Name: in vitro myelination of peripheral axons in a coculture of rat dorsal root ganglion explants and schwann cells
Uploaded: 2023-02-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells at JoVE.com

Agradecemos al Prof. Dr. Ralf Gold y a la PD Dra. Gisa Ellrichmann por sus consejos y apoyo.

Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. Cultivo celular de Schwann
<ol><li>Recubrimiento para cultivo celular de Schwann<ol><li>Cubra las placas de cultivo celular en condiciones estériles. Aplicar 2 ml de poli-L-lisina (PLL) al 0,01% en dos placas de cultivo de tejidos (CT) de 60 mm cada una e incubar durante la noche a 4 °C.</li>
		<li>Retirar el PL...

<ol>
	<li>Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+cell+body+size,+axon+size,+and+signal+conduction+velocity+for+individually+labelled+dorsal+root+ganglion+cells+in+the+cat.">Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).</li><li>Taveggia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells-axon+interaction+in+myelination.">Schwann cells-axon interaction in myelination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).</li><li>Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+regeneration+and+muscle+reinnervation.">Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).</li><li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury.">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).</li><li>Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+injury+and+myelination:+Potential+therapeutic+strategies.">Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).</li><li>Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+Schwann+cell+proliferation.+III.+Evidence+for+the+surface+localization+of+the+neurite+mitogen.">Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen.</a> The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).</li><li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells.">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li><li>Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+axon-related+Schwann+cells+in+vitro.+I.+Ascorbic+acid+regulates+basal+lamina+assembly+and+myelin+formation.">Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation.</a> The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).</li><li>Paivalainen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+in+mouse+dorsal+root+ganglion/Schwann+cell+cocultures.">Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140 (4), 898-913 (2017).</li><li>Taveggia, C., Bolino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRG+neuron/Schwann+cells+myelinating+cocultures.">DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).</li><li>Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+versatile+method+for+the+isolation,+purification+and+cryogenic+storage+of+Schwann+cells+from+adult+rodent+nerves.">A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves.</a> Scientific Reports. 6, 31781 (2016).</li><li>Pitarokoili, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+triamcinolone+acetonide+exerts+anti-inflammatory+effects+on+Lewis+rat+experimental+autoimmune+neuritis+and+direct+anti-oxidative+effects+on+Schwann+cells.">Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).</li><li>Gr&#252;ter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+and+anti-oxidative+effect+of+the+direct+TRPV1+receptor+agonist+capsaicin+on+Schwann+cells.">Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).</li><li>Lehmann, H. C., H&#246;ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+a+therapeutic+target+for+peripheral+neuropathies.">Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies.</a> CNS &amp; Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).</li><li>Joshi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Schwann+cell+plasticity+in+chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy+(CIDP).">Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP).</a> Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).</li><li>Klimas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+immunomodulatory+effects+of+bortezomib+in+experimental+autoimmune+neuritis.">Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis.</a> Brain Communications. 3 (4), (2021).</li><li>Szepanowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA1+signaling+drives+Schwann+cell+dedifferentiation+in+experimental+autoimmune+neuritis.">LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis.</a> Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).</li></ol>

Aquí, presentamos un protocolo rápido y fácil para la generación de mielinización in vitro mediante la fusión de dos cultivos de tipo celular separados, células de Schwann y explantes ganglionares de la raíz dorsal.
Un paso crítico del protocolo es el cultivo de explantes DRG, especialmente en los primeros días de cultivo. Los DRG son muy frágiles antes de que se construya una red axonal fuerte y deben manejarse con mucho cuidado, por ejemplo, cuando se sacan de la incubado...

