Name: in vitro myelination of peripheral axons in a coculture of rat dorsal root ganglion explants and schwann cells
Uploaded: 2023-02-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells at JoVE.com

Мы благодарим профессора д-ра Ральфа Голда и приват-доцента д-ра Гизу Эллрихманн за их советы и поддержку.

Все процедуры были выполнены в соответствии с Директивой Совета Европейских сообществ по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Шванновская клеточная культура
<ol><li>Покрытие для шванновской клеточной культуры<ol><li>Покройте чашки для клеточных культур ...

<ol>
	<li>Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+cell+body+size,+axon+size,+and+signal+conduction+velocity+for+individually+labelled+dorsal+root+ganglion+cells+in+the+cat.">Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).</li><li>Taveggia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells-axon+interaction+in+myelination.">Schwann cells-axon interaction in myelination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).</li><li>Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+regeneration+and+muscle+reinnervation.">Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).</li><li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury.">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).</li><li>Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+injury+and+myelination:+Potential+therapeutic+strategies.">Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).</li><li>Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+Schwann+cell+proliferation.+III.+Evidence+for+the+surface+localization+of+the+neurite+mitogen.">Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen.</a> The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).</li><li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells.">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li><li>Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+axon-related+Schwann+cells+in+vitro.+I.+Ascorbic+acid+regulates+basal+lamina+assembly+and+myelin+formation.">Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation.</a> The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).</li><li>Paivalainen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+in+mouse+dorsal+root+ganglion/Schwann+cell+cocultures.">Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140 (4), 898-913 (2017).</li><li>Taveggia, C., Bolino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRG+neuron/Schwann+cells+myelinating+cocultures.">DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).</li><li>Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+versatile+method+for+the+isolation,+purification+and+cryogenic+storage+of+Schwann+cells+from+adult+rodent+nerves.">A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves.</a> Scientific Reports. 6, 31781 (2016).</li><li>Pitarokoili, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+triamcinolone+acetonide+exerts+anti-inflammatory+effects+on+Lewis+rat+experimental+autoimmune+neuritis+and+direct+anti-oxidative+effects+on+Schwann+cells.">Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).</li><li>Gr&#252;ter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+and+anti-oxidative+effect+of+the+direct+TRPV1+receptor+agonist+capsaicin+on+Schwann+cells.">Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).</li><li>Lehmann, H. C., H&#246;ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+a+therapeutic+target+for+peripheral+neuropathies.">Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies.</a> CNS &amp; Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).</li><li>Joshi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Schwann+cell+plasticity+in+chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy+(CIDP).">Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP).</a> Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).</li><li>Klimas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+immunomodulatory+effects+of+bortezomib+in+experimental+autoimmune+neuritis.">Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis.</a> Brain Communications. 3 (4), (2021).</li><li>Szepanowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA1+signaling+drives+Schwann+cell+dedifferentiation+in+experimental+autoimmune+neuritis.">LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis.</a> Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).</li></ol>

Здесь мы представляем быстрый и простой протокол генерации миелинизации in vitro путем слияния двух отдельных культур клеточного типа, шванновских клеток и эксплантатов ганглиев дорсальных корешков.
Важнейшим этапом протокола является выращивание эксплантатов ДРГ, ?...

