Name: cell culture techniques and practices to avoid contamination by fungi and bacteria in the research cell culture laboratory
Uploaded: 2023-07-07T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory at JoVE.com

Dit werk is mogelijk gemaakt dankzij financiering van het Howard Hughes Medical Institute (HHMI). We willen ons hoofd van het lab, Jue Chen, bedanken voor het lezen van het manuscript en voor haar voortdurende steun, Donna Tallent voor haar behulpzame bewerkingen en opmerkingen, en Jeff Hennefeld van de afdeling Informatietechnologie aan de Rockefeller University voor zijn hulp bij de videocomponent van dit manuscript.

1. Voorbereidingen 
<ol><li>Algemeen<ol><li>Draag een schone laboratoriumjas die alleen in de celkweekruimte en niet in andere delen van het laboratorium mag worden gedragen. OPMERKING: De laboratoriumjas hoeft niet steriel te zijn.</li>
		<li>Draag nieuwe handschoenen die geen andere oppervlakken hebben aangeraakt. Zorg ervoor dat de handschoenen goed aansluiten. Nitril, poedervrije handschoenen zijn het beste. OPMERKING: De handschoenen hoeven niet steriel te zijn.</li>
		<li>Om u voor te berei...

<ol>
	<li>Johnson, Z. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+substrate+recognition+by+the+multidrug+resistance+protein+MRP1.">Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1.</a> Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).</li><li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+as+biological+models:+practical+steps+for+more+reliable+research.">Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research.</a> Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).</li><li>Segeritz, C. P., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+growing+cells+as+model+systems+in+vitro.">Cell culture: growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li><li>Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+contamination:+sources,+consequences,+prevention,+and+elimination.">Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination.</a> Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).</li><li>Nikfarjam, L., Farzaneh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+detection+of+mycoplasma+contamination+in+cell+culture.">Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture.</a> Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).</li><li>Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+contamination.">Cell culture contamination.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).</li><li>Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mycoplasma+in+cell+cultures.">Detection of Mycoplasma in cell cultures.</a> Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).</li><li>Barth, O. M., Majerowicz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+by+transmission+electron+microscopy+of+mycoplasma+contamination+in+sera+and+cell+cultures.">Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).</li><li>Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+are+useful+model+systems+for+medical+research.">Cancer cell lines are useful model systems for medical research.</a> Cancers. 11 (8), 1098 (2019).</li><li>A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science Available from: <a target="_blank" href="https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you">https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you</a> (2020)</li><li>Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+contamination:+an+overview.">Cell culture contamination: an overview.</a> Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).</li><li>Babic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-research:+Incidences+of+problematic+cell+lines+are+lower+in+papers+that+use+RRIDs+to+identify+cell+lines.">Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines.</a> eLife. 8, e41676 (2019).</li><li>Visconti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+tandem+repeat+profiling+for+the+authentication+of+cancer+stem-like+cells.">Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells.</a> International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).</li><li>Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ghosts+of+HeLa:+How+cell+line+misidentification+contaminates+the+scientific+literature.">The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature.</a> PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).</li><li>Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal Available from: <a target="_blank" href="https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference">https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference</a> (2023)</li><li>United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications Available from: <a target="_blank" href="https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf">https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf</a> (2004)</li><li>Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html">https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html</a> (2023)</li><li>Cot&#233;, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+technique+for+cell+culture.">Aseptic technique for cell culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Uphoff, C. C., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+Mycoplasma+contamination+from+cell+cultures.">Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).</li><li>Bykowski, T., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+technique.">Aseptic technique.</a> Current Protocols in Microbiology. 56 (1), e98 (2020).</li><li>How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire Available from: <a target="_blank" href="https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article">https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article</a> (2020)</li><li>Phelan, K., May, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+tissue+culture+techniques.">Mammalian cell tissue culture techniques.</a> Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).</li></ol>

Hoewel besmetting een van de belangrijkste zorgen is bij het uitvoeren van celkweekwerk, zullen de praktijken en technieken die in dit manuscript worden beschreven, helpen de risico's te beperken. De kritieke stappen omvatten het dragen van een schone laboratoriumjas, die alleen wordt gebruikt in de celkweekruimte, met behulp van schone, poedervrije handschoenen die vaak met 70% EtOH worden besproeid en die worden vervangen bij het schakelen tussen cellijnen, het aanmoedigen van elk individu om geen mediaflessen te delen...

