Name: cell culture techniques and practices to avoid contamination by fungi and bacteria in the research cell culture laboratory
Uploaded: 2023-07-07T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory at JoVE.com

Dette arbejde er blevet muligt takket være finansiering fra Howard Hughes Medical Institute (HHMI). Vi vil gerne takke vores laboratorieleder, Jue Chen, for at læse manuskriptet og for hendes fortsatte støtte, Donna Tallent for hendes nyttige redigeringer og kommentarer og Jeff Hennefeld fra informationsteknologiafdelingen ved Rockefeller University for hans hjælp med videokomponenten i dette manuskript.

1. Forberedelser 
<ol><li>Generel<ol><li>Brug en ren laboratoriefrakke, der kun er beregnet til at blive båret i cellekulturrummet og ingen andre dele af laboratoriet. BEMÆRK: Labcoaten behøver ikke at være steril.</li>
		<li>Brug nye handsker, der ikke har rørt andre overflader. Sørg for, at handskerne sidder tæt. Nitril, pulverfri handsker er bedst. BEMÆRK: Handskerne behøver ikke at være sterile.</li>
		<li>For at forberede dig på arbejde skal du sprøjte handskerne, laboratoriefrak...

<ol>
	<li>Johnson, Z. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+substrate+recognition+by+the+multidrug+resistance+protein+MRP1.">Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1.</a> Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).</li><li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+as+biological+models:+practical+steps+for+more+reliable+research.">Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research.</a> Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).</li><li>Segeritz, C. P., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+growing+cells+as+model+systems+in+vitro.">Cell culture: growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li><li>Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+contamination:+sources,+consequences,+prevention,+and+elimination.">Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination.</a> Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).</li><li>Nikfarjam, L., Farzaneh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+detection+of+mycoplasma+contamination+in+cell+culture.">Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture.</a> Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).</li><li>Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+contamination.">Cell culture contamination.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).</li><li>Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mycoplasma+in+cell+cultures.">Detection of Mycoplasma in cell cultures.</a> Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).</li><li>Barth, O. M., Majerowicz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+by+transmission+electron+microscopy+of+mycoplasma+contamination+in+sera+and+cell+cultures.">Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).</li><li>Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+are+useful+model+systems+for+medical+research.">Cancer cell lines are useful model systems for medical research.</a> Cancers. 11 (8), 1098 (2019).</li><li>A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science Available from: <a target="_blank" href="https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you">https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you</a> (2020)</li><li>Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+contamination:+an+overview.">Cell culture contamination: an overview.</a> Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).</li><li>Babic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-research:+Incidences+of+problematic+cell+lines+are+lower+in+papers+that+use+RRIDs+to+identify+cell+lines.">Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines.</a> eLife. 8, e41676 (2019).</li><li>Visconti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+tandem+repeat+profiling+for+the+authentication+of+cancer+stem-like+cells.">Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells.</a> International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).</li><li>Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ghosts+of+HeLa:+How+cell+line+misidentification+contaminates+the+scientific+literature.">The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature.</a> PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).</li><li>Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal Available from: <a target="_blank" href="https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference">https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference</a> (2023)</li><li>United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications Available from: <a target="_blank" href="https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf">https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf</a> (2004)</li><li>Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html">https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html</a> (2023)</li><li>Cot&#233;, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+technique+for+cell+culture.">Aseptic technique for cell culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Uphoff, C. C., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+Mycoplasma+contamination+from+cell+cultures.">Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).</li><li>Bykowski, T., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+technique.">Aseptic technique.</a> Current Protocols in Microbiology. 56 (1), e98 (2020).</li><li>How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire Available from: <a target="_blank" href="https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article">https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article</a> (2020)</li><li>Phelan, K., May, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+tissue+culture+techniques.">Mammalian cell tissue culture techniques.</a> Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).</li></ol>

Mens forurening er en af de primære bekymringer, når man udfører cellekulturarbejde, vil den praksis og de teknikker, der er skitseret i dette manuskript, hjælpe med at afbøde risiciene. De kritiske trin inkluderer at bære en ren laboratoriefrakke, som kun bruges i cellekulturrummet, ved hjælp af rene, pulverfrie handsker, der ofte sprøjtes med 70% EtOH, og som skiftes, når der skiftes mellem cellelinjer, opfordrer hver enkelt person til ikke at dele medieflasker, rengør kabinettet grundigt før og efter afslut...