В периферической нервной системе (ПНС) быстрая информационная трансдукция опосредована аксонами, обернутыми миелином. Миелинизация аксонов необходима для обеспечения быстрого распространения электрических импульсов, поскольку скорость проводимости нервных волокон коррелирует с диаметром аксона и толщиной миелина1. Сенсорная передача сигналов от периферии к центральной нервной системе (ЦНС) основана на активации сенсорных нейронов первого порядка, которые находятся в расширениях дорсального корешка, называемых ганглиями дорсальных корешков (DRG). Для образования и поддержания миелина необходима непрерывная связь между аксонами и шванновскими клетками, которые являются миелинизирующими глиальными клетками в ПНС.2.
Многие заболевания ПНС нарушают трансдукцию информации либо первичным аксональным, либо демиелинизирующим повреждением, что приводит к гипестезии или дизестезии. Сенсорные нейроны первого порядка обладают способностью к регенерации до некоторой степени после повреждения нейронов путем сложного взаимодействия между нейроном и окружающими шванновскими клетками3. В этом случае шванновские клетки могут подвергаться клеточному перепрограммированию, чтобы очистить аксональный и миелиновый мусор и способствовать регенерации аксонов, что приводит к ремиелинизации4. Понимание механизмов миелинизации в здоровье и заболевании важно для того, чтобы найти возможные варианты лечения демиелинизирующих расстройств ПНС. Миелин также может быть поврежден острой нейротравмой, и в настоящее время исследуются подходы, способствующие миелинизации для ускорения функционального восстановления после повреждения периферических нервов5.
Наши знания о периферической миелинизации в значительной степени выиграли от миелинизирующих кокультур шванновских клеток и сенсорных нейронов. С тех пор, как были применены первые подходы 6,7,8, миелинизация интенсивно изучалась с использованием различных систем кокультур9,10,11. Здесь мы предлагаем быстрый и простой протокол для надежной миелинизации in vitro аксонов ганглиев дорсальных корешков. Протокол подготовки шванновских клеток основан на протоколе Andersen et al.12, ранее опубликованном в Pitarokoili et al.13. Мы используем шванновские клетки, полученные от молодых крыс, и эмбриональные культуры эксплантатов DRG для совместной культуры, в которой миелинизация происходит примерно на 14-й день. Целью метода является создание системы для исследования образования миелина в результате прямого взаимодействия аксон-шванновских клеток, а также изучение модуляторов миелинизации ПНС. По сравнению с диссоциированными культурами нейрональных клеток, эксплантаты DRG более анатомически сохранены и образуют длинные аксональные отростки. Количественная оценка площади миелинизированного аксона обеспечивает достаточное считывание миелинизации в кокультуре. Этот метод является ценным инструментом для скрининга терапевтических соединений на предмет их потенциального влияния на миелинизацию ПНС, а также может быть использован в дополнение к исследованиям in vivo на животных моделях14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-MBP, rabbit</td>
			<td>Novus Biologicals, Centannial, USA</td>
			<td>ABIN446360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#223;III-tubulin, mouse&#160;</td>
			<td>Biolegend, San Diego, USA</td>
			<td>657402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>A4403-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 100 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>70760212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 1250 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>701186210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 20 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>701114210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 300 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>70765210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany&#160;</td>
			<td>8076.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 100 &#181;M</td>
			<td>BD Bioscience, Heidelberg, Germany</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>5811000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator Heracell</td>
			<td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany&#160;</td>
			<td>51017865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 12 mm</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany&#160;</td>
			<td>P231.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11370-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI fluoromount-G(R)</td>
			<td>Biozol, Eching, Germany</td>
			<td>SBA-0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water (Water Purification System)&#160;</td>
			<td>Millipore, Molsheim, France</td>
			<td>ZLXS5010Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>31331093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>D8537-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>VWR, Radnor, USA&#160;</td>
			<td>1009862500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>F7524</td>
			<td>FCS must be tested for Schwann cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>F6886-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>G1393-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td>5710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>14170138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Incubator</td>
			<td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany&#160;</td>
			<td>51017865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraguard ECO 1.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>51029882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Pan-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P30-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>HIH, Bethesda, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#180;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130042303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Motic, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Motic BA 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio observer 7</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany&#160;</td>
			<td>491917-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR, Radnor, USA&#160;</td>
			<td>630-1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130091632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber&#160;</td>
			<td>Assistant, Erlangen, Germany</td>
			<td>40441 &#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuregulin</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, USA</td>
			<td>100-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>N1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Biozol, Eching, Germany</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon &#916; multidishes, 4 well</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>D6789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics, New Jersey, USA&#160;</td>
			<td>10342243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>4430000018&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>2231300004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 15&#160;mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 50&#160;mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>62547254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction vessels, 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>72690001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Cabinet S2020 1.8</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>51026640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14083-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 10 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861254025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861685001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861253001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>10094-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Discovery.V8</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany&#160;</td>
			<td>495015-0012-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 100, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833902300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 35, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833900300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 60, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833901300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thy-1 Microbeads (MACS Kit)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-094-523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I Collagenase</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>C1639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath type 1008</td>
			<td>GFL, Burgwedel, Germany&#160;</td>
			<td>4285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro myelination of peripheral axons in a coculture of rat dorsal root ganglion explants and schwann cells