Celkweek heeft vele toepassingen in het onderzoekslaboratorium. Sinds de oorsprong van celcultuur in het begin van de 20e eeuw hebben cellijnen de wetenschap vooruit geholpen. Cellijnen hebben verschillende voordelen; Verschillende cellijnen kunnen onderzoekers helpen celbiologie te bestuderen, baculovirus te produceren voor verdere studies of grote hoeveelheden van een interessant eiwit te produceren, om er maar een paarte noemen 1. Enkele aanvullende toepassingen zijn het bestuderen van weefselgroei, het helpen bevorderen van vaccinontwikkeling, toxicologisch onderzoek, het bestuderen van de rol van genen in gezonde organismen en zieke modellen, en de productie van hybride cellijnen 2,3. Cellijnen kunnen ook de productie van geneesmiddelen mogelijk maken3. Goede aseptische technieken zijn noodzakelijk bij het werken met cellijnen; De praktijken en technieken die in dit manuscript worden beschreven, zijn van toepassing op onderzoekslaboratoria waar celkweekwerk wordt uitgevoerd. Andere laboratoriumomgevingen worden niet besproken.
Contaminatie is vaak de primaire zorg bij het uitvoeren van celkweekwerk. In de context van dit artikel verwijst besmetting over het algemeen naar schimmels en bacteriën. Het algemene doel van de methode die in dit artikel wordt beschreven, is om de beste praktijken voor het voorkomen van besmetting grondig te beschrijven. Alle laboratoriumleden moeten zich aan deze praktijken houden wanneer ze in de celkweekruimte van een onderzoekslaboratorium werken. Laboratoria moeten ervoor zorgen dat alle werknemers actief deelnemen aan het gebruik van deze beste praktijken om besmetting te voorkomen. De kennis van de juiste praktijken en technieken zal helpen ervoor te zorgen dat celculturen levensvatbaar, gezond en vrij van besmetting blijven. De ontwikkeling van deze techniek is gebaseerd op literatuuronderzoek, zeven jaar ervaring met celculturen en de behoefte aan een methode waar zowel beginners als ervaren celkweekwerkers jaarlijks naar kunnen verwijzen.
Er is behoefte aan een duidelijke, gestandaardiseerde techniek die alle onderzoekscelkweeklaboratoria moeten volgen. Veel van de literatuur over celkweekbesmetting bespreekt de detectie van mycoplasma, aseptische technieken, bronnen van besmetting, eliminatie van verontreinigingen en preventie door het gebruik van antibiotica en regelmatige tests 4,5,6,7,8. Hoewel deze informatie nuttig is, zijn er geen video's aanwezig in de literatuur die de juiste celkweektechnieken demonstreren die men moet volgen. Het voordeel van de gepresenteerde praktijken ten opzichte van alternatieve technieken is een focus op het voorkomen van besmetting voordat het gebeurt, in plaats van het later detecteren en corrigeren van fouten. Bovendien zijn een grondige demonstratie van aseptische technieken, een discussie over het voorkomen van schimmels en bacteriegroei en informatie over de luchtstroom van bioveiligheidskasten waardevol voor zowel beginnende als ervaren celkweekwerkers.