Cellekultur har mange anvendelser i forskningslaboratoriet. Siden cellekulturens oprindelse i begyndelsen af det 20. århundrede har cellelinjer hjulpet med at fremme videnskaben. Cellelinjer har flere fordele; Forskellige cellelinjer kan hjælpe forskere med at studere cellebiologi, producere baculovirus til yderligere undersøgelser eller producere store mængder af et protein af interesse, for at nævne nogle få1. Nogle yderligere anvendelser omfatter undersøgelse af vævsvækst, hjælp til at fremme vaccineudvikling, toksikologiforskning, undersøgelse af genernes rolle i sunde organismer og syge modeller og produktion af hybridcellelinjer 2,3. Cellelinjer kan også muliggøre lægemiddelproduktion3. Korrekte aseptiske teknikker er nødvendige, når man arbejder med cellelinjer; De fremgangsmåder og teknikker, der er skitseret i dette manuskript, gælder for forskningslaboratorier, hvor cellekulturarbejde udføres. Andre laboratorieindstillinger diskuteres ikke.
Forurening er ofte den primære bekymring, når man udfører cellekulturarbejde. I forbindelse med dette papir refererer forurening generelt til svampe og bakterier. Det overordnede mål med den metode, der er skitseret i dette papir, er grundigt at beskrive de bedste fremgangsmåder for at undgå forurening. Alle laboratoriemedlemmer skal overholde denne praksis, når de arbejder i et forskningslaboratoriums cellekulturrum. Laboratorierne bør sikre, at alle arbejdstagere deltager aktivt i anvendelsen af denne bedste praksis til forebyggelse af kontaminering. Kendskabet til den korrekte praksis og teknikker vil hjælpe med at sikre, at cellekulturer forbliver levedygtige, sunde og fri for forurening. Udviklingen af denne teknik er baseret på litteraturforskning, syv års erfaring med at arbejde med cellekulturer og behovet for en metode, som både nybegyndere og erfarne cellekulturarbejdere kan henvise til årligt.
Der er behov for en klar, standardiseret teknik, som alle forskningscellekulturlaboratorier bør følge. Meget af litteraturen om cellekulturkontaminering diskuterer påvisning af mycoplasma, aseptiske teknikker, forureningskilder, eliminering af forurenende stoffer og forebyggelse ved brug af antibiotika og regelmæssig test 4,5,6,7,8. Selvom disse oplysninger er nyttige, er der ingen videoer til stede i litteraturen, der demonstrerer de korrekte cellekulturteknikker, man skal følge. Fordelen ved den praksis, der præsenteres i forhold til alternative teknikker, er et fokus på at forhindre forurening, før den sker, snarere end at opdage og rette fejl senere. Desuden er en grundig demonstration af aseptiske teknikker, en diskussion om forebyggelse af svampe og bakterievækst og information om biosikkerhedskabinettets luftstrøm værdifulde for både nybegyndere og erfarne cellekulturarbejdere.
Bakterier og svampe er de to mest almindelige typer forurenende stoffer. Inden for bakteriekategorien er mycoplasma et stort problem på grund af dets lille størrelse og evne til at sprede sig, mens det forbliver ubemærket. De er selvreplikerende organismer uden stiv cellevæg, der er afhængige af eukaryote celler for at vokse. De har reducerede metaboliske evner og kan formere sig meget, mens de forbliver ukendte i den rutinemæssige visuelle inspektion af cellekulturer og regelmæssig mikroskopisk analyse, selvom transmissionselektronmikroskopi kan detektere mycoplasma 9,10. Desuden kan de passere gennem mikrobiologiske filtre10. Cellekulturmedium giver mycoplasma næringsstoffer, selvom supplering af medier med antibiotika desværre ikke påvirker mycoplasma10. Man skal bemærke, at det generelt ikke er nødvendigt at supplere medier med antibiotika; Korrekte teknikker bør være tilstrækkelige til at holde forureningen i skak. Infektion med mycoplasma fører ikke til øjeblikkelig celledød, men det er bekymrende for forskere, da det påvirker datareproducerbarhed og kvalitet.
Alt laboratoriepersonale bør nøje overholde god cellekulturpraksis. Kulturer bør testes for mycoplasma, efter at de er blevet nykøbt, mens de dyrkes i øjeblikket, før kryopræservering, og når de optøes fra flydende nitrogen 2,10. Forskellige tests er tilgængelige på markedet ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR), enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) eller immunfarvning. 3 Litteraturen indikerer, at "humane isolater udgør en stor procentdel af de mycoplasma-kontaminanter, der findes i cellekultur"5. Selvom mere end 200 mycoplasmaarter er blevet beskrevet, tegner omkring seks af disse sig for de fleste infektioner. Disse seks arter er M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale og Acholeplasma laidlawii10. Som med andre former for forurening bringer luft og aerosoler disse ind i cellekulturer5. Dette gentages i andre artikler, da "den menneskelige operatør potentielt er den største fare i laboratoriet"7. Selvom dette gøres gennem menneskelige fejl, kan risikoen elimineres, hvis en standardprocedure følges. Afgivelse fra personale er ikke begrænset til kun mycoplasmakontaminering; Cellekulturer i et laboratorium er normalt inficeret med de samme mycoplasmaarter, hvilket indikerer, at forurening spredes fra en kolbe til en anden på grund af ukorrekte cellekulturteknikker10.