Процесс миелинизации необходим для обеспечения быстрой и достаточной передачи сигнала в нервной системе. В периферической нервной системе нейроны и шванновские клетки участвуют в сложном взаимодействии, чтобы контролировать миелинизацию аксонов. Нарушения этого взаимодействия и разрушение миелиновой оболочки являются признаками воспалительных невропатий и возникают вторично при нейродегенеративных расстройствах. Здесь мы представляем модель кокультуры ганглиозных эксплантатов дорсальных корешков и шванновских клеток, которая развивает надежную миелинизацию периферических аксонов для исследования процесса миелинизации в периферической нервной системе, изучения взаимодействия аксон-шванновских клеток и оценки потенциального воздействия терапевтических агентов на каждый тип клеток в отдельности. Методологически ганглии дорсальных корешков эмбриональных крыс (E13.5) собирали, диссоциировали от окружающих их тканей и культивировали как целые эксплантаты в течение 3 дней. Шванновские клетки были выделены от 3-недельных взрослых крыс, а седалищные нервы были ферментативно переварены. Полученные шванновские клетки очищали магнитно-активированной сортировкой клеток и культивировали в условиях, обогащенных нейрегулином и форсколином. После 3 дней культивирования ганглиозной эксплантата дорсального корешка 30 000 шванновских клеток добавляли к одному ганглиозному эксплантату дорсального корня в среде, содержащей аскорбиновую кислоту. Первые признаки миелинизации были обнаружены на 10-й день кокультуры через рассеянные сигналы к основному белку миелина при иммуноцитохимическом окрашивании. Начиная с 14-го дня, миелиновые оболочки формировались и размножались вдоль аксонов. Миелинизация может быть количественно определена окрашиванием основного белка миелина как отношение площади миелинизации и площади аксонов, чтобы учесть различия в плотности аксонов. Данная модель предоставляет экспериментальные возможности для изучения различных аспектов периферической миелинизации in vitro, что имеет решающее значение для понимания патологии и возможных возможностей лечения демиелинизации и нейродегенерации при воспалительных и нейродегенеративных заболеваниях периферической нервной системы.

Миелинизацию в кокультуре оценивали на 10, 12, 14, 16, 18 и 20 сутки. Эксплантаты DRG и шванновские клетки окрашивали на MBP, βIII-тубулин и DAPI. Аксональная сеть в кокультуре была плотной и не изменялась заметно во время наблюдения. Первые признаки миелина в виде мелких фрагментов были обнаружены на 1...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells at JoVE.com

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

В системе кокультуры ганглиев дорсальных корешков и шванновских клеток можно изучать миелинизацию периферической нервной системы. Эта модель предоставляет экспериментальные возможности для наблюдения и количественной оценки периферической миелинизации и изучения влияния интересующих соединений на миелиновую оболочку.