Bacteriën en schimmels zijn de twee meest voorkomende soorten verontreinigingen. Binnen de categorie bacteriën is mycoplasma een grote zorg vanwege zijn kleine omvang en het vermogen om zich te vermenigvuldigen terwijl het onopgemerkt blijft. Het zijn zelfreplicerende organismen zonder stijve celwand die afhankelijk zijn van eukaryote cellen om te groeien. Ze hebben verminderde metabolische mogelijkheden en kunnen zich sterk vermenigvuldigen terwijl ze niet worden herkend in de routinematige visuele inspectie van celculturen en regelmatige microscopische analyse, hoewel transmissie-elektronenmicroscopie mycoplasma 9,10 kan detecteren. Bovendien kunnen ze door microbiologische filtersgaan 10. Celkweekmedium voorziet mycoplasma van voedingsstoffen, hoewel het aanvullen van media met antibiotica helaas geen invloed heeft op mycoplasma10. Men moet opmerken dat het in het algemeen niet nodig is om media aan te vullen met antibiotica; Goede technieken moeten volstaan om besmetting op afstand te houden. Infectie met mycoplasma leidt niet tot onmiddellijke celdood, maar het is zorgwekkend voor onderzoekers omdat het de reproduceerbaarheid en kwaliteit van gegevens beïnvloedt.
Al het laboratoriumpersoneel moet zich strikt houden aan goede celkweekpraktijken. Culturen moeten worden getest op mycoplasma nadat ze nieuw zijn gekocht, terwijl ze momenteel worden gekweekt, vóór cryopreservatie en wanneer ontdooid uit vloeibare stikstof 2,10. Er zijn verschillende tests op de markt beschikbaar met behulp van polymerasekettingreactie (PCR), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of immunostaining. 3 De literatuur geeft aan dat "menselijke isolaten een groot percentage van de mycoplasmaverontreinigingen vertegenwoordigen die in celculturen worden aangetroffen"5. Hoewel meer dan 200 mycoplasma-soorten zijn beschreven, zijn ongeveer zes hiervan verantwoordelijk voor de meeste infecties. Deze zes soorten zijn M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale en Acholeplasma laidlawii10. Net als bij andere soorten verontreiniging brengen lucht en aerosolen deze in celculturen5. Dit wordt herhaald in andere artikelen, aangezien de "menselijke operator potentieel het grootste gevaar in het laboratorium is"7. Hoewel dit gebeurt door menselijke fouten, kan het risico worden geëlimineerd als een standaardprocedure wordt gevolgd. Het afstoten van personeel is niet beperkt tot alleen mycoplasmabesmetting; Celculturen in het ene laboratorium zijn meestal geïnfecteerd met dezelfde mycoplasma-soort, wat aangeeft dat besmetting zich van de ene kolf naar de andere verspreidt als gevolg van onjuiste celkweektechnieken10.
Het voorkomen van kruisbesmetting is ook een andere reden waarom de juiste celkweektechnieken moeten worden gevolgd. Opgemerkt wordt dat ten minste 15% -18% van de cellijnen wereldwijd kruisbesmet of verkeerd geïdentificeerd kan zijn11,12. Naast het testen van cellijnen op mycoplasmabesmetting, moeten ze ook worden getest op kruisbesmetting10. Voor menselijke cellijnen is cellijnauthenticatie door een goedkope DNA-gebaseerde techniek genaamd short tandem repeat (STR) -profilering de huidige internationale referentiestandaard, omdat het een eenvoudige manier is om cellijnidentiteit 2,10,13,14 te bevestigen. STR kan verkeerd gelabelde of kruisbesmette cellijnen identificeren, maar het kan geen onjuiste weefseloorsprong detecteren10,13,14. De validiteit van onderzoeksgegevens kan in het gedrang komen als cellijnen verkeerd zijn gelabeld, verkeerd zijn geïdentificeerd of besmet13. Net als bij andere soorten verontreiniging kan kruisbesmetting optreden als gevolg van een slechte techniek waardoor aerosolen zich verspreiden, verkeerd contact waardoor het verkeerde celtype een kolf binnendringt, of het gebruik van dezelfde mediafles en reagentia met verschillende cellijnen10. Er mag geen mediaflessen worden gedeeld; Door één fles media tussen twee verschillende cellijnen te delen, kunnen die celpopulaties worden gemengd, waardoor het sneller groeiende celtype de kolf volledig overneemt. Deze vervanging is niet merkbaar en leidt tot verkeerde etikettering en verkeerde identificatie2. Een cellijn kan ook voor een andere worden aangezien als culturen worden verward tijdens het hanteren of labelen10. Er moet zorgvuldig aandacht worden besteed aan het gescheiden houden van reagentia, media en kolven. Elk lablid moet zijn eigen mediaflessen hebben; Er mag geen uitwisseling plaatsvinden tussen lableden. Cellijnen zelf moeten worden gekocht bij een gekwalificeerde celbank en provider. Laboratoria mogen geen cellen delen. Studies tonen aan dat, hoewel STR- en mycoplasmatests regelmatig worden gebruikt, veel onderzoeksartikelen in de literatuur al verkeerd geïdentificeerde of besmette cellijnen hebben gebruikt15. Het doorzoeken van het onderzoek om deze problematische artikelen te vinden en lezers met terugwerkende kracht over deze kwestie te informeren, is omslachtig. Preventie is de beste manier om ervoor te zorgen dat dit probleem zich in de eerste plaats niet voordoet.