Forebyggelse af krydskontaminering er også en anden grund til, at korrekte cellekulturteknikker skal følges. Det bemærkes, at mindst 15%-18% af cellelinjer på verdensplan kan være krydskontaminerede eller fejlidentificerede11,12. Ud over at teste cellelinjer for mycoplasmakontaminering bør de også testes for krydskontaminering10. For humane cellelinjer er cellelinjegodkendelse ved hjælp af en billig DNA-baseret teknik kaldet kort tandemgentagelse (STR) profilering den nuværende internationale referencestandard, da det er en nem måde at bekræfte cellelinjeidentitet 2,10,13,14. STR kan identificere fejlmærkede eller krydskontaminerede cellelinjer, men det kan ikke detektere forkert vævsoprindelse10,13,14. Gyldigheden af forskningsdata kan kompromitteres, hvis cellelinjer er forkert mærket, forkert identificeret eller forurenet13. I lighed med andre typer kontaminering kan krydskontaminering forekomme på grund af dårlig teknik, der får aerosoler til at sprede sig, forkert kontakt, der fører til, at den forkerte celletype kommer ind i en kolbe eller bruger den samme medieflaske og reagenser med forskellige cellelinjer10. Der bør ikke deles medieflasker; Deling af en flaske medier mellem to forskellige cellelinjer kan gøre det muligt at blande disse cellepopulationer, hvilket fører til, at den hurtigere voksende celletype helt overtager kolben. Denne udskiftning er ikke mærkbar og fører til fejlmærkning og fejlidentifikation2. En cellelinje kan også forveksles med en anden, hvis kulturer er forvirrede under håndtering eller mærkning10. Der skal lægges stor vægt på at holde reagenser, medier og kolber adskilt fra hinanden. Hvert laboratoriemedlem skal have deres egne medieflasker; Der bør ikke ske deling mellem laboratoriemedlemmer. Cellelinjer selv bør købes fra en kvalificeret cellebank og udbyder. Laboratorier bør ikke dele celler. Undersøgelser viser, at selvom STR- og mycoplasma-test regelmæssigt anvendes, har mange forskningsartikler i litteraturen allerede brugt fejlidentificerede eller forurenede cellelinjer15. Sigtning gennem forskningen for at finde disse problematiske papirer og med tilbagevirkende kraft informere læserne om denne sag er besværlig. Forebyggelse er den bedste måde at sikre, at dette problem ikke opstår i første omgang.
Den enkle handling at sprøjte genstande med 70% EtOH kan dræbe organismer; 70% EtOH virker ved at denaturere proteiner og opløse lipider i de mest almindeligt forurenende organismer, herunder bakterier og svampe16. Undersøgelser har vist, at 70% er den mest effektive koncentration; overfladeproteiner koagulerer ikke hurtigt med 70% EtOH, så de kan komme ind i cellen, mens vandet, det indeholder, er nødvendigt for denatureringsprocessen af proteiner. På grund af koncentrationsforskellen mellem vand og alkohol på hver side af cellevæggen kommer 70% EtOH ind i cellen for at denaturere både enzymatiske og strukturelle proteiner. Hvis der observeres skimmelvækst i kolber, skal hele inkubatoren dekontamineres ved først at sprøjte den med 70% EtOH og tørre den tør efterfulgt af en 16 timers inkubation natten over ved 60 °C17. Dette dræber de fleste skimmel og eventuelle bakterier.
Den største fordel ved forebyggelsespraksis i forhold til alternative teknikker til eliminering af kontaminering, efter at den er opstået, er, at laboratoriearbejdere ved at forhindre kontaminering tidligt kan være sikre på, at deres cellekulturer er sunde, og at der ikke vil være høje omkostninger forbundet med dekontaminering af inkubatorer eller kassering af cellekulturer. Eliminering af mycoplasma-kontaminanter efter f.eks. er ikke effektiv7. At tage sig tid tidligt til at sikre, at laboratoriepersonalet er ordentligt uddannet, cellekulturrummet er selvstændigt, og der anvendes en standardprocedure, sparer tid og penge.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14-190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F-12 Media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Baffled Flask</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td>09-552-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>13-681-15A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-202-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Items may vary because this video is about general cell culture techniques</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture techniques and practices to avoid contamination by fungi and bacteria in the research cell culture laboratory