Миелинизация периферических аксонов in vitro в кокультуре ганглиозных эксплантатов дорсальных корешков крыс и шванновских клеток

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Данная модель предоставляет экспериментальные возможности для изучения различных аспектов миелинизации периферической нервной системы in vitro. Это позволяет количественно определять миелин и исследовать взаимодействия аксон-шванновских клеток. Совместная культура развивает устойчивую миелинизацию с 14-го дня.Культуры эксплантатов DRG обеспечивают преимущество интактной структурной архитектуры по сравнению с диссоциированными нейронными культурами. Этот метод доступен для скрининга тропотических соединений при воспалительных и нейродегенеративных заболеваниях периферической нервной системы. Для начала простерилизуйте рабочую зону в туловище усыпленной крысы 70% этанолом.Вскройте ножницами спинную нижнюю левую конечность крысы и осторожно удалите бедренную мышцу бицепса. Ослабьте седалищный нерв путем плавного возвышения с помощью изогнутых щипцов, чтобы не ушибнуть нерв. Используя щипцы, перенесите обрезанные нервы в чашку для культивирования тканей с ледяной средой L-15 Лейбовица с 50 микрограммами на миллилитр гентамицина.Затем, используя стереомикроскоп, удалите жир, мышцы и кровеносные сосуды из нервов с помощью двух пар тонких щипцов. Определите проксимальный и дистальный концы седалищного нерва и удалите эпиневрий одной парой тонких щипцов в проксимальном и дистальном направлении, удерживая проксимальный нервный конец второй парой тонких щипцов. После переноса очищенных нервов в другую чашку для культивирования тканей с ледяной средой L-15 Лейбовица с гентамицином дразните изолированные нервные пучки, чтобы разделить и изолировать отдельные нервные волокна с помощью двух пар тонких щипцов.Перенесите нервные волокна в 50-миллилитровую трубку с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров и возьмите как можно меньше среды. Затем добавьте 50 миллилитров среды Лейбовица L 15 с гентамицином к нервным волокнам несколько раз. Центрифугируйте пробирку, содержащую нервные волокна при 188 G, в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.После удаления надосадочной жидкости перенесите гранулу с оставшейся средой L-15 Лейбовица в 60-миллиметровую чашку для культивирования тканей. Промойте 50-миллилитровую пробирку 10 миллилитрами ферментативного раствора для сбраживания и добавьте ее в посуду для нервных волокон. Аккуратно распределите нервные волокна в посуде кончиком пипетки.Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 18 часов. И остановите ферментативное переваривание, добавив 10 миллилитров при 40% FCS в HBSS. Перенесите переваренные нервы в 50-миллилитровую пробирку в центрифугу при 188 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах DMEM, содержащем 10% FCS и 50 микрограммов на миллилитр гентамицина. Затем отфильтруйте клеточную суспензию через 100-микрометровый сетчатый фильтр. после центрифугирования при 188 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия повторно суспендировать гранулу четырьмя миллилитрами DMEM, содержащим FCS и гентамицин.Добавьте два миллилитра клеточной суспензии в каждую из двух 60-миллиметровых чашк для культивирования тканей, покрытых полилизином и ламинином. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, оставляя пластины нетронутыми в течение двух дней в инкубаторе. Центрифугируйте суспензию шванновской ячейки при 188 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и повторно суспендируйте гранулу ячейки в 90 микролитрах магнитного буфера разделения ячеек на 10 к седьмым ячейкам.Затем добавьте 10 микролитров микрошариков ti1 на 10 раз в седьмую ячейку. Повторно взвешенный раствор инкубировать в течение 15 минут в темноте при температуре восемь градусов Цельсия. Затем добавьте два миллилитра в буфер для разделения магнитных элементов в суспензию ячейки.После центрифугирования при 300 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах магнитного буфера для разделения ячеек. Поместите колонну разделения магнитных ячеек в сепаратор ячеек и увлажните колонку одним миллилитром буфера разделения магнитных ячеек. Затем приложите к нему клетки, чтобы собрать поток для центрифугирования.Осторожно извлеките матку из усыпленной беременной крысы и поместите ее в 100-миллиметровую чашку для культивирования тканей с ледяным HBSS. Удерживая матку с помощью изогнутых щипцов, вскрывайте стенки матки тонкими щипцами. Извлеките один амниотический мешок и осторожно откройте его, защипнув отверстие тонкими щипцами.