De eenvoudige werking van het spuiten van items met 70% EtOH kan organismen doden; 70% EtOH werkt door eiwitten te denatureren en lipiden op te lossen in de meest vervuilende organismen, waaronder bacteriën en schimmels16. Studies hebben aangetoond dat 70% de meest effectieve concentratie is; oppervlakte-eiwitten stollen niet snel met 70% EtOH zodat ze de cel kunnen binnendringen, terwijl het water dat het bevat nodig is voor het denatureringsproces van eiwitten. Door het concentratieverschil van water en alcohol aan weerszijden van de celwand komt 70% EtOH de cel binnen om zowel enzymatische als structurele eiwitten te denatureren. Als schimmelgroei in kolven wordt waargenomen, moet de hele broedmachine worden ontsmet door deze eerst met 70% EtOH te besproeien en droog te vegen, gevolgd door een incubatie van 16 uur 's nachts bij 60 °C17. Dit doodt de meeste schimmels en eventuele bacteriën.
Het belangrijkste voordeel van preventiepraktijken ten opzichte van alternatieve technieken om besmetting te elimineren nadat deze zich heeft voorgedaan, is dat door besmetting vroegtijdig te voorkomen, laboratoriummedewerkers er zeker van kunnen zijn dat hun celculturen gezond zijn en dat er geen hoge kosten verbonden zijn aan de decontaminatie van incubators of het weggooien van celculturen. De eliminatie van mycoplasmaverontreinigingen daarna is bijvoorbeeld niet efficiënt7. Door in een vroeg stadium de tijd te nemen om ervoor te zorgen dat laboratoriumpersoneel goed is opgeleid, de celkweekruimte op zichzelf staat en een standaardprocedure wordt gebruikt, bespaart u tijd en geld.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14-190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F-12 Media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Baffled Flask</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td>09-552-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>13-681-15A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-202-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Items may vary because this video is about general cell culture techniques</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture techniques and practices to avoid contamination by fungi and bacteria in the research cell culture laboratory

Celkweek is een delicate vaardigheid die nodig is voor het kweken van menselijke, dierlijke en insectencellen, of andere weefsels, in een gecontroleerde omgeving. Het doel van het protocol is om de nadruk te leggen op de juiste technieken die in een onderzoekslaboratorium worden gebruikt om besmetting door schimmels en bacteriën te voorkomen. Speciale nadruk wordt gelegd op het vermijden van mycoplasmabesmetting, een groot probleem in de celkweekruimte vanwege de kleine omvang en resistentie tegen de meeste antibiotica die worden gebruikt voor celkweek. Deze zelfde technieken zorgen voor continue groei en behoud van gezonde cellen. Voor zowel nieuwe als ervaren gebruikers van celculturen is het belangrijk om zich consequent aan deze best practices te houden om het risico op besmetting te beperken. Eens per jaar moeten laboratoria de beste praktijken voor celkweek evalueren en indien nodig een discussie of aanvullende training volgen. Het nemen van vroege actie om besmetting in de eerste plaats te voorkomen, bespaart tijd en geld, in vergelijking met opruimen nadat besmetting is opgetreden. Universele best practices houden celculturen gezond, waardoor de noodzaak om voortdurend nieuwe cellen te ontdooien, dure celkweekmedia aan te schaffen en de hoeveelheid decontaminatie en downtime van de incubator wordt verminderd.

