Name: cell culture techniques and practices to avoid contamination by fungi and bacteria in the research cell culture laboratory
Uploaded: 2023-07-07T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory at JoVE.com

أصبح هذا العمل ممكنا بفضل التمويل من معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI). نود أن نشكر رئيسة مختبرنا ، جو تشين ، على قراءة المخطوطة وعلى دعمها المستمر ، ودونا تالنت على تعديلاتها وتعليقاتها المفيدة ، وجيف هينيفيلد من قسم تكنولوجيا المعلومات في جامعة روكفلر لمساعدته في مكون الفيديو في هذه المخطوطة.

1. الاستعدادات 
<ol><li>عام<ol><li>ارتداء معطف مختبر نظيف مخصص لارتدائه فقط في غرفة زراعة الخلايا وليس في أجزاء أخرى من المختبر. ملاحظة: لا يلزم أن يكون معطف المختبر معقما.</li>
		<li>ارتد قفازات جديدة لم تلمس أي أسطح أخرى. تأكد من أن القفازات مناسبة بإحكام. النتريل ، قفازات خالية من مسحوق هي...

<ol>
	<li>Johnson, Z. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+substrate+recognition+by+the+multidrug+resistance+protein+MRP1.">Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1.</a> Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).</li><li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+as+biological+models:+practical+steps+for+more+reliable+research.">Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research.</a> Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).</li><li>Segeritz, C. P., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+growing+cells+as+model+systems+in+vitro.">Cell culture: growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li><li>Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+contamination:+sources,+consequences,+prevention,+and+elimination.">Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination.</a> Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).</li><li>Nikfarjam, L., Farzaneh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+detection+of+mycoplasma+contamination+in+cell+culture.">Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture.</a> Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).</li><li>Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+contamination.">Cell culture contamination.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).</li><li>Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mycoplasma+in+cell+cultures.">Detection of Mycoplasma in cell cultures.</a> Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).</li><li>Barth, O. M., Majerowicz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+by+transmission+electron+microscopy+of+mycoplasma+contamination+in+sera+and+cell+cultures.">Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).</li><li>Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+are+useful+model+systems+for+medical+research.">Cancer cell lines are useful model systems for medical research.</a> Cancers. 11 (8), 1098 (2019).</li><li>A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science Available from: <a target="_blank" href="https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you">https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you</a> (2020)</li><li>Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+contamination:+an+overview.">Cell culture contamination: an overview.</a> Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).</li><li>Babic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-research:+Incidences+of+problematic+cell+lines+are+lower+in+papers+that+use+RRIDs+to+identify+cell+lines.">Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines.</a> eLife. 8, e41676 (2019).</li><li>Visconti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+tandem+repeat+profiling+for+the+authentication+of+cancer+stem-like+cells.">Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells.</a> International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).</li><li>Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ghosts+of+HeLa:+How+cell+line+misidentification+contaminates+the+scientific+literature.">The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature.</a> PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).</li><li>Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal Available from: <a target="_blank" href="https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference">https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference</a> (2023)</li><li>United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications Available from: <a target="_blank" href="https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf">https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf</a> (2004)</li><li>Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html">https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html</a> (2023)</li><li>Cot&#233;, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+technique+for+cell+culture.">Aseptic technique for cell culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Uphoff, C. C., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+Mycoplasma+contamination+from+cell+cultures.">Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).</li><li>Bykowski, T., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+technique.">Aseptic technique.</a> Current Protocols in Microbiology. 56 (1), e98 (2020).</li><li>How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire Available from: <a target="_blank" href="https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article">https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article</a> (2020)</li><li>Phelan, K., May, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+tissue+culture+techniques.">Mammalian cell tissue culture techniques.</a> Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).</li></ol>

في حين أن التلوث هو أحد الاهتمامات الرئيسية عند القيام بأعمال زراعة الخلايا ، فإن الممارسات والتقنيات الموضحة في هذه المخطوطة ستساعد في التخفيف من المخاطر. تشمل الخطوات الحاسمة ارتداء معطف مختبر نظيف ، والذي يستخدم فقط في غرفة زراعة الخلايا ، واستخدام قفازات نظيفة وخالية من البودرة يتم ر...

