Name: in vitro myelination of peripheral axons in a coculture of rat dorsal root ganglion explants and schwann cells
Uploaded: 2023-02-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells at JoVE.com

Vi tackar Prof. Dr. Ralf Gold och PD Dr. Gisa Ellrichmann för deras råd och stöd.

Alla försök utfördes i enlighet med Europeiska gemenskapernas rådsdirektiv för vård och användning av försöksdjur.
1. Schwann cellodling
<ol><li>Beläggning för Schwann-cellodling<ol><li>Belägg cellodlingsrätterna under sterila förhållanden. Applicera 2 ml 0,01% poly-L-lysin (PLL) på två 60 mm vävnadsodlingsrätter (TC) vardera och inkubera över natten vid 4 °C.</li>
		<li>Ta bort PLL, tvätta TC-diskarna 2x med destillerat vatten och inkubera med 2 ml 1 ?...

<ol>
	<li>Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+cell+body+size,+axon+size,+and+signal+conduction+velocity+for+individually+labelled+dorsal+root+ganglion+cells+in+the+cat.">Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).</li><li>Taveggia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells-axon+interaction+in+myelination.">Schwann cells-axon interaction in myelination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).</li><li>Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+regeneration+and+muscle+reinnervation.">Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).</li><li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury.">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).</li><li>Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+injury+and+myelination:+Potential+therapeutic+strategies.">Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).</li><li>Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+Schwann+cell+proliferation.+III.+Evidence+for+the+surface+localization+of+the+neurite+mitogen.">Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen.</a> The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).</li><li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells.">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li><li>Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+axon-related+Schwann+cells+in+vitro.+I.+Ascorbic+acid+regulates+basal+lamina+assembly+and+myelin+formation.">Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation.</a> The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).</li><li>Paivalainen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+in+mouse+dorsal+root+ganglion/Schwann+cell+cocultures.">Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140 (4), 898-913 (2017).</li><li>Taveggia, C., Bolino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRG+neuron/Schwann+cells+myelinating+cocultures.">DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).</li><li>Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+versatile+method+for+the+isolation,+purification+and+cryogenic+storage+of+Schwann+cells+from+adult+rodent+nerves.">A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves.</a> Scientific Reports. 6, 31781 (2016).</li><li>Pitarokoili, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+triamcinolone+acetonide+exerts+anti-inflammatory+effects+on+Lewis+rat+experimental+autoimmune+neuritis+and+direct+anti-oxidative+effects+on+Schwann+cells.">Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).</li><li>Gr&#252;ter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+and+anti-oxidative+effect+of+the+direct+TRPV1+receptor+agonist+capsaicin+on+Schwann+cells.">Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).</li><li>Lehmann, H. C., H&#246;ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+a+therapeutic+target+for+peripheral+neuropathies.">Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies.</a> CNS &amp; Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).</li><li>Joshi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Schwann+cell+plasticity+in+chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy+(CIDP).">Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP).</a> Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).</li><li>Klimas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+immunomodulatory+effects+of+bortezomib+in+experimental+autoimmune+neuritis.">Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis.</a> Brain Communications. 3 (4), (2021).</li><li>Szepanowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA1+signaling+drives+Schwann+cell+dedifferentiation+in+experimental+autoimmune+neuritis.">LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis.</a> Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).</li></ol>

Här presenterar vi ett snabbt och enkelt protokoll för generering av in vitro-myelinering genom att slå samman två separata celltypkulturer, Schwann-celler och dorsalrotganglionexplantat.
Ett kritiskt steg i protokollet är odling av DRG-explantat, särskilt under de första dagarna av kulturen. DRG är mycket ömtåliga innan ett starkt axonalt nätverk byggs och måste hanteras mycket försiktigt, till exempel när de tas ut ur inkubatorn eller vid byte av medium. DRG som lossna...

