om perifer myelinisering har i stor grad dratt nytte av myeliniserende kokulturer av Schwann-celler og sensoriske nevroner. Siden de første tilnærmingene ble brukt 6,7,8, har myelinisering blitt studert intenst med bruk av forskjellige kokultursystemer9,10,11. Her gir vi en rask og enkel protokoll for robust in vitro myelinisering av dorsale ganglionaksoner. Protokollen for Schwann-cellepreparering er basert på protokollen til Andersen et al.12, tidligere publisert i Pitarokoili et al.13. Vi bruker Schwann-celler avledet fra unge rotter og embryonale DRG-eksplantkulturer for kokulturen, der myelinisering skjer rundt dag 14. Målet med metoden er å gi et system for å undersøke dannelsen av myelin som et resultat av direkte akson-Schwann-celleinteraksjon, og å studere modulatorer av PNS myelinisering. I forhold til dissosierte nevroncellekulturer er DRG-eksplanter mer anatomisk bevart og danner lange aksonale prosesser. Kvantifisering av det myeliniserte aksonarealet gir en tilstrekkelig avlesning for myelinisering i kokulturen. Metoden er et verdifullt verktøy for å screene terapeutiske forbindelser for deres potensielle effekt på PNS-myelinisering, og kan også brukes i tillegg til in vivo-studier i dyremodeller14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-MBP, rabbit</td>
			<td>Novus Biologicals, Centannial, USA</td>
			<td>ABIN446360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#223;III-tubulin, mouse&#160;</td>
			<td>Biolegend, San Diego, USA</td>
			<td>657402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>A4403-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 100 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>70760212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 1250 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>701186210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 20 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>701114210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 300 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>70765210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany&#160;</td>
			<td>8076.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 100 &#181;M</td>
			<td>BD Bioscience, Heidelberg, Germany</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>5811000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator Heracell</td>
			<td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany&#160;</td>
			<td>51017865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 12 mm</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany&#160;</td>
			<td>P231.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11370-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI fluoromount-G(R)</td>
			<td>Biozol, Eching, Germany</td>
			<td>SBA-0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water (Water Purification System)&#160;</td>
			<td>Millipore, Molsheim, France</td>
			<td>ZLXS5010Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>31331093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>D8537-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>VWR, Radnor, USA&#160;</td>
			<td>1009862500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>F7524</td>
			<td>FCS must be tested for Schwann cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>F6886-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>G1393-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td>5710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>14170138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Incubator</td>
			<td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany&#160;</td>
			<td>51017865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraguard ECO 1.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>51029882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Pan-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P30-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>HIH, Bethesda, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#180;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130042303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Motic, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Motic BA 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio observer 7</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany&#160;</td>
			<td>491917-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR, Radnor, USA&#160;</td>
			<td>630-1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130091632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber&#160;</td>
			<td>Assistant, Erlangen, Germany</td>
			<td>40441 &#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuregulin</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, USA</td>
			<td>100-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>N1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Biozol, Eching, Germany</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon &#916; multidishes, 4 well</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>D6789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics, New Jersey, USA&#160;</td>
			<td>10342243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>4430000018&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>2231300004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 15&#160;mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 50&#160;mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>62547254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction vessels, 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>72690001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Cabinet S2020 1.8</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>51026640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14083-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 10 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861254025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861685001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861253001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>10094-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Discovery.V8</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany&#160;</td>
			<td>495015-0012-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 100, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833902300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 35, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833900300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 60, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833901300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thy-1 Microbeads (MACS Kit)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-094-523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I Collagenase</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>C1639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath type 1008</td>
			<td>GFL, Burgwedel, Germany&#160;</td>
			<td>4285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro myelination of peripheral axons in a coculture of rat dorsal root ganglion explants and schwann cells

Myeliniseringsprosessen er avgjørende for å muliggjøre rask og tilstrekkelig signaltransduksjon i nervesystemet. I det perifere nervesystemet engasjerer nevroner og Schwann-celler seg i en kompleks interaksjon for å kontrollere myeliniseringen av axoner. Forstyrrelser av denne interaksjonen og nedbrytningen av myelinskjeden er kjennetegn ved inflammatoriske nevropatier og forekommer sekundært i nevrodegenerative lidelser. Her presenterer vi en kokulturmodell av dorsale rotganglioneksplanter og Schwann-celler, som utvikler en robust myelinisering av perifere aksoner for å undersøke myeliniseringsprosessen i det perifere nervesystemet, studere akson-Schwann-celleinteraksjoner og evaluere potensielle effekter av terapeutiske midler på hver celletype separat. Metodologisk ble dorsale rotganglioner av embryonale rotter (E13.5) høstet, dissosiert fra deres omkringliggende vev og dyrket som hele eksplanter i 3 dager. Schwann-celler ble isolert fra 3 uker gamle voksne rotter, og isjiasnervene ble enzymatisk fordøyd. De resulterende Schwann-cellene ble renset ved magnetisk aktivert cellesortering og dyrket under neuregulin og forskolinberikede forhold. Etter 3 dager med dorsalrotganglion-eksplantkultur ble 30 000 Schwann-celler tilsatt til en dorsalrotganglion-eksplant i et medium inneholdende askorbinsyre. De første tegn til myelinisering ble påvist dag 10 i kokultur, gjennom spredte signaler for myelinbasisk protein i immuncytokjemisk farging. Fra dag 14 og fremover ble myelinskjede dannet og forplantet langs aksonene. Myelinisering kan kvantifiseres ved myelinbasisk proteinfarging som et forhold mellom myeliniseringsområdet og aksonområdet, for å ta hensyn til forskjellene i aksonal tetthet. Denne modellen gir eksperimentelle muligheter til å studere ulike aspekter ved perifer myelinisering in vitro, noe som er avgjørende for å forstå patologien til og mulige behandlingsmuligheter for demyelinisering og nevrodegenerasjon ved inflammatoriske og nevrodegenerative sykdommer i det perifere nervesystemet.