زراعة الخلايا لها العديد من الاستخدامات في مختبر الأبحاث. منذ نشأة زراعة الخلايا في أوائل القرن 20 ، ساعدت خطوط الخلايا في تقدم العلوم. خطوط الخلايا لها العديد من المزايا. يمكن أن تساعد خطوط الخلايا المختلفة الباحثين في دراسة بيولوجيا الخلية ، أو إنتاج فيروس البقعي لمزيد من الدراسات ، أو إنتاج كميات كبيرة من البروتين ذي الأهمية ، على سبيل المثال لا الحصر1. تشمل بعض الاستخدامات الإضافية دراسة نمو الأنسجة ، والمساعدة في تطوير اللقاح ، وأبحاث السموم ، ودراسة دور الجينات في الكائنات الحية السليمة والنماذج المريضة ، وإنتاج خطوط الخلايا الهجينة 2,3. يمكن لخطوط الخلايا أيضا تمكين إنتاج الدواء3. تقنيات التعقيم المناسبة ضرورية عند العمل مع خطوط الخلايا ؛ تنطبق الممارسات والتقنيات الموضحة في هذه المخطوطة على مختبرات الأبحاث حيث يتم تنفيذ أعمال زراعة الخلايا. لا تتم مناقشة إعدادات المختبر الأخرى.
غالبا ما يكون التلوث هو الشاغل الرئيسي عند القيام بعمل زراعة الخلايا. في سياق هذه الورقة ، يشير التلوث عموما إلى الفطريات والبكتيريا. الهدف العام من الطريقة الموضحة في هذه الورقة هو وصف شامل لأفضل الممارسات لتجنب التلوث. يجب على جميع أعضاء المختبر الالتزام بهذه الممارسات عند العمل في غرفة زراعة الخلايا في مختبر الأبحاث. يجب أن تضمن المختبرات أن جميع العمال مشاركون نشطون في استخدام أفضل الممارسات هذه لمنع التلوث. ستساعد معرفة الممارسات والتقنيات الصحيحة على ضمان بقاء مزارع الخلايا قابلة للحياة وصحية وخالية من التلوث. يعتمد تطوير هذه التقنية على البحث في الأدبيات ، وسبع سنوات من الخبرة في العمل مع مزارع الخلايا ، والحاجة إلى طريقة يمكن لكل من المبتدئين والعاملين ذوي الخبرة في زراعة الخلايا الرجوع إليها على أساس سنوي.
هناك حاجة إلى تقنية واضحة وموحدة يجب أن تتبعها جميع مختبرات زراعة الخلايا البحثية. تناقش الكثير من الأدبيات حول تلوث زراعة الخلايا الكشف عن الميكوبلازما ، وتقنيات التعقيم ، ومصادر التلوث ، والقضاء على الملوثات ، والوقاية باستخدام المضادات الحيوية والاختبار المنتظم4،5،6،7،8. في حين أن هذه المعلومات مفيدة ، لا توجد مقاطع فيديو موجودة في الأدبيات توضح تقنيات زراعة الخلايا المناسبة التي يجب على المرء اتباعها. تتمثل ميزة الممارسات المقدمة على التقنيات البديلة في التركيز على منع التلوث قبل حدوثه ، بدلا من اكتشاف الأخطاء وتصحيحها لاحقا. علاوة على ذلك ، فإن العرض الشامل لتقنيات التعقيم ، ومناقشة حول منع نمو الفطريات والبكتيريا ، والمعلومات المتعلقة بتدفق هواء خزانة السلامة الحيوية ذات قيمة لكل من العاملين المبتدئين وذوي الخبرة في زراعة الخلايا على حد سواء.
البكتيريا والفطريات هما النوعان الأكثر شيوعا من الملوثات. ضمن فئة البكتيريا ، تعد الميكوبلازما مصدر قلق كبير نظرا لصغر حجمها وقدرتها على التكاثر مع بقائها دون أن يلاحظها أحد. وهي كائنات حية ذاتية التكاثر ليس لها جدار خلوي صلب وتعتمد على الخلايا الحقيقية النواة لتنمو. لقد قللت من القدرات الأيضية ويمكن أن تتكاثر بشكل كبير بينما تظل غير معترف بها في الفحص البصري الروتيني لثقافات الخلايا والتحليل المجهري المنتظم ، على الرغم من أن المجهر الإلكتروني