I det perifera nervsystemet (PNS) förmedlas snabb informationstransduktion av myelinlindade axoner. Myelineringen av axoner är avgörande för att möjliggöra snabb utbredning av elektriska impulser, eftersom nervfibrernas ledningshastighet korrelerar med axondiametern och myelintjockleken1. Sensorisk signalering från periferin till centrala nervsystemet (CNS) bygger på aktivering av första ordningens sensoriska neuroner som ligger i utvidgningar av dorsalroten, kallad dorsala rotganglier (DRG). För bildning och underhåll av myelin är kontinuerlig kommunikation mellan axoner och Schwann-celler, vilka är de myeliniserande Glia-cellerna i PNS, obligatorisk2.
Många sjukdomar i PNS stör överföringen av information genom antingen primär axonal eller demyeliniserande skada, vilket resulterar i hypestesi eller dysestesi. Första ordningens sensoriska neuroner har förmågan att regenerera i viss utsträckning efter neuronal skada, genom en komplex interaktion mellan neuronen och omgivande Schwann-celler3. I detta fall kan Schwann-celler genomgå cellulär omprogrammering för att rensa axonalt såväl som myelinskräp och främja axonal regenerering, vilket resulterar i remyelinering4. Att förstå mekanismerna för myelinisering vid hälsa och sjukdom är viktigt för att hitta möjliga behandlingsalternativ för demyeliniserande störningar i PNS. Myelin kan också skadas av akut neurotrauma, och metoder för att främja myelinisering för att främja funktionell återhämtning efter perifer nervskada undersöks5.
Vår kunskap om perifer myelinisering har till stor del gynnats av myeliniserande samkulturer av Schwann-celler och sensoriska neuroner. Sedan de första metoderna tillämpades 6,7,8 har myelinisering studerats intensivt med användning av olika samkultursystem9,10,11. Här tillhandahåller vi ett snabbt och enkelt protokoll för robust in vitro-myelinering av dorsalrotganglieaxoner. Protokollet för Schwann-cellberedning är baserat på protokollet av Andersen et al.12, tidigare publicerat i Pitarokoili et al.13. Vi använder Schwann-celler som härrör från unga råttor och embryonala DRG-explantkulturer för samkulturen, där myelinisering sker runt dag 14. Målet med metoden är att tillhandahålla ett system för att undersöka bildandet av myelin som ett resultat av direkt axon-Schwann-cellinteraktion, och att studera modulatorer av PNS-myelinisering. I jämförelse med dissocierade neuronala cellkulturer är DRG-explantat mer anatomiskt bevarade och bildar långa axonala processer. Kvantifiering av det myeliniserade axonområdet ger en tillräcklig avläsning för myelinisering i samkulturen. Metoden är ett värdefullt verktyg för att screena terapeutiska substanser för deras potentiella effekt på PNS-myelinisering, och kan även användas som tillägg till in vivo-studier i djurmodeller14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-MBP, rabbit</td>
			<td>Novus Biologicals, Centannial, USA</td>
			<td>ABIN446360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#223;III-tubulin, mouse&#160;</td>
			<td>Biolegend, San Diego, USA</td>
			<td>657402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>A4403-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 100 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>70760212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 1250 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>701186210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 20 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>701114210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 300 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>70765210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany&#160;</td>
			<td>8076.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 100 &#181;M</td>
			<td>BD Bioscience, Heidelberg, Germany</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>5811000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator Heracell</td>
			<td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany&#160;</td>
			<td>51017865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 12 mm</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany&#160;</td>
			<td>P231.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11370-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI fluoromount-G(R)</td>
			<td>Biozol, Eching, Germany</td>
			<td>SBA-0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water (Water Purification System)&#160;</td>
			<td>Millipore, Molsheim, France</td>
			<td>ZLXS5010Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>31331093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>D8537-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>VWR, Radnor, USA&#160;</td>
			<td>1009862500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>F7524</td>
			<td>FCS must be tested for Schwann cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>F6886-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>G1393-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td>5710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>14170138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Incubator</td>
			<td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany&#160;</td>
			<td>51017865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraguard ECO 1.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>51029882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Pan-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P30-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>HIH, Bethesda, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#180;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130042303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Motic, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Motic BA 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio observer 7</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany&#160;</td>
			<td>491917-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR, Radnor, USA&#160;</td>
			<td>630-1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130091632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber&#160;</td>
			<td>Assistant, Erlangen, Germany</td>
			<td>40441 &#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuregulin</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, USA</td>
			<td>100-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>N1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Biozol, Eching, Germany</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon &#916; multidishes, 4 well</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>D6789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics, New Jersey, USA&#160;</td>
			<td>10342243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>4430000018&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>2231300004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 15&#160;mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 50&#160;mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>62547254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction vessels, 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>72690001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Cabinet S2020 1.8</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>51026640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14083-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 10 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861254025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861685001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861253001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>10094-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Discovery.V8</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany&#160;</td>
			<td>495015-0012-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 100, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833902300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 35, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833900300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 60, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833901300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thy-1 Microbeads (MACS Kit)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-094-523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I Collagenase</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>C1639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath type 1008</td>
			<td>GFL, Burgwedel, Germany&#160;</td>
			<td>4285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro myelination of peripheral axons in a coculture of rat dorsal root ganglion explants and schwann cells