Cellekultur er en delikat færdighed, der er nødvendig for dyrkning af menneske-, dyre- og insektceller eller andre væv i et kontrolleret miljø. Målet med protokollen er at understrege de korrekte teknikker, der anvendes i et forskningslaboratorium for at forhindre forurening fra svampe og bakterier. Der lægges særlig vægt på at undgå mycoplasmakontaminering, et stort problem i cellekulturrummet på grund af dets lille størrelse og resistens over for de fleste antibiotika, der anvendes til cellekultur. Disse samme teknikker sikrer kontinuerlig vækst og opretholder sunde celler. For både nye og erfarne cellekulturbrugere er det vigtigt konsekvent at overholde disse bedste fremgangsmåder for at mindske risikoen for kontaminering. En gang om året bør laboratorier gennemgå bedste praksis for cellekultur og følge op med en diskussion eller yderligere træning, hvis det er nødvendigt. Tidlig handling for at forhindre forurening i første omgang vil spare tid og penge sammenlignet med oprydning efter forurening. Universel bedste praksis holder cellekulturer sunde og reducerer derved behovet for konstant at tø nye celler op, købe dyre cellekulturmedier og reducere mængden af inkubatordekontaminering og nedetid.

Hvis de korrekte cellekulturteknikker og -praksis, der er skitseret i dette papir, ikke følges, kan forurening med svampe og bakterier forekomme i forskningscellekulturlaboratoriet. Figur 2 viser kolber, der indeholder kontaminering i både suspensionskulturen og den vedhængende kultur.
Når man ikke følger aseptiske teknikker, kan skimmelforurening forekomme 2-3 dage senere. Runde fuzzy bolde, der flyder i medierne, er mærkbare i suspensionsceller, mens skimm...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory at JoVE.com

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

Denne protokol præsenterer vigtige cellekulturteknikker og -praksis, der skal anvendes i forskningscellekulturlaboratoriet for at undgå forurening med svampe og bakterier. Inden for kategorien bakterier vil der blive lagt særlig vægt på at forhindre mycoplasma-kontaminering.