النافذ يمكنه اكتشاف الميكوبلازما 9,10. علاوة على ذلك ، يمكنهم المرور عبر المرشحات الميكروبيولوجية10. يوفر وسط زراعة الخلايا الميكوبلازما بالمواد المغذية ، على الرغم من أن تكملة الوسائط بالمضادات الحيوية للأسف لا تؤثر على الميكوبلازما10. ينبغي للمرء أن يلاحظ أنه ، بشكل عام ، ليس من الضروري استكمال الوسائط بالمضادات الحيوية. يجب أن تكون التقنيات المناسبة كافية في إبعاد التلوث. لا تؤدي الإصابة بالميكوبلازما إلى موت الخلايا الفوري ، ولكنها تثير قلق الباحثين لأنها تؤثر على قابلية استنساخ البيانات وجودتها.
يجب على جميع موظفي المختبر الالتزام الصارم بممارسات زراعة الخلايا الجيدة. يجب اختبار الثقافات بحثا عن الميكوبلازما بعد شرائها حديثا ، أثناء زراعتها حاليا ، وقبل حفظها بالتبريد ، وعند إذابتها من النيتروجين السائل 2,10. تتوفر اختبارات مختلفة في السوق باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) أو التلوين المناعي. 3 تشير الأدبيات إلى أن "العزلات البشرية تمثل نسبة كبيرة من ملوثات الميكوبلازما الموجودة في زراعة الخلايا"5. على الرغم من وصف أكثر من 200 نوع من الميكوبلازما ، إلا أن حوالي ستة منها تمثل معظم الإصابات. هذه الأنواع الستة هي M. arginini و M. fermentans و M. hominis و M. hyorhinis و M. orale و Acholeplasma laidlawii10. كما هو الحال مع أنواع التلوث الأخرى ، فإن الهواء والهباء الجوي يجلبانها إلى مزارع الخلايا5. يتردد صدى هذا في أوراق أخرى لأن "المشغل البشري يحتمل أن يكون أكبر خطر في المختبر"7. على الرغم من أن هذا يتم من خلال خطأ بشري ، إلا أنه يمكن القضاء على المخاطر إذا تم اتباع إجراء قياسي. لا يقتصر التساقط من الموظفين على تلوث الميكوبلازما فقط. عادة ما تصاب مزارع الخلايا في أحد المختبرات بنفس أنواع الميكوبلازما ، مما يشير إلى أن التلوث ينتشر من قارورة إلى أخرى بسبب تقنيات زراعة الخلايا غير الصحيحة10.
منع التلوث المتبادل هو أيضا سبب آخر لاتباع تقنيات زراعة الخلايا المناسبة. تجدر الإشارة إلى أن ما لا يقل عن 15٪ -18٪ من خطوط الخلايا في جميع أنحاء العالم قد تكون ملوثة أو تم تحديدها بشكل خاطئ11،12. بالإضافة إلى اختبار خطوط الخلايا للتلوث بالميكوبلازما ، يجب أيضا اختبارها للتلوث المتبادل10. بالنسبة لخطوط الخلايا البشرية ، فإن مصادقة خط الخلية بواسطة تقنية غير مكلفة قائمة على الحمض النووي تسمى التنميط القصير للتكرار الترادفي (STR) هي المعيار المرجعي الدولي الحالي ، لأنها طريقة سهلة لتأكيد هوية خط الخلية2،10،13،14. يمكن ل STR تحديد خطوط الخلايا ذات العلامات الخاطئة أو الملوثة ، ولكن لا يمكنها اكتشاف أصل الأنسجة غير الصحيح10،13،14. يمكن أن تتعرض صحة بيانات البحث للخطر إذا تم تسمية خطوط الخلايا بشكل خاطئ أو تم تحديدها بشكل خاطئ أو ملوثة13. على غرار الأنواع الأخرى من التلوث ، يمكن أن يحدث التلوث المتبادل بسبب سوء التقنية التي تتسبب في انتشار الهباء الجوي ، أو الاتصال الخاطئ الذي يؤدي إلى دخول نوع الخلية الخطأ إلى قارورة ، أو استخدام نفس زجاجة الوسائط والكواشف بخطوط خلايا مختلفة10. لا ينبغي أن يحدث أي مشاركة لزجاجات الوسائط ؛ يمكن أن تسمح مشاركة زجاجة واحدة من الوسائط بين