Myeliniseringsprocessen är avgörande för att möjliggöra snabb och tillräcklig signaltransduktion i nervsystemet. I det perifera nervsystemet engagerar neuroner och Schwann-celler en komplex interaktion för att kontrollera myelineringen av axoner. Störningar av denna interaktion och nedbrytning av myelinskidan är kännetecken för inflammatoriska neuropatier och förekommer sekundärt vid neurodegenerativa störningar. Här presenterar vi en samodlingsmodell av dorsala rotganglieexplantat och Schwann-celler, som utvecklar en robust myelinering av perifera axoner för att undersöka myeliniseringsprocessen i det perifera nervsystemet, studera axon-Schwann-cellinteraktioner och utvärdera de potentiella effekterna av terapeutiska medel på varje celltyp separat. Metodologiskt skördades dorsala rotganglioner av embryonala råttor (E13.5), dissocierades från sin omgivande vävnad och odlades som hela explantat i 3 dagar. Schwannceller isolerades från 3 veckor gamla vuxna råttor och ischiasnerver smältes enzymatiskt. De resulterande Schwann-cellerna renades genom magnetaktiverad cellsortering och odlades under neuregulin- och forskolinberikade förhållanden. Efter 3 dagar av dorsal root ganglion explantkultur tillsattes 30 000 Schwann-celler till en dorsal root ganglion explantat i ett medium innehållande askorbinsyra. De första tecknen på myelinisering upptäcktes på dag 10 av samodling, genom spridda signaler för myelinbasprotein vid immunocytokemisk färgning. Från dag 14 och framåt bildades myelinmantlar och förökades längs axonerna. Myelinisering kan kvantifieras genom myelinbasisk proteinfärgning som ett förhållande mellan myeliniseringsområdet och axonområdet för att ta hänsyn till skillnaderna i axonal densitet. Denna modell ger experimentella möjligheter att studera olika aspekter av perifer myelinisering in vitro, vilket är avgörande för att förstå patologin och möjliga behandlingsmöjligheter för demyelinisering och neurodegeneration vid inflammatoriska och neurodegenerativa sjukdomar i det perifera nervsystemet.

Myelinisering i samkulturen bedömdes dag 10, 12, 14, 16, 18 och 20. DRG-explantaterna och Schwann-cellerna färgades för MBP, βIII-tubulin och DAPI. Axonalnätverket i samkulturen var tätt och förändrades inte synligt under observationens tidsförlopp. De första tecknen på myelin, i form av små fragment, detekterades på dag 10 och ökade på dag 12 (figur 2). De MBP-positiva områdena ökade över tid fram till dag 20 av kulturen. Myeliniseringen kvantifierades som ett förhålland...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells at JoVE.com

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

I samodlingssystemet av dorsala rotganglier och Schwann-celler kan myelinering av det perifera nervsystemet studeras. Denna modell ger experimentella möjligheter att observera och kvantifiera perifer myelinisering och att studera effekterna av föreningar av intresse på myelinskidan.