Als de juiste celkweektechnieken en -praktijken die in dit artikel worden beschreven niet worden gevolgd, kan besmetting door schimmels en bacteriën optreden in het laboratorium voor onderzoekscelkweek. Figuur 2 toont kolven met verontreiniging in zowel de suspensie- als de aanhangende cultuur.
Wanneer u geen aseptische technieken volgt, kan schimmelverontreiniging 2-3 dagen later optreden. Ronde wazige ballen die in de media zweven, zijn merkbaar in suspensiecel...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory at JoVE.com

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

Dit protocol presenteert essentiële celkweektechnieken en -praktijken die in het laboratorium voor onderzoekscelkweek moeten worden gebruikt om besmetting door schimmels en bacteriën te voorkomen. Binnen de categorie bacteriën zal speciale nadruk worden gelegd op het voorkomen van mycoplasmabesmetting.

Celkweektechnieken en -praktijken om besmetting door schimmels en bacteriën in het laboratorium voor onderzoekscelkweek te voorkomen

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...

Celkweek is een delicate vaardigheid die nodig is voor het kweken van verschillende soorten cellen en weefsels in een gecontroleerde laboratoriumomgeving. De primaire zorg bij het uitvoeren van celkweekwerk is besmetting. Deze besmetting kan komen in de vorm van bacteriën, schimmels of mycoplasma.De technieken en praktijken die allemaal in deze video worden beschreven, zorgen ervoor dat uw cellen levensvatbaar, gezond en besmettingsvrij blijven. Deze praktijken moeten strikt worden nageleefd en al het laboratoriumpersoneel moet minstens één keer per jaar een training krijgen. Draag voordat u aan het werk gaat een schone laboratoriumjas die alleen is bedoeld voor gebruik in de celkweekruimte.Draag nieuwe handschoenen die geen andere oppervlakken hebben aangeraakt. Zorg ervoor dat de handschoenen goed aansluiten. Nitril poedervrije handschoenen zijn het beste.De labjas en handschoenen hoeven niet steriel te zijn. Om je voor te bereiden op het werk, spuit je handschoenen, laboratoriumjasmouwen en de binnenkant van de biologische veiligheidskast met 70% ethanol. Spuit het werkoppervlak, de zijkanten, de achterkant, eventuele items in de kast en het voorste glaspaneel, zowel van binnen als van buiten.Veeg het werkoppervlak en het glazen paneel droog met een pluisvrije papieren handdoek. Neem de tijd om de werkruimte in de kast in te delen. Houd waterbaden in de celkweekruimte en gebruik deze alleen voor celkweekdoeleinden, zoals het verwarmen van media of het ontdooien van cellen.De waterbaden moeten eenmaal per week worden afgetapt en gewassen. Beperk de hoeveelheid items die in de kast worden gebracht en onderbreek de luchtstroom in de biologische veiligheidskast niet door de voorste of achterste roosters te blokkeren. Spuit alle items die in de kast zijn geplaatst met 70% ethanol en veeg ze droog.Begin met het spuiten van de bovenkant van de mediafles en werk je een weg naar beneden. Begin met een schone papieren handdoek vanaf de bovenkant van de mediafles om deze droog te vegen en werk je geleidelijk een weg naar de bodem. Ga niet terug naar boven richting de dop.De manier waarop deze kasten werken, is dat ze lucht uit de kamer en de kast zelf trekken via de voor- en achterroosters. De lucht gaat naar de achterkant van de kast en naar boven. Daar gaat vervuilde lucht door een hoop filters en wordt een deel van de gefilterde schone