خطين خلويين مختلفين بخلط مجموعات الخلايا هذه ، مما يؤدي إلى استيلاء نوع الخلية الأسرع نموا على القارورة تماما. هذا الاستبدال غير ملحوظ ويؤدي إلى خطأ في التسمية والتعريفالخاطئ 2. يمكن أيضا الخلط بين خط الخلية وخط آخر إذا تم الخلط بين الثقافات أثناء المناولة أو وضع العلاماتعلى 10. يجب إيلاء اهتمام دقيق للحفاظ على الكواشف والوسائط والقوارير منفصلة عن بعضها البعض. يجب أن يكون لكل عضو في المختبر زجاجات وسائط خاصة به ؛ يجب ألا تحدث مشاركة بين أعضاء المختبر. يجب شراء خطوط الخلايا نفسها من بنك خلوي مؤهل ومزود. يجب ألا تشارك المختبرات الخلايا. تشير الدراسات إلى أنه على الرغم من استخدام اختبارات STR والميكوبلازما بانتظام ، فقد استخدمت العديد من الأوراق البحثية في الأدبيات بالفعل خطوط خلايا خاطئة أو ملوثة15. إن غربلة البحث للعثور على هذه الأوراق الإشكالية وإبلاغ القراء بأثر رجعي بهذا الأمر أمر مرهق. الوقاية هي أفضل طريقة لضمان عدم حدوث هذه المشكلة في المقام الأول.
الإجراء البسيط لرش العناصر بنسبة 70٪ EtOH يمكن أن يقتل الكائنات الحية ؛ يعمل 70٪ EtOH عن طريق تغيير طبيعة البروتينات وإذابة الدهون في الكائنات الحية الأكثر تلويثا ، بما في ذلك البكتيريا والفطريات16. وقد أظهرت الدراسات أن 70 ٪ هو التركيز الأكثر فعالية. لا تتخثر البروتينات السطحية بسرعة مع 70٪ EtOH حتى تتمكن من دخول الخلية ، في حين أن الماء الذي يحتوي عليه ضروري لعملية تغيير طبيعة البروتينات. بسبب اختلاف تركيز الماء والكحول على جانبي جدار الخلية ، يدخل 70٪ EtOH الخلية لتشويه كل من البروتينات الأنزيمية والهيكلية. إذا لوحظ نمو العفن في قوارير ، فيجب تطهير الحاضنة بأكملها عن طريق رشها أولا بنسبة 70٪ EtOH ومسحها جافة ، تليها حضانة ليلية لمدة 16 ساعة عند 60 درجة مئوية17. هذا يقتل معظم العفن وأي بكتيريا.
الميزة الرئيسية لممارسات الوقاية على التقنيات البديلة للقضاء على التلوث بعد حدوثه هي أنه من خلال منع التلوث في وقت مبكر ، يمكن للعاملين في المختبرات التأكد من أن مزارع الخلايا الخاصة بهم صحية ولن تكون هناك تكاليف عالية مرتبطة بإزالة التلوث من الحاضنات أو التخلص من مزارع الخلايا. القضاء على ملوثات الميكوبلازما بعد ، على سبيل المثال ، ليس فعالا7. إن أخذ الوقت مبكرا لضمان تدريب موظفي المختبر بشكل صحيح ، وغرفة زراعة الخلايا قائمة بذاتها ، واستخدام إجراء قياسي سيوفر الوقت والمال.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14-190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F-12 Media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Baffled Flask</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td>09-552-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>13-681-15A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-202-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Items may vary because this video is about general cell culture techniques</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture techniques and practices to avoid contamination by fungi and bacteria in the research cell culture laboratory