En el sistema nervioso periférico (SNP), la transducción rápida de información está mediada por axones envueltos en mielina. La mielinización de los axones es esencial para permitir la rápida propagación de los impulsos eléctricos, ya que la velocidad de conducción de las fibras nerviosas se correlaciona con el diámetro del axón y el grosor de la mielina1. La señalización sensorial desde la periferia hasta el sistema nervioso central (SNC) se basa en la activación de neuronas sensoriales de primer orden que residen en agrandamientos de la raíz dorsal, denominados ganglios de la raíz dorsal (GRD). Para la formación y el mantenimiento de la mielina, la comunicación continua entre los axones y las células de Schwann, que son las células gliales mielinizantes en el SNP, es obligatoria2.
Muchas enfermedades del SNP perturban la transducción de información por daño axonal primario o desmielinizante, lo que resulta en hipestesia o disestesia. Las neuronas sensoriales de primer orden tienen la capacidad de regenerarse en cierta medida después del daño neuronal, por una interacción compleja entre la neurona y las células de Schwann circundantes3. En este caso, las células de Schwann pueden someterse a una reprogramación celular para eliminar los desechos axonales y de mielina y promover la regeneración axonal, lo que resulta en la remielinización4. Comprender los mecanismos de mielinización en la salud y la enfermedad es importante, con el fin de encontrar posibles opciones de tratamiento para los trastornos desmielinizantes de la SNP. La mielina también puede ser dañada por neurotrauma agudo, y los enfoques para promover la mielinización para avanzar en la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico están bajo investigación5.
Nuestro conocimiento de la mielinización periférica se ha beneficiado en gran medida de los cocultivos mielinizantes de células de Schwann y neuronas sensoriales. Desde que se aplicaron los primeros abordajes 6,7,8, la mielinización ha sido intensamente estudiada con el uso de diferentes sistemas de cocultivo9,10,11. Aquí, proporcionamos un protocolo rápido y fácil para la mielinización in vitro robusta de los axones ganglionares de la raíz dorsal. El protocolo para la preparación de células de Schwann se basa en el protocolo de Andersen et al.12, publicado previamente en Pitarokoili et al.13. Utilizamos células de Schwann derivadas de ratas jóvenes y cultivos embrionarios de explante DRG para el cocultivo, en el que la mielinización ocurre alrededor del día 14. El objetivo del método es proporcionar un sistema para investigar la formación de mielina como resultado de la interacción directa axón-célula de Schwann, y estudiar los moduladores de la mielinización del SNP. En comparación con los cultivos celulares neuronales disociados, los explantes de DRG se conservan más anatómicamente y forman procesos axonales largos. La cuantificación del área del axón mielinizado proporciona una lectura suficiente para la mielinización en el cocultivo. El método es una herramienta valiosa para detectar compuestos terapéuticos por su efecto potencial sobre la mielinización del SNP, y también puede ser utilizado además de estudios in vivo en modelos animales14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-MBP, rabbit</td>
			<td>Novus Biologicals, Centannial, USA</td>
			<td>ABIN446360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#223;III-tubulin, mouse&#160;</td>
			<td>Biolegend, San Diego, USA</td>
			<td>657402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>A4403-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 100 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>70760212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 1250 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>701186210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 20 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>701114210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 300 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>70765210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany&#160;</td>
			<td>8076.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 100 &#181;M</td>
			<td>BD Bioscience, Heidelberg, Germany</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>5811000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator Heracell</td>
			<td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany&#160;</td>
			<td>51017865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 12 mm</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany&#160;</td>
			<td>P231.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11370-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI fluoromount-G(R)</td>
			<td>Biozol, Eching, Germany</td>
			<td>SBA-0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water (Water Purification System)&#160;</td>
			<td>Millipore, Molsheim, France</td>
			<td>ZLXS5010Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>31331093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>D8537-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>VWR, Radnor, USA&#160;</td>
			<td>1009862500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>F7524</td>
			<td>FCS must be tested for Schwann cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>F6886-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>G1393-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td>5710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>14170138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Incubator</td>
			<td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany&#160;</td>
			<td>51017865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraguard ECO 1.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>51029882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Pan-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P30-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>HIH, Bethesda, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#180;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130042303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Motic, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Motic BA 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio observer 7</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany&#160;</td>
			<td>491917-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR, Radnor, USA&#160;</td>
			<td>630-1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130091632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber&#160;</td>
			<td>Assistant, Erlangen, Germany</td>
			<td>40441 &#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuregulin</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, USA</td>
			<td>100-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>N1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Biozol, Eching, Germany</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon &#916; multidishes, 4 well</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>D6789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics, New Jersey, USA&#160;</td>
			<td>10342243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>4430000018&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>2231300004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 15&#160;mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 50&#160;mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>62547254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction vessels, 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>72690001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Cabinet S2020 1.8</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>51026640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14083-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 10 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861254025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861685001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861253001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>10094-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Discovery.V8</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany&#160;</td>
			<td>495015-0012-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 100, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833902300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 35, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833900300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 60, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833901300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thy-1 Microbeads (MACS Kit)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-094-523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I Collagenase</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>C1639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath type 1008</td>
			<td>GFL, Burgwedel, Germany&#160;</td>
			<td>4285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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in vitro myelination of peripheral axons in a coculture of rat dorsal root ganglion explants and schwann cells