Myelinisering in vitro av perifera axoner i en samkultur av råtta dorsalrotganglion explantat och Schwannceller

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Denna modell ger experimentella möjligheter att studera olika aspekter av myelinisering av det perifera nervsystemet in vitro. Det möjliggör myelinkvantifiering och undersökning av Axon-Schwann-cellinteraktioner. Samkulturen utvecklar en robust myelinering från dag 14 och framåt.DRG-explantkulturerna ger fördelen med intakt strukturell arkitektur jämfört med dissocierade neuronala kulturer. Denna metod är tillgänglig för screening för tropotiska föreningar för inflammatoriska och neurodegenerativa sjukdomar i det perifera nervsystemet. För att börja, sterilisera arbetsområdet i den avlivade råttans torso med 70% etanol.Öppna råttans dorsala nedre vänstra extremitet med sax och ta försiktigt bort biceps femorösa muskel. Lossa ischiasnerven genom jämn höjd med böjda pincett, se till att inte blåsa nerven. Använd pincett, Överför de klippta nerverna till en vävnadsodlingsskål med iskall Leibovitz L-15-medium med 50 mikrogram per milliliter gentamycin.Ta sedan bort fett, muskler och blodkärl från nerverna med hjälp av ett stereomikroskop med två par fina pincett. Identifiera de proximala och distala ändarna av ischiasnerven och ta bort epineurium med ett par fina pincett i proximal till distal riktning medan du håller den proximala nervänden med det andra paret fina pincett. Efter att ha överfört de renade nerverna till en annan vävnadsodlingsskål med iskall Leibovitz L-15-medium med Gentamycin, reta de isolerade nervfasciklarna för att separera och isolera enstaka nervfibrer med två par fina pincett.Överför nervfibrerna till ett 50 milliliter rör med en 10 milliliter serologisk pipett och ta upp så lite medium som möjligt. Tillsätt sedan 50 ml leibovitz L 15-medium med gentamycin till nervfibrerna i sväng några gånger. Centrifugera röret som innehåller nervfibrerna vid 188 G i fem minuter vid fyra grader Celsius.Efter avlägsnande av supernatanten, överför pelleten med återstående Leibovitz L-15-medium till en 60 millimeter vävnadsodlingsskål. Skölj 50 ml röret med 10 ml enzymatisk digestionslösning och tillsätt det till nervfibrerna. Fördela nervfibrerna i skålen försiktigt med spetsen på en pipett.Inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 18 timmar. Och stoppa den enzymatiska nedbrytningen genom att tillsätta 10 ml vid 40% FCS i HBSS. Överför de smälta nerverna till ett 50 ml rör för att centrifugera vid 188 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Efter kassering av supernatanten, suspendera pelleten igen i 10 ml DMEM innehållande 10% FCS och 50 mikrogram per ml gentamycin. Därefter filtrerar cellsuspensionen genom en 100 mikrometer cellsil. efter centrifugering vid 188 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius, suspendera pelleten igen med fyra milliliter DMEM innehållande FCS och gentamycin.Tillsätt två milliliter av cellsuspensionen till var och en av de två polylysin- och lamininbelagda 60 millimeter vävnadsodlingsskålarna. Inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid, lämna plattorna orörda i två dagar i inkubatorn. Centrifugera Schwann-cellsuspensionen vid 188 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius och suspendera cellpelleten igen i 90 mikroliter magnetisk cellseparationsbuffert per en gånger 10 till den sjunde cellen.Tillsätt sedan 10 mikroliter ti1 mikropärlor per en gånger 10 till de sjunde cellerna. Inkubera den återsuspenderade lösningen i 15 minuter i mörker vid åtta grader Celsius. Tillsätt sedan två milliliter i den magnetiska cellseparationsbufferten till cellsuspensionen.Efter centrifugering vid 300 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius, suspendera pelleten igen i 500 mikroliter magnetisk cellseparationsbuffert. Placera den magnetiska cellseparationskolonnen i cellseparatorn och fukta kolonnen med en milliliter av den magnetiska cellseparationsbufferten. Applicera sedan cellerna på den för att samla flödet genom centrifugering.Ta försiktigt bort livmodern från en avlivad gravid råtta och placera den i en 100 millimeter vävnadsodlingsskål med iskall HBSS. Håll livmodern med böjda pincett, öppna