زراعة الخلايا هي مهارة دقيقة ضرورية لزراعة الخلايا البشرية والحيوانية والحشرية ، أو الأنسجة الأخرى ، في بيئة خاضعة للرقابة. الهدف من البروتوكول هو التأكيد على التقنيات الصحيحة المستخدمة في مختبر الأبحاث لمنع التلوث من الفطريات والبكتيريا. يتم التركيز بشكل خاص على تجنب تلوث الميكوبلازما ، وهو مصدر قلق كبير في غرفة زراعة الخلايا نظرا لصغر حجمها ومقاومتها لمعظم المضادات الحيوية المستخدمة في زراعة الخلايا. هذه التقنيات نفسها تضمن النمو المستمر والحفاظ على الخلايا السليمة. بالنسبة لمستخدمي زراعة الخلايا الجدد وذوي الخبرة على حد سواء ، من المهم الالتزام باستمرار بأفضل الممارسات هذه للتخفيف من مخاطر التلوث. مرة واحدة في السنة ، يجب على المختبرات مراجعة أفضل ممارسات زراعة الخلايا والمتابعة بمناقشة أو تدريب إضافي إذا لزم الأمر. إن اتخاذ إجراءات مبكرة لمنع التلوث في المقام الأول سيوفر الوقت والمال ، مقارنة بالتنظيف بعد حدوث التلوث. تحافظ أفضل الممارسات العالمية على صحة مزارع الخلايا ، وبالتالي تقليل الحاجة إلى إذابة الخلايا الجديدة باستمرار ، وشراء وسائط زراعة الخلايا باهظة الثمن ، وتقليل كمية تطهير الحاضنة ووقت التوقف عن العمل.