Быстро извлеките все эмбрионы из матки и перенесите их в посуду, наполненную HBSS. Аккуратно поместите туловище одного эмбриона в 35-миллиметровую посуду, наполненную HBSS. под стереомикроскопом Откройте дорсальную часть туловища, чтобы разделить эмбрион на две половины.Поверните одну половину в сторону и определите нить ганглиев дорсальных корешков, или DRG, расположенную на линии в дорсальной части эмбриона. Вырежьте DRG как целую прядь с помощью тонких щипцов и микроножниц. Поместив DRG в свежую посуду, наполненную двумя миллилитрами HBSS, отделите один DRG от оставшейся ткани с помощью тонких щипцов и микроножниц.Возьмите 4-луночную пластину, содержащую 190 микролитров питательной среды DRG в каждой лунке, и осторожно перенесите одну DRG в центр каждой лунки с помощью тонких щипцов и шпателя. Затем поместите культуры эксплантата DRG в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день осторожно добавьте 50 микролитров питательной среды DRG в каждую лунку и ежедневно наблюдайте за прилипанием эксплантата DRG и ростом аксонов с помощью микроскопа.Для совместного культивирования на третий день культуры эксплантата DRG осторожно замените питательную среду DRG на 250 микролитров среды для совместного культивирования, содержащей 30 000 шванновских клеток на лунку. Для выполнения иммуноцитохимического окрашивания фиксируйте клетки на покровных листах, инкубируя промытые клетки DPBS в 4% параформальдегиде в течение 10 минут. Сфотографируйте иммуноцитохимически окрашенные образцы в восьми определенных областях, окружающих эксплантат DRG в центре, с помощью инвертированного микроскопа.Здесь изображен внешний вид шванновских клеток с удлиненной и веретенообразной морфологией и тонкими аксонами DRG в кокультуре. Миелинизацию в кокультуре оценивали в разные дни путем окрашивания эксплантатов DRG и шванновских клеток на основной белок миелина или MBP, бета-три тубулин и DAPI. Аксональная сеть в кокультуре была плотной и не изменялась заметно во время наблюдения.Первые признаки миелинизации были видны на 10-й и 12-й день совместной культуры. С 14-го дня сигнал ПМК был более выраженным, и были обнаружены аксоны, обернутые миелином. Миелинизация увеличивалась со временем совместной культуры до 20-го дня.Миелинизация была количественно определена как отношение ПМК и бета-трех тубулин-положительных областей. Значительное увеличение миелинизации наблюдалось на 18-й и 20-й день по сравнению с 10-м днем. Культуры эксплантатов DRG хрупкие, и с ними нужно обращаться осторожно.Например, при извлечении из инкубатора или во время смены среды и фиксации. Анализ экспрессии генов образцов совместной культуры может быть сформирован для более подробного изучения миелина. Здесь мы обнаружили миелиновые маркеры PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 на 22-й день.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Живая съемка Спинной Аксоны Корневая после ризотомия

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Генетическое изучение регенерации аксонов с искусственного взрослых нейронов ганглиев

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Спинных нейронов и дифференцированных жировой стволовых клеток, полученных:<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-культура моделью для изучения периферических нервов Регенерация

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

Экстракорпоральное моделирование раковой Neural вторжение: Спинной ганглий корень модели

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Подход, чтобы усилить согласованность и миелинизации спинного ганглий корень Нейроны

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Спинальный ганглий Injection и дорсальных корешков размозжение как модель для регенерации Сенсорное Axon

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Ламинотомия для поясничного спинной ганглий суперпользователя и инъекций в свиней

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Анализ иммунокомпетентных клеток в одном седалищного нервов и спинной корень ганглия от одной мыши с помощью проточной цитометрии

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Следственный млекопитающих Axon регенерации: В Vivo электропорации взрослых мыши Спинной корень ганглия

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Быстрая изоляция дорсал Корень Ganglion Макрофаги

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...