El proceso de mielinización es esencial para permitir una transducción de señal rápida y suficiente en el sistema nervioso. En el sistema nervioso periférico, las neuronas y las células de Schwann participan en una interacción compleja para controlar la mielinización de los axones. Las alteraciones de esta interacción y la ruptura de la vaina de mielina son características de las neuropatías inflamatorias y ocurren secundariamente en trastornos neurodegenerativos. Aquí, presentamos un modelo de cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal y células de Schwann, que desarrolla una mielinización robusta de axones periféricos para investigar el proceso de mielinización en el sistema nervioso periférico, estudiar las interacciones axón-célula de Schwann y evaluar los efectos potenciales de los agentes terapéuticos en cada tipo de célula por separado. Metodológicamente, los ganglios de la raíz dorsal de ratas embrionarias (E13.5) fueron cosechados, disociados de su tejido circundante y cultivados como explantes enteros durante 3 días. Las células de Schwann se aislaron de ratas adultas de 3 semanas de edad, y los nervios ciáticos se digirieron enzimáticamente. Las células de Schwann resultantes se purificaron mediante clasificación celular activada magnéticamente y se cultivaron en condiciones enriquecidas con neuregulina y forskolina. Después de 3 días de cultivo de explante del ganglio de la raíz dorsal, se agregaron 30,000 células de Schwann a un explante del ganglio de la raíz dorsal en un medio que contenía ácido ascórbico. Los primeros signos de mielinización se detectaron en el día 10 de cocultivo, a través de señales dispersas para la proteína básica de mielina en la tinción inmunocitoquímica. A partir del día 14, se formaron vainas de mielina y se propagaron a lo largo de los axones. La mielinización se puede cuantificar mediante tinción de proteínas básicas de mielina como una relación entre el área de mielinización y el área del axón, para tener en cuenta las diferencias en la densidad axonal. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para estudiar diversos aspectos de la mielinización periférica in vitro, lo cual es crucial para comprender la patología y las posibles oportunidades de tratamiento para la desmielinización y la neurodegeneración en enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas del sistema nervioso periférico.

La mielinización en el cocultivo se evaluó en los días 10, 12, 14, 16, 18 y 20. Los explantes de DRG y las células de Schwann se tiñeron para MBP, βIII-tubulina y DAPI. La red axonal en el cocultivo fue densa y no cambió visiblemente en el curso temporal de la observación. Los primeros signos de mielina, en forma de pequeños fragmentos, fueron detectables el día 10 y aumentaron el día 12 (Figura 2). Las áreas positivas para MBP aumentaron con el tiempo hasta el día 20 de cultura...

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In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

En el sistema de cocultivo de los ganglios de la raíz dorsal y las células de Schwann, se puede estudiar la mielinización del sistema nervioso periférico. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para observar y cuantificar la mielinización periférica y estudiar los efectos de compuestos de interés en la vaina de mielina.

Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Este modelo proporciona oportunidades experimentales para estudiar diversos aspectos de la mielinización del sistema nervioso periférico in vitro. Permite la cuantificación de mielina y el examen de las interacciones de las células de Axon-Schwann. La co-cultura desarrolla una mielinización robusta desde el día 14 en adelante.Los cultivos de explante DRG proporcionan la ventaja de una arquitectura estructural intacta en comparación con los cultivos neuronales disociados. Este método está disponible para detectar compuestos tropóticos para enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas del sistema nervioso periférico. Para comenzar, esterilice el área de trabajo en el torso de la rata sacrificada con etanol al 70%.Abra la extremidad inferior izquierda dorsal de la rata con tijeras y retire con cuidado el músculo femoroso del bíceps. Afloje el nervio ciático mediante una elevación suave con fórceps curvos, asegurándose de no magullar el nervio. Usando fórceps, Transfiera los nervios recortados a una placa de cultivo de tejidos con el medio L-15 de Leibovitz helado con 50 microgramos por mililitro de gentamicina.Luego, usando un microscopio estéreo, retire la grasa, el músculo y los vasos sanguíneos de los nervios con dos pares de pinzas finas. Identificar los extremos proximal y distal del nervio ciático y extraer el epineuro con un par de fórceps finos en dirección proximal a distal mientras se sostiene el extremo del nervio proximal con el segundo par de fórceps finos. Después de transferir los nervios purificados a otra placa de cultivo de tejidos con el medio L-15 de Leibovitz helado con gentamicina, realice burlas de los fascículos nerviosos aislados para separar y aislar fibras nerviosas individuales usando dos pares de pinzas finas.Transfiera las fibras nerviosas a un tubo de 50 mililitros utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros y tome la menor cantidad de medio posible. Luego agregue 50 mililitros de medio L 15 de leibovitz con gentamicina a las fibras nerviosas varias veces. Centrifugar el tubo que contiene las fibras nerviosas a 188 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Después de retirar el sobrenadante, transfiera el pellet con el medio L-15 restante de Leibovitz a una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros. Enjuague el tubo de 50 mililitros con 10 mililitros de la solución de digestión enzimática y agréguelo al plato de fibras nerviosas. Distribuya las fibras nerviosas en el plato cuidadosamente con la punta de una pipeta.Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 18 horas. Y detenga la digestión enzimática agregando 10 mililitros al 40% FCS en HBSS. Transfiera los nervios digeridos a un tubo de 50 mililitros para centrifugar a 188 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de DMEM que contengan 10% de FCS y 50 microgramos por mililitro de gentamicina. A continuación, filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 100 micrómetros. después de centrifugar a 188 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, vuelva a suspender el pellet con cuatro mililitros de DMEM que contengan FCS y gentamicina.Agregue dos mililitros de la suspensión celular a cada una de las dos placas de cultivo de tejido de 60 milímetros recubiertas de polilisina y laminina. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, dejando las placas intactas durante dos días en la incubadora. Centrifugar la suspensión de células de Schwann a 188 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y volver a suspender la cápsula de células en 90 microlitros de tampón de separación de células magnéticas por una vez 10 a la séptima celda.Luego agregue 10 microlitros de micro perlas ti1 por una vez 10 a la séptima celda. Incubar la solución resuspendida durante 15 minutos en la oscuridad a ocho grados centígrados. A continuación, agregue dos mililitros en el tampón de separación de células magnéticas a la suspensión celular.Después de centrifugar a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de separación de células magnéticas. Coloque la columna de separación de células magnéticas en el separador de celdas y humedezca la columna con un mililitro del tampón de separación de células magnéticas. Luego aplique las células a él para recoger el flujo a través de la centrifugación.Retire cuidadosamente el útero de una rata embarazada