إذا لم يتم اتباع تقنيات وممارسات زراعة الخلايا المناسبة الموضحة في هذه الورقة ، فقد يحدث تلوث بالفطريات والبكتيريا في مختبر زراعة الخلايا البحثي. يوضح الشكل 2 قوارير تحتوي على تلوث في كل من الثقافات المعلقة والملتصقة.
عند عدم اتباع تقنيات التعقيم ، قد يحدث ت...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory at JoVE.com

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

يقدم هذا البروتوكول تقنيات وممارسات زراعة الخلايا الأساسية لاستخدامها في مختبر زراعة الخلايا البحثية لتجنب التلوث بالفطريات والبكتيريا. ضمن فئة البكتيريا ، سيتم التركيز بشكل خاص على منع تلوث الميكوبلازما.

تقنيات وممارسات زراعة الخلايا لتجنب التلوث بالفطريات والبكتيريا في مختبر زراعة الخلايا البحثية

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...

زراعة الخلايا هي مهارة دقيقة ضرورية لزراعة أنواع مختلفة من الخلايا والأنسجة في بيئة معملية خاضعة للرقابة. الشاغل الرئيسي عند القيام بعمل زراعة الخلايا هو التلوث. يمكن أن يأتي هذا التلوث في شكل بكتيريا أو عفن أو ميكوبلازما.ستضمن جميع التقنيات والممارسات الموضحة في هذا الفيديو بقاء خلاياك قابلة للحياة وصحية وخالية من التلوث. يجب الالتزام الصارم بهذه الممارسات ، ويجب أن يتلقى جميع موظفي المختبر التدريب مرة واحدة على الأقل في السنة. قبل البدء في العمل ، ارتد معطفا مختبريا نظيفا مخصصا للاستخدام في غرفة زراعة الخلايا فقط.ارتد قفازات جديدة لم تلمس أي أسطح أخرى. تأكد من أن القفازات مناسبة بإحكام. قفازات خالية من مسحوق النتريل هي الأفضل.لا يلزم أن يكون معطف المختبر والقفازات معقمة. للتحضير للعمل ، رش القفازات وأكمام معطف المختبر والجزء الداخلي من خزانة السلامة البيولوجية بنسبة 70٪ من الإيثانول. رش سطح العمل والجوانب والظهر وأي عناصر في الخزانة واللوحة الزجاجية الأمامية ، من الداخل والخارج.امسح سطح العمل واللوحة الزجاجية جافة بمنشفة ورقية خالية من النسالة. خذ بعض الوقت لترتيب مساحة العمل داخل الخزانة. احتفظ بحمامات مائية داخل غرفة زراعة الخلايا واستخدمها فقط لأغراض زراعة الخلايا ، مثل تسخين الوسائط أو إذابة الخلايا.يجب تصريف الحمامات المائية وغسلها مرة واحدة في الأسبوع. قلل من كمية العناصر التي يتم إحضارها إلى الخزانة ولا تقاطع تدفق الهواء داخل خزانة الأمان البيولوجي عن طريق سد الشوايات الأمامية أو الخلفية. رش جميع العناصر الموضوعة داخل الخزانة بنسبة 70٪ إيثانول وامسحها حتى تجف.ابدأ برش الجزء العلوي من زجاجة الوسائط وشق طريقك لأسفل. باستخدام منشفة ورقية نظيفة ، ابدأ من أعلى زجاجة الوسائط لمسحها حتى تجف ، وشق طريقك تدريجيا إلى الأسفل. لا تعود نحو الغطاء.الطريقة التي تعمل بها هذه الخزانات هي أنها تسحب الهواء من الغرفة والخزانة نفسها من خلال الشوايات الأمامية والخلفية. يذهب الهواء نحو الجزء الخلفي من الخزانة وحتى الأعلى. هناك ، يمر الهواء الملوث عبر كومة من المرشحات ، ويتم دفع جزء من الهواء النظيف المصفى لأسفل على منطقة العمل في الخزانة.إذا كانت الخزانة كبيرة بما يكفي لاستيعاب الماصات المصلية ، فيمكن وضعها في الداخل ، وإلا يمكن تخزينها في وعاء مثبت على السطح الخارجي للخزانة. من الممارسات الجيدة فحص جانبي الماصة المغلفة بحثا عن ثقوب أو تمزقات أو ثقوب في العبوة قبل الاستخدام. لا تمزق الغلاف.بدلا من ذلك ، قشر أطراف الغلاف برفق. أدخل الماصة المصلية في أداة مساعدة الماصة وقم بإزالة الغلاف بحركة سائلة واحدة. لا تحوم فوق أي زجاجات أو قوارير مفتوحة.لا ينصح بالوصول إلى زجاجة أو قارورة مفتوحة ، أو العمل فوق قوارير مفتوحة. تدفق الهواء داخل الخزانات يدفع لأسفل على أي شيء بالداخل. سيسمح الوصول إلى أكثر من ذلك بأن يكون كمك أو قفازك فوق العناصر التي يمكن أن تدفع أي تلوث موجود على جعبتك على سبيل المثال ، إلى مزرعة خليتك.كلما كان ذلك ممكنا ، لا تصب السوائل. بدلا من ذلك ، قم بإضافتها باستخدام ماصة مصلية. امزج المحتويات جيدا وقم ببدء الزجاجة.