lucht naar beneden geduwd op het werkgebied in de kast.Als de kast groot genoeg is om serologische pipetten te huisvesten, kunnen ze binnen worden geplaatst, anders kunnen ze worden opgeslagen in een recipiënt dat aan de buitenkant van de kast is gemonteerd. Het is een goede gewoonte om voor gebruik beide zijden van de ingekapselde pipet te controleren op gaten, scheuren of lekke banden in de verpakking. Scheur de verpakking niet af.Schil in plaats daarvan voorzichtig de uiteinden van de verpakking. Steek de serologische pipet in een pipethulpmiddel en verwijder de wikkeling in één vloeiende beweging. Beweeg niet over open flessen of flacons.Het is niet aan te raden om over een open fles of kolf te reiken of boven open kolven te werken. De luchtstroom in de kasten drukt op alles binnenin. Als je naar boven reikt, kan je mouw of handschoen bovenop items komen te zitten die mogelijk eventuele verontreiniging op je mouw kunnen duwen, bijvoorbeeld in je celcultuur.Giet waar mogelijk geen vloeistoffen. Voeg ze in plaats daarvan toe met een serologische pipet. Meng de inhoud grondig en initialiseer de fles.Schrijf op waar de media mee worden aangevuld. Als je met aanhangende culturen werkt en een plastic fles nodig hebt, spuit dan de hele verpakking en haal het erin. Wanneer je handschoenen zijn opgedroogd, spuit je ze opnieuw in met de ethanol.Wanneer u met een aanhangende cellijn werkt, gebruikt u geautoclaveerde glazen pipetten of steriele plastic wegwerppipetten om media of wasoplossingen op te zuigen. Verwijder voorzichtig de metalen dop uit de opslagcontainer. Isoleer één glazen pipet door de container voorzichtig schud onder een hoek.Wanneer u in de container reikt, mag u geen andere pipetten aanraken. Behandel de gekozen pipet slechts aan één uiteinde. Vervang doppen op flessen en flacons zo snel mogelijk.Plaats doppen ondersteboven op het werkoppervlak, zodat de velg het werkoppervlak niet raakt. Pak de dop niet van de boven- of onderkant. Raak in plaats daarvan doppen aan vanaf de zijkanten.Gebruik bij het aanzuigen van vloeistoffen een vacuümvangerkolf buiten de kast in een secundaire container op de vloer. Afval ontstaat tijdens het werken in de kast. Omdat het te vaak in en uit de kast bewegen van de handen de luchtstroom onderbreekt, is het prima om afval tijdelijk in de kast te laten.Plaats het aan de zijkant, zodat het uw werk niet onderbreekt. Spuit handschoenen royaal met 70% ethanol wanneer ze droog worden. Wrijf je handen tegen elkaar zodat ze niet nat druipen.Een korte opmerking over serologische pipetten. Als ze per ongeluk iets anders in de motorkap raken, aarzel dan niet om ze weg te gooien. Het is het beste om opnieuw te beginnen met een schone serologische pipet in plaats van er een te gebruiken die mogelijk besmet is.Voordat u cellen in de couveuse plaatst, controleert u hoe ze er onder de microscoop uitzien. Enkele cellen moeten worden waargenomen. Dit geeft aan dat de cellen grondig zijn geresuspendeerd.Spreek, nies, hoest of adem niet zwaar in de couveuses. Snel incubatordeuren openen en sluiten. Als u ze langer dan nodig open laat, kunnen verontreinigingen in de lucht de broedmachines binnendringen.Zorg ervoor dat de doppen van alle flessen goed gesloten zijn voordat u ze uit de kast haalt. Media is lichtgevoelig. Het moet in het donker worden bewaard bij vier graden Celsius wanneer het niet in gebruik is.Spuit de binnenkant van de kast opnieuw met 70% ethanol nadat het