sacrificada y colóquelo en un plato de cultivo de tejido de 100 milímetros con HBSS helado. Sosteniendo el útero con fórceps curvos, abra la pared del útero con fórceps finos. Retire un saco amniótico y ábralo con cuidado pellizcando un agujero con fórceps finos.Retire rápidamente todos los embriones del útero y transfiéralos a un plato lleno de HBSS. Suavemente, coloque un torso de embrión en un plato de 35 milímetros lleno de HBSS. bajo un microscopio estéreo, abra la parte dorsal del torso para dividir el embrión en dos mitades.Gire una mitad hacia un lado e identifique la hebra de ganglios de la raíz dorsal, o DRG, ubicada en la línea en la parte dorsal del embrión. Corte el DRG como una hebra completa usando pinzas finas y micro tijeras. Después de colocar el DRG en un plato fresco lleno de dos mililitros de HBSS, separe un solo DRG del tejido restante con pinzas finas y microtijeras.Tome una placa de 4 pocillos que contenga 190 microlitros de medio de crecimiento DRG en cada pocillo y transfiera cuidadosamente un solo DRG al centro de cada pocillo usando pinzas finas y una espátula. Luego coloque los cultivos de explante DRG en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, agregue cuidadosamente 50 microlitros del medio de crecimiento DRG a cada pocillo y observe la adherencia al explante DRG y el crecimiento de axones con un microscopio diariamente.Para el cocultivo en el tercer día del cultivo de explante de DRG, reemplace cuidadosamente el medio de crecimiento de DRG con 250 microlitros del medio de cocultivo que contiene 30, 000 células de schwann por pocillo. Para realizar la tinción inmunocitoquímica, fije las células en los cubobjetos de cubierta incubando las células lavadas DPBS en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos. Tome fotografías de las muestras teñidas inmunocitoquímicamente en ocho regiones definidas que rodean el explante de DRG en el centro utilizando un microscopio invertido.Aquí se representa la apariencia de células de schwann con una morfología alargada y en forma de huso y los delgados axones DRG en un cocultivo. La mielinización en el cocultivo se evaluó en diferentes días mediante la tinción de los explantes DRG y las células de Schwann para la proteína básica de mielina o MBP, beta tres tubulina y DAPI. La red axonal en el cocultivo fue densa y no cambió visiblemente en el curso temporal de la observación.Los primeros signos de mielinización fueron visibles en los días 10 y 12 de cocultura. A partir del día 14, la señal MVP fue más pronunciada y se detectaron axones envueltos en mielina. La mielinización aumentó con el tiempo de cocultivo hasta el día 20.La mielinización se cuantificó como una relación de las áreas positivas de MVP y beta tres tubulina. Se observó un aumento significativo de la mielinización en los días 18 y 20 en comparación con el día 10. Los cultivos de explante DRG son frágiles y deben manejarse con cuidado.Por ejemplo, cuando se saca de la incubadora o durante el cambio y la fijación del medio. Se puede formar un análisis de expresión génica de muestras de cocultivo para investigar la mielina con mayor detalle. Aquí, detectamos los marcadores de mielina PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 el día 22.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Imágenes en vivo de los axones de la raíz dorsal después de rizotomía

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Investigación

Neurociencias

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

En Vitro Modelado de canceroso Neural Invasion: Modelo del ganglio de la raíz dorsal

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Inyección de raíz dorsal ganglio de raíz dorsal y Lesión por aplastamiento como modelo para la regeneración del axón sensorial

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Laminotomía para acceso de ganglio de raíz Dorsal Lumbar y de la inyección en los cerdos

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Análisis de las células inmunes en solo de los nervios ciático y de ganglio de raíz Dorsal de un ratón mediante citometría de flujo

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigadora de axón mamífero de regeneración: En Vivo electroporación de ganglio de raíz Dorsal de ratón adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Aislamiento rápido de macrófagos de ganando de raíz dorsal

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...