Cellekulturteknikker og praksis for at undgå forurening med svampe og bakterier i forskningscellekulturlaboratoriet

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...

Cellekultur er en delikat færdighed, der er nødvendig for dyrkning af forskellige typer celler og væv i en kontrolleret laboratorieindstilling. Den primære bekymring ved udførelse af cellekulturarbejde er forurening. Denne forurening kan komme i form af bakterier, skimmel eller mycoplasma.De teknikker og fremgangsmåder, der alle er skitseret i denne video, sikrer, at dine celler forbliver levedygtige, sunde og forureningsfrie. Denne praksis bør overholdes nøje, og alt laboratoriepersonale skal modtage uddannelse mindst en gang om året. Før arbejdet påbegyndes, skal du bære en ren laboratoriefrakke, der kun er beregnet til brug i cellekulturrummet.Brug nye handsker, der ikke har rørt andre overflader. Sørg for, at handskerne sidder tæt. Nitrilpulverfrie handsker er bedst.Labcoaten og handskerne behøver ikke at være sterile. For at forberede sig på arbejde skal du sprøjtehandsker, laboratoriefrakkeærmer og indersiden af det biologiske sikkerhedsskab med 70% ethanol. Sprøjt arbejdsfladen, siderne, bagsiden, eventuelle genstande i kabinettet og frontglaspanelet, både indefra og udefra.Tør arbejdsfladen og glaspanelet af med et fnugfrit køkkenrulle. Tag dig tid til at arrangere arbejdsområdet inde i kabinettet. Hold vandbade inde i cellekulturrummet og brug kun disse til cellekulturformål, såsom opvarmningsmedier eller optøning af celler.Vandbadene skal drænes og vaskes en gang om ugen. Begræns mængden af genstande, der bringes ind i kabinettet, og afbryd ikke luftstrømmen inde i det biologiske sikkerhedsskab ved at blokere front- eller baggitterne. Spray alle genstande, der er placeret inde i skabet, med 70% ethanol og tør dem tørre.Begynd med at sprøjte toppen af medieflasken og arbejd dig ned. Med et rent køkkenrulle skal du starte fra toppen af medieflasken for at tørre den af og gradvist arbejde dig op til bunden. Gå ikke tilbage op mod hætten.Den måde, disse skabe fungerer på, er, at de trækker luft fra rummet og selve skabet gennem front- og baggrillene. Luften går mod bagsiden af kabinettet og op til toppen. Der går forurenet luft gennem bunken af filtre, og en del af den filtrerede rene luft bliver skubbet ned på arbejdsområdet i skabet.Hvis kabinettet er stort nok til at rumme serologiske pipetter, kan de placeres indeni, ellers kan de opbevares i en beholder monteret på ydersiden af kabinettet. Det er god praksis at kontrollere begge sider af den indkapslede pipette for huller, revner eller punkteringer i emballagen før brug. Riv ikke indpakningen af.Skræl i stedet forsigtigt enderne af indpakningen. Indsæt den serologiske pipette i et pipettehjælpemiddel, og fjern indpakningen i én væskebevægelse. Hold ikke markøren over åbne flasker eller kolber.Det anbefales ikke at række ud over en åben flaske eller kolbe eller arbejde over åbne kolber. Luftstrømmen inde i skabene skubber ned på noget indeni. At nå over vil gøre det muligt for dit ærme eller handske at være oven på genstande, der potentielt kan skubbe enhver forurening, der findes på dit ærme, for eksempel ned i din cellekultur.Når det er muligt, må du ikke hælde væsker. Tilføj dem i stedet ved hjælp af en serologisk pipette. Bland indholdet grundigt og initialiser flasken.Skriv ned, hvad medierne suppleres med. Hvis du arbejder med vedhængende kulturer og har brug for en plastikkolbe, skal du sprøjte hele pakken og få den ind. Hver gang dine handsker er tørret op, skal du sprøjte dem med ethanol igen.Når du arbejder med en klæbende cellelinje, skal du bruge autoklaverede glaspipetter eller sterile