Myelinisering i kokulturen ble vurdert på dagene 10, 12, 14, 16, 18 og 20. DRG-eksplantene og Schwann-cellene ble farget for MBP, βIII-tubulin og DAPI. Det aksonale nettverket i kokulturen var tett og endret seg ikke synlig i løpet av observasjonen. De første tegnene på myelin, i form av små fragmenter, kunne påvises dag 10 og økte dag 12 (figur 2). De MBP-positive områdene økte over tid frem til dag 20 i kulturen. Myeliniseringen ble kvantifisert som et forhold mellom de positive ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells at JoVE.com

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

I kokultursystemet av dorsale rotganglier og Schwann-celler kan myelinisering av det perifere nervesystemet studeres. Denne modellen gir eksperimentelle muligheter til å observere og kvantifisere perifer myelinisering og å studere effekten av forbindelser av interesse på myelinskjeden.

in vitro myelinisering av perifere aksoner i en kokultur av rotte dorsalrot ganglion eksplanter og Schwann-celler

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Denne modellen gir eksperimentelle muligheter til å studere ulike aspekter ved myelinisering av det perifere nervesystemet in vitro. Det muliggjør myelinkvantifisering og undersøkelse av Axon-Schwann-celleinteraksjoner. Samkulturen utvikler en robust myelinisering fra dag 14 og utover.DRG-eksplantekulturene gir fordelen av intakt strukturell arkitektur i forhold til dissosierte nevronkulturer. Denne metoden er tilgjengelig for å skjerme for tropotiske forbindelser for inflammatoriske og nevrodegenerative sykdommer i det perifere nervesystemet. For å begynne, steriliser arbeidsområdet i den avlivede rottens torso med 70% etanol.Åpne rottens dorsale nedre venstre lem med saks, og fjern forsiktig bicepsens femorøse muskel. Løsne isjiasnerven ved jevn høyde med buede tang, og sørg for ikke å blåse nerven. Ved hjelp av tang, Overfør klippet nerver til et vev kultur tallerken med iskald Leibovitz L-15 medium med 50 mikrogram per milliliter gentamycin.Deretter, ved hjelp av et stereomikroskop, fjern fett, muskler og blodkar fra nervene med to par fine tang. Identifiser de proksimale og distale endene av isjiasnerven og fjern epineurium med ett par fine tang i proksimal til distal retning mens du holder den proksimale nerveenden med det andre paret fine tang. Etter å ha overført de rensede nervene til en annen vevskulturskål med iskald Leibovitz' L-15-medium med Gentamycin, erter du de isolerte nervefasciklene for å skille og isolere enkeltnervefibre ved hjelp av to par fine tang.Overfør nervefibrene til et 50 milliliter rør ved hjelp av en 10 milliliter serologisk pipette, og ta opp så lite medium som mulig. Deretter tilsettes 50 ml leibovitzs L15-medium med gentamycin til nervefibrene i sving noen ganger. Sentrifuger røret som inneholder nervefibrene ved 188 G i fem minutter ved fire grader Celsius.Etter å ha fjernet supernatanten, overfør pelleten med den gjenværende Leibovitzs L-15-medium til en 60 millimeter vevskulturskål. Skyll 50 milliliters røret med 10 ml av den enzymatiske fordøyelsesløsningen og legg den til nervefibrene. Fordel nervefibrene i parabolen forsiktig med spissen av en pipette.Inkuber ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 18 timer. Og stopp den enzymatiske fordøyelsen ved å legge til 10 milliliter ved 40% FCS i HBSS. Overfør fordøyde nerver til et 50 milliliter rør til sentrifuge ved 188 G i 10 minutter ved fire grader Celsius.Etter å ha kastet supernatanten, suspenderes pelleten i 10 ml DMEM som inneholder 10% FCS og 50 mikrogram per milliliter gentamycin. Deretter filtrerer du cellesuspensjonen gjennom en 100 mikrometer cellesil. etter sentrifugering ved 188 G i 10 minutter ved fire grader Celsius, resuspendere pelleten med fire milliliter DMEM inneholdende FCS og gentamycin.Tilsett to milliliter av cellesuspensjonen til hver av de to polylysin- og lamininbelagte 60 millimeter vevskulturfatene. Inkubere ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid, forlater platene uberørt i to dager i inkubatoren. Sentrifuge Schwann-cellesuspensjonen ved 188 G i 10 minutter ved fire grader Celsius, og suspendere cellepelleten i 90 mikroliter magnetisk celleseparasjonsbuffer per en ganger 10 til den syvende cellen.Deretter tilsettes 10 mikroliter ti1 mikroperler per gang 10 til de syvende cellene. Inkuber den re suspenderte løsningen i 15 minutter i mørket ved åtte grader Celsius. Deretter legger du til to milliliter i magnetisk celleseparasjonsbuffer til