livmoderväggen med fina pincett. Ta bort en fostersäck och öppna den försiktigt genom att klämma ett hål med fina pincett.Ta snabbt bort alla embryon från livmodern och överför dem till en maträtt fylld med HBSS. Placera försiktigt en embryotorso i en 35 millimeter skål fylld med HBSS. under ett stereomikroskop, Öppna den dorsala delen av torso för att dela embryot i två halvor.Vänd hälften åt sidan och identifiera strängen av dorsala rotganglier, eller DRG, som ligger i linjen vid embryonets dorsala del. Klipp ut DRG som en hel sträng med fina pincett och mikrosaxar. Efter att ha placerat DRG i en ny skål fylld med två milliliter HBSS, Separera en enda DRG från den återstående vävnaden med fina pincett och mikrosax.Ta en 4-brunnsplatta innehållande 190 mikroliter DRG-tillväxtmedium i varje brunn och överför försiktigt en enda DRG till mitten av varje brunn med fina pincett och en spatel. Placera sedan DRG-explantkulturerna i inkubatorn vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Nästa dag, tillsätt försiktigt 50 mikroliter DRG-tillväxtmediet till varje brunn och observera DRG-explantvidhäftning och axonutväxt med hjälp av ett mikroskop dagligen.För samodling på dag tre av DRG-explantkulturen, byt försiktigt DRG-tillväxtmediet med 250 mikroliter av samodlingsmediet innehållande 30 000 schwannceller per brunn. För att utföra immunocytokemisk färgning, fixera cellerna på lockslipsarna genom att inkubera de DPBS-tvättade cellerna i 4% paraformaldehyd i 10 minuter. Ta bilder av de immunocytokemiskt färgade proverna vid åtta definierade regioner som omger DRG-explanten i mitten med hjälp av ett inverterat mikroskop.Utseendet på schwannceller med en långsträckt och spindelformad morfologi och de tunna DRG-axonerna i en samkultur avbildas här. Myelinisering i samkulturen bedömdes på olika dagar genom färgning av DRG-explantaterna och Schwann-cellerna för myelinbasprotein eller MBP, beta tre tubulin och DAPI. Axonalnätverket i samkulturen var tätt och förändrades inte synligt under observationens tidsförlopp.De första tecknen på myelinisering var synliga på dag 10 och 12 av samkulturen. Från dag 14 var MVP-signalen mer uttalad och myelinlindade axoner detekterades. Myeliniseringen ökade med samkulturtiden fram till dag 20.Myeliniseringen kvantifierades som ett förhållande mellan MVP och beta tre tubulinpositiva områden. En signifikant ökning av myelinisering observerades dag 18 och 20 jämfört med dag 10. DRG-explantkulturer är ömtåliga och måste hanteras försiktigt.Till exempel när det tas ut ur inkubatorn eller under medelbyte och fixering. Genuttrycksanalys av samodlingsprover kan bildas för att undersöka myelin mer detaljerat. Här upptäckte vi myelinmarkörerna PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 på dag 22.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Live avbildning av dorsala Axoner efter Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetisk studie av Axon Regeneration med odlade Vuxna Mjukstrålar neuroner rotganglion

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsalrotsganglier Neuroner och differentierade Fett-härledda Stem Cells: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-kultur modell för att studera perifera nerver Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

I vitro Modellering av cancer Neural Invasion: dorsala ganglion Modell

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

En strategi för att öka Justering och myelinisering av Dorsal Root ganglieneuroner

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsala ganglion Injection och dorsala krosskada som en modell för Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Laminotomy för ländryggen dorsalrotsganglier Ganglion tillgång och injektion hos svin

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analys av immunceller i enda höftnerver och dorsalrotsganglier Ganglion från ett enda musklick med hjälp av flödescytometri

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Utredande däggdjur Axon regenerering: In Vivo elektroporation av vuxen mus dorsalrotsganglier Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Snabb isolering av dorsala root ganglion makrofager

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...