اكتب ما تستكمل به الوسائط. إذا كنت تعمل مع ثقافات ملتصقة وتحتاج إلى قارورة بلاستيكية ، فقم برش العبوة بأكملها ووضعها في الداخل. في أي وقت تجف فيه قفازاتك ، قم برشها بالإيثانول مرة أخرى.عند العمل مع خط خلية ملتصق ، استخدم ماصات زجاجية معقمة أو ماصات بلاستيكية معقمة يمكن التخلص منها لشفط الوسائط أو محاليل الغسيل. قم بإزالة الغطاء المعدني بعناية من حاوية التخزين. اعزل ماصة زجاجية واحدة عن طريق هز الحاوية برفق بزاوية.عند الوصول إلى الحاوية ، تجنب لمس أي ماصات أخرى. تعامل مع الماصة المختارة من طرف واحد فقط. استبدل الأغطية الموجودة على الزجاجات والقوارير بسرعة في أسرع وقت ممكن.ضع أغطية على سطح العمل رأسا على عقب حتى لا تلمس الحافة سطح العمل. لا تمسك الغطاء من الأعلى أو الأسفل. بدلا من ذلك ، المس قبعات من الجانبين.عند شفط السوائل ، استخدم قارورة مصيدة فراغ تقع خارج الخزانة في حاوية ثانوية على الأرض. سيتم إنشاء النفايات أثناء العمل داخل الخزانة. نظرا لأن تحريك اليدين داخل وخارج الخزانة كثيرا سيقطع تدفق الهواء ، فلا بأس من ترك أي نفايات داخل الخزانة مؤقتا.ضعه جانبا حتى لا يقاطع عملك. رش القفازات بسخاء بنسبة 70٪ من الإيثانول في أي وقت تصبح جافة. افرك يديك معا حتى لا تقطر مبللة.ملاحظة سريعة حول الماصات المصلية. إذا لمسوا عن طريق الخطأ شيئا آخر في غطاء المحرك ، فلا تتردد في التخلص منهم. من الأفضل أن تبدأ من جديد باستخدام ماصة مصلية نظيفة بدلا من استخدام ماصة قد تكون ملوثة.قبل وضع الخلايا في الحاضنة ، تحقق لترى كيف تبدو تحت المجهر. يجب مراعاة الخلايا المفردة. يشير هذا إلى إعادة تعليق الخلايا تماما.لا تتحدث أو تعطس أو تسعل أو تتنفس بشدة في الحاضنات. فتح وإغلاق أبواب الحاضنة بسرعة. قد يسمح تركها مفتوحة لفترة أطول من اللازم للملوثات الموجودة في الهواء بدخول الحاضنات.تأكد من إغلاق أغطية جميع الزجاجات تماما قبل إخراجها من الخزانة. الوسائط حساسة للضوء. يجب تخزينه في الظلام عند أربع درجات مئوية عندما لا يكون قيد الاستخدام.رش الجزء الداخلي من الخزانة بنسبة 70٪ إيثانول مرة أخرى بعد اكتمال أعمال زراعة الخلايا وامسح السطح حتى يجف بمنشفة ورقية. أفرغ كيس النفايات البيولوجية الخطرة. كرر هذه العملية واستبدل القفازات عند التبديل إلى خط خلية مختلف.عند العمل مع ثقافات التعليق المزروعة في قوارير زجاجية ، تأكد من أن القفازات مبللة. المس رقائق الألومنيوم بقفازاتك المبللة ثم رش الجزء السفلي من القارورة فقط قبل وضعها داخل خزانة السلامة البيولوجية. عند أخذ عينة لعد الخلايا ، قم بإزالة أنبوب واحد فقط سعة 1.5 مل من الحاوية الخاصة به.لا تلمس أيا من الأنابيب الأخرى. ضع الغطاء رأسا على عقب على سطح العمل. لا تلمس الحافة الداخلية.تعامل معها بعناية من الجوانب واستبدلها بمجرد الانتهاء. عند التعامل مع خلايا التعليق والقوارير الزجاجية ، قم بإزالة قطعة رقائق الألومنيوم المطوية المزدوجة بعناية والتي تغطي عنق القارورة بالكامل. اسحب برفق جميع الزوايا الأربع وضع الرقاقة رأسا على عقب على سطح العمل.تعامل مع القارورة الزجاجية من الأسفل فقط. لا تلمسه من الرقبة بمجرد إزالة الرقاقة. استخدم ماصة مصلية سعة 1 مل لأخذ عينة لعد الخلايا.لا تدع الوسائط تقطر على جانب القوارير. إذا حدث ذلك ، قم برش منشفة ورقية بنسبة 70٪ إيثانول وقم بتنظيفه على الفور. تأكد من إحكام ربط الأغطية أو رقائق الألومنيوم قبل إزالة الزجاجات أو القوارير من خزانات السلامة البيولوجية.استخدم حاضنات منفصلة لأنواع الخلايا المختلفة. هذا سيمنع التلوث المتبادل لأنواع الخلايا المختلفة. يوصى بوضع قارورة مصيدة التفريغ لجمع النفايات السائلة خارج الخزانة على الأرض في حاوية ثانوية تحمل علامة النفايات.يتم توصيل الخرطوم بفلتر يتم استبداله على أساس شهري. يدخل الخرطوم عبر جانب الخزانة. قم بإزالة القمامة البيولوجية بمجرد اكتمال العمل.احتفظ ببروتوكول غسيل الزجاج على الحائط بجوار الحوض. أولا ، انقع الخلايا المهملة بنسبة 10٪ مبيض لمدة خمس دقائق تقريبا. ثم تخلص من خليط التبييض واشطف القارورة جيدا بالماء.أضف الصابون بالماء ، وافركه بفرشاة جيدا ، واشطفه بمزيد من الماء. ثم الخطوة الأخيرة هي شطف الأواني الزجاجية بماء DI على الصنبور على اليمين. اغسل القوارير الزجاجية في أسرع وقت ممكن ، افرك الأواني الزجاجية جيدا.