cellesuspensjonen.Etter sentrifugering ved 300 G i 10 minutter ved fire grader Celsius, resuspendere pelleten i 500 mikroliter magnetisk celleseparasjonsbuffer. Plasser kolonnen for magnetisk celleseparasjon i celleseparatoren, og fukt kolonnen med en milliliter av den magnetiske celleseparasjonsbufferen. Påfør deretter cellene på den for å samle strømmen gjennom for sentrifugering.Fjern forsiktig livmoren fra en avlivet gravid rotte og legg den i en 100 millimeter vevskulturskål med iskald HBSS. Hold livmoren ved hjelp av buede tang, åpne livmorveggen med fine tang. Fjern en fostersekk og åpne den forsiktig ved å klemme et hull med fine tang.Fjern raskt alle embryoer fra livmoren og overfør dem til en tallerken fylt med HBSS. Legg forsiktig en embryotorso i en 35 millimeter tallerken fylt med HBSS. under et stereomikroskop, Åpne den dorsale delen av torso for å dele embryoet i to halvdeler.Vri den ene halvdelen til siden og identifiser strengen av dorsale rotganglier, eller DRG, som ligger i linjen ved den dorsale delen av embryoet. Klipp ut DRG som en hel tråd ved hjelp av fin tang og mikrosaks. Etter å ha plassert DRG i en fersk tallerken fylt med to milliliter HBSS, Skill en enkelt DRG fra det gjenværende vevet ved hjelp av fin tang og mikrosaks.Ta en 4-brønnplate som inneholder 190 mikroliter DRG-vekstmedium i hver brønn, og overfør forsiktig en enkelt DRG til midten av hver brønn ved hjelp av fine tang og en slikkepott. Deretter plasseres DRG-eksplantkulturer i inkubatoren ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Neste dag, tilsett forsiktig 50 mikroliter av DRG-vekstmediet til hver brønn og observer DRG-eksplantadherens og aksonutvekst ved hjelp av et mikroskop daglig.For samdyrking på dag tre av DRG-eksplantkulturen, erstatt forsiktig DRG-vekstmediet med 250 mikroliter av kokulturmediet som inneholder 30.000 schwannceller per brønn. For å utføre immunocytokjemisk farging, fest cellene på dekselslippene ved å inkubere DPBS-vaskede celler i 4% paraformaldehyd i 10 minutter. Ta bilder av de immunocytokjemisk fargede prøvene på åtte definerte regioner rundt DRG-eksplanten i midten ved hjelp av et invertert mikroskop.Utseendet til schwann-celler med en langstrakt og spindelformet morfologi og de tynne DRG-aksonene i en samkultur er avbildet her. Myelinisering i kokulturen ble vurdert på forskjellige dager ved å farge DRG-eksplanter og Schwann-celler for myelinbasisk protein eller MBP, beta tre tubulin og DAPI. Det aksonale nettverket i samkulturen var tett, og endret seg ikke synlig i løpet av observasjonen.De første tegnene på myelinisering var synlige på dag 10 og 12 i samkultur. Fra dag 14 var MVP-signalet mer uttalt, og myelininnpakkede aksoner ble detektert. Myeliniseringen økte med samkulturtiden frem til dag 20.Myeliniseringen ble kvantifisert som et forhold mellom de positive områdene MVP og beta tre tubulin. En signifikant økning i myelinisering ble observert på dag 18 og 20 sammenlignet med dag 10. DRG-eksplantkulturer er skjøre, og må håndteres nøye.For eksempel, når det tas ut av inkubatoren eller under mediumendring og fiksering. Genekspresjonsanalyse av kokulturprøver kan dannes for å undersøke myelin i større detalj. Her oppdaget vi myelinmarkørene PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 på dag 22.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetisk studie av Axon Regeneration med dyrkede Voksen røttene ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal rotganglier Nerveceller og Differensiert Adipose-avledet stamceller: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-kultur modell for å studere Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In vitro modellering av kreft Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

En tilnærming for å forbedre Justering og myelination av Dorsal Root ganglion nevroner

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsalrotganglion Injeksjon og rygg Root knusningsskade som en modell for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Laminotomy for lumbale Dorsal Root Ganglion og injeksjon i svin

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analyse av immunceller i enkelt Sciatic nerver og Dorsal Root Ganglion fra en enkelt mus med flowcytometri

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Undersøker pattedyr Axon gjenfødelse: I Vivo Electroporation av voksen mus Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Rask isolering av rygg rot Ganglion makrofager

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...