engangsplastpipetter til at aspirere medier eller vaskeopløsninger. Fjern forsigtigt metalhætten fra opbevaringsbeholderen. Isoler en glaspipette ved forsigtigt at ryste beholderen skråt.Når du når ind i beholderen, skal du undgå at røre ved andre pipetter. Håndter kun den valgte pipette fra den ene ende. Sæt hurtigt hætter på flasker og kolber på igen så hurtigt som muligt.Placer hætter på arbejdsfladen på hovedet, så fælgen ikke berører arbejdsfladen. Tag ikke fat i hætten fra toppen eller bunden. Rør i stedet hætter fra siderne.Når du aspirerer væsker, skal du bruge en vakuumfældekolbe placeret uden for skabet i en sekundær beholder på gulvet. Affald vil blive skabt, mens du arbejder inde i kabinettet. Fordi flytning af hænder ind og ud af kabinettet for ofte vil afbryde luftstrømmen, er det fint midlertidigt at efterlade affald inde i kabinettet.Placer den ud til siden, så den ikke afbryder dit arbejde. Sprøjt generøst handsker med 70% ethanol, når de bliver tørre. Gnid dine hænder sammen, så de ikke drypper våde.En hurtig bemærkning om serologiske pipetter. Hvis de ved et uheld rører ved noget andet i emhætten, tøv ikke med at smide dem ud. Det er bedst at starte på en frisk med en ren serologisk pipette i stedet for at bruge en, der kan være forurenet.Før du placerer celler i inkubatoren, skal du kontrollere, hvordan de ser ud under mikroskopet. Enkeltceller skal overholdes. Dette indikerer, at cellerne er blevet resuspenderet grundigt.Tal ikke, nyser, hoster eller trækker vejret tungt ind i inkubatorerne. Åbn og luk hurtigt inkubatordøre. Hvis du lader dem stå åbne i længere tid end nødvendigt, kan forurenende stoffer, der er til stede i luften, komme ind i inkubatorerne.Sørg for, at hætterne på alle flasker er lukket grundigt, før du tager dem ud af skabet. Medier er lysfølsomme. Det skal opbevares i mørke ved fire grader Celsius, når det ikke er i brug.Sprøjt det indre af kabinettet med 70% ethanol igen, når cellekulturarbejdet er afsluttet, og tør overfladen tør med et køkkenrulle. Tøm posen med biofarligt affald. Gentag denne proces, og udskift handsker, når du skifter til en anden cellelinje.Når du arbejder med ophængningskulturer dyrket i glaskolber, skal du sikre dig, at handskerne er våde. Rør ved aluminiumsfolien med dine våde handsker, og sprøjt derefter kun bunden af kolben, før du placerer den inde i det biologiske sikkerhedsskab. Når du tager en prøve til celletælling, skal du kun fjerne et 1,5 ml rør fra beholderen.Rør ikke ved nogen af de andre rør. Placer hætten på hovedet på arbejdsfladen. Rør ikke ved den indvendige kant.Håndter det forsigtigt fra siderne, og udskift det, når du er færdig. Når du håndterer ophængningsceller og glaskolber, skal du forsigtigt fjerne det dobbeltfoldede stykke aluminiumsfolie, der dækker hele kolbens hals. Træk forsigtigt i alle fire hjørner, og læg folien på hovedet på arbejdsfladen.Kolben må kun håndteres nedenfra. Rør ikke ved den fra halsen, når folien er af. Brug en 1 ml serologisk pipette til at udtage en prøve til celletælling.Lad ikke medier dryppe ned ad kolbernes side. Hvis det gør det, skal du sprøjte køkkenrulle med 70% ethanol og rengøre det med det samme. Sørg for, at hætterne eller aluminiumsfolien strammes, før du fjerner flasker eller kolber fra de biologiske sikkerhedsskabe.Brug separate inkubatorer til forskellige celletyper. Dette forhindrer krydskontaminering af forskellige celletyper. Det anbefales at placere vakuumfældekolben til opsamling af flydende affald uden for skabet på gulvet i en sekundær beholder mærket affald.Slangen er forbundet til et filter, som udskiftes månedligt. Slangen går ind gennem siden af kabinettet. Fjern biohazard affaldet, når