ستترك خلايا Sf9 حافة الخلايا الميتة هذه إذا لم يتم تنظيفها بشكل صحيح. استخدم هذه القوارير فقط لزراعة الخلايا ، والأواني الزجاجية لزراعة خلايا الأوتوكلاف بدلا من إرسالها إلى منشأة غسيل الزجاج. استخدم دورة الفراغ على الأوتوكلاف لمدة 40 دقيقة من وقت التعقيم و 40 دقيقة من وقت الجفاف.احتفظ بها منفصلة عن الأواني الزجاجية في المنطقة الرئيسية من المختبر. تنظيم غرفة زراعة الخلايا بحيث تكون جميع الإمدادات موجودة في منطقة واحدة ، وبالتالي تقليل الحاجة إلى خروج أعضاء المختبر من غرفة زراعة الخلايا بحثا عن الإمدادات. قم بتسمية أي زجاجات بلاستيكية تستخدم لحصاد الخلايا وإعادة استخدامها في زراعة الخلايا بعد ذلك ، لاستخدام زراعة الخلايا فقط.استخدم زجاجات زراعة الخلايا المخصصة لنوع خلية واحد محدد. قم بتخزين هذه الزجاجات في غرفة زراعة الخلايا لسهولة الوصول إليها. بالنسبة للثقافات التي تزرع في التعليق ، سيتم التعرف على العفن على أنه كرات عائمة في الوسائط.أما بالنسبة للتلوث البكتيري ، فسوف يحول الوسائط إلى اللون الأبيض والغائم. وبالمثل ، بالنسبة للخلايا الملتصقة ، يمكن التعرف بسهولة على تلوث العفن على أنه بقع غامضة. سوف يتحول التلوث البكتيري عادة إلى وسائط صافية ، بيضاء وغائمة.يمكن تحديد العديد من أنواع الميكوبلازما بشكل موثوق باستخدام مقايسة PCR. يوضح الشريط الموجود على اليسار معايير الوزن الجزيئي للحمض النووي. النطاقات الأربعة الموجودة على اليمين هي عناصر تحكم موجبة.لا تظهر أي نطاقات تحت أنواع الخلايا المختبرة لأنه لم يتم اكتشاف الميكوبلازما. سيتغير لون وسائط زراعة الخلايا من الأحمر إلى الأصفر في حالة وجود مؤشرات الأس الهيدروجيني. يشير اللون الأصفر إلى أن الرقم الهيدروجيني منخفض ويجب استبدال الوسائط.إذا لوحظت زيادات أو أشكال خلايا أخرى تحت المجهر الضوئي أثناء إجراء تعداد الخلايا ، فقد يكون هذا مؤشرا على التلوث. لاحظ أنه يجب إجراء تطهير شامل لمقياس الدم قبل عد الخلايا لأن هذا النوع من الحطام قد يكون موجودا فقط على مقياس الدم وليس في مزرعة الخلية نفسها. في حين أن التلوث هو أحد الاهتمامات الرئيسية عند إجراء عمل زراعة الخلايا ، يمكن التخفيف من هذه المخاطر باتباع الممارسات والتقنيات الموضحة في هذا الفيديو.إذا تم إجراء اختبار الميكوبلازما الشهري كل شهر ، يتم تدريب موظفي المختبر على أساس سنوي ويتم الالتزام الصارم بهذه الممارسات ، ثم ستبقى خلاياك صحية وخالية من التلوث. سيساعد هذا أيضا في تقليل التكاليف المرتبطة بشراء وسائط زراعة الخلايا باهظة الثمن ، وشراء خلايا جديدة ، وسيقلل من وقت تعطل إزالة التلوث من الحاضنة. تذكر أن مفتاح نجاح زراعة الخلايا هو العمل المبكر لمنع التلوث في المقام الأول.

Research

JoVE Journal

Biology

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

ES خلايا الإنسان : ثقافة ابتداء من خلايا مجمدة

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Title Cell Encapsulation by Droplets

عنوان تغليف الخلية عن طريق الرذاذ

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

الابتدائية الثقافة وElectroporation البلازميد الجهاز الفئران كورتي.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

تحديد عدد الخلايا خلال زراعة الخلايا باستخدام خلية مكافحة الصولجان

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

التعريفي واختبار نقص الأكسجة في الثقافة خلية

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

أسلوب الثقافة شريحة لوبعد تطور الجراثيم الأسنان في يزدرع الثقافة

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

العزلة والثقافة، وزرع خلايا العضلات الأقمار الصناعية

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

الكشف عن البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي<em&gt; في المختبر</em&gt; RNA المنسدلة في خلية شحمية الثقافة

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...