arbejdet er afsluttet.Opbevar en glasvaskeprotokol på væggen ved vasken. Først blødlægges de kasserede celler med 10% blegemiddel i ca. fem minutter. Kassér derefter blegemiddelblandingen, og kolben skylles grundigt med vand.Tilsæt sæbe med vand, skrub det meget godt med en børste, skyl med mere vand. Og så er det sidste trin at skylle glasvarerne med DI-vandet på hanen til højre. Vask glaskolber så hurtigt som muligt, skrub glasvarerne godt.Sf9-celler vil efterlade denne kant af døde celler, hvis den ikke skrubbes ordentligt. Brug kun disse kolber til cellekultur, autoklave cellekultur glasvarer i stedet for at sende det til et glasvaskeanlæg. Brug vakuumcyklussen på autoklaven i 40 minutter steriliseret tid og 40 minutters tørretid.Hold det adskilt fra glasvarer i laboratoriets hovedområde. Organiser cellekulturrummet, så alle forsyninger er placeret i et område, hvorved behovet for laboratoriemedlemmer minimeres for at forlade cellekulturrummet på jagt efter forsyninger. Mærk eventuelle plastflasker, der bruges til at høste celler og genbruges i cellekultur bagefter, kun til cellekulturbrug.Brug de udpegede cellekulturflasker til en bestemt celletype. Opbevar disse flasker i cellekulturrummet for nem adgang. For kulturer, der dyrkes i suspension, vil skimmelsvamp blive anerkendt som flydende bolde i medierne.Hvad angår bakteriel forurening, vil det gøre medierne hvide og overskyede. På samme måde kan skimmelforurening for klæbende celler let genkendes som fuzzy patches. Bakteriel forurening bliver normalt klare medier, hvide og uklare.Mange arter af mycoplasma kan identificeres pålideligt ved hjælp af et PCR-baseret assay. Båndet til venstre viser molekylvægtstandarderne for DNA. De fire bånd til højre er positive kontroller.Ingen bånd vises under testede celletyper, fordi mycoplasma ikke blev detekteret. Cellekulturmedier skifter farve fra rød til gul, hvis pH-indikatorer er til stede. Den gule farve angiver, at pH-værdien er lav, og mediet skal udskiftes.Hvis andre vækster eller celleformer observeres under lysmikroskopet, mens der udføres celletællinger, kan dette være en indikator for forurening. Bemærk, at en grundig rensning af hæmocytometeret skal udføres før celletælling, da denne type affald muligvis kun er til stede på hæmocytometeret og ikke i selve cellekulturen. Mens kontaminering er en af de primære bekymringer, når man udfører cellekulturarbejde, kan disse risici mindskes ved at følge de fremgangsmåder og teknikker, der er beskrevet i denne video.Hvis der udføres en månedlig mycoplasma-test hver måned, uddannes laboratoriepersonale årligt, og denne praksis overholdes nøje, forbliver dine celler sunde og forureningsfrie. Dette vil også hjælpe med at reducere omkostningerne forbundet med køb af dyre cellekulturmedier, køb af nye celler, og det vil reducere nedetid for inkubatordekontaminering. Husk, at nøglen til vellykket cellekultur er tidlig handling for at forhindre forurening i første omgang.

Research

JoVE Journal

Biology

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Title Cell Encapsulation by Droplets

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering og dyrkning af individuelle myofibre og deres satellit celler fra voksne skeletmuskler

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Slice Kultur Metode til følgende udvikling i Tand Bakterier In Eksplantat Kultur

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolation, Kultur og transplantation af Muskel satellit celler

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Påvisning af RNA-bindende proteiner ved<em&gt; In vitro</em&gt; RNA Pull-down i fedtcellerne Kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...