celkweekwerk is voltooid en veeg het oppervlak droog met een papieren handdoek. Leeg de biohazard afvalzak. Herhaal dit proces en vervang handschoenen bij het overschakelen naar een andere cellijn.Wanneer u werkt met suspensieculturen die in glazen kolven zijn gekweekt, moet u ervoor zorgen dat handschoenen nat zijn. Raak de aluminiumfolie aan met uw natte handschoenen en spuit vervolgens alleen de bodem van de kolf voordat u deze in de biologische veiligheidskast plaatst. Wanneer u een monster neemt voor het tellen van cellen, verwijdert u slechts één buis van 1,5 ml uit de container.Raak geen van de andere buizen aan. Plaats de dop ondersteboven op het werkoppervlak. Raak de binnenrand niet aan.Behandel het met zorg vanaf de zijkanten en vervang het zodra je klaar bent. Verwijder bij het hanteren van ophangcellen en glazen kolven voorzichtig het dubbelgevouwen stuk aluminiumfolie dat de hele hals van de kolf bedekt. Trek voorzichtig aan alle vier de hoeken en plaats de folie ondersteboven op het werkoppervlak.Behandel de glazen kolf alleen vanaf de bodem. Raak het niet aan vanuit de nek zodra de folie eraf is. Gebruik een serologische pipet van 1 ml om een monster te nemen voor het tellen van de cellen.Laat geen media langs de zijkant van kolven druppelen. Als dat het geval is, spuit dan keukenpapier met 70% ethanol en maak het meteen schoon. Zorg ervoor dat de doppen of aluminiumfolie zijn aangedraaid voordat u flessen of kolven uit de biologische veiligheidskasten verwijdert.Gebruik aparte incubators voor verschillende celtypen. Dit voorkomt kruisbesmetting van verschillende celtypen. Het wordt aanbevolen om de vacuümvangerkolf voor het verzamelen van vloeibaar afval buiten de kast op de vloer in een secundaire container met het label afval te plaatsen.De slang wordt aangesloten op een filter dat maandelijks wordt vervangen. De slang gaat via de zijkant van de kast naar binnen. Verwijder de biohazard-prullenbak zodra het werk is voltooid.Houd een glaswasprotocol op de muur bij de gootsteen. Week eerst de afgedankte cellen met 10% bleekmiddel gedurende ongeveer vijf minuten. Gooi vervolgens het bleekmiddelmengsel weg en spoel de kolf grondig af met water.Voeg zeep toe met water, schrob het met een borstel heel goed, spoel af met meer water. En dan is de laatste stap om het glaswerk af te spoelen met het DI-water op de kraan aan de rechterkant. Was glasflessen zo snel mogelijk, schrob het glaswerk goed.Sf9-cellen zullen deze rand van dode cellen verlaten als deze niet goed wordt geschrobd. Gebruik deze kolven alleen voor celkweek, autoclaafcelkweekglaswerk in plaats van het naar een glaswasgelegenheid te sturen. Gebruik de vacuümcyclus op de autoclaaf gedurende 40 minuten gesteriliseerde tijd en 40 minuten droogtijd.Houd het gescheiden van glaswerk in het hoofdgedeelte van het lab. Organiseer de celkweekruimte zo dat alle benodigdheden zich in één gebied bevinden, waardoor laboratoriumleden de celkweekruimte niet hoeven te verlaten op zoek naar benodigdheden. Etiketteer alle plastic flessen die worden gebruikt om cellen te oogsten en die daarna worden hergebruikt in celkweek, alleen voor celkweekgebruik.Gebruik de aangewezen celkweekflessen voor één specifiek celtype. Bewaar deze flessen in de celkweekruimte voor gemakkelijke toegang. Voor culturen die in suspensie worden gekweekt, wordt schimmel in de media herkend als zwevende ballen.Wat bacteriële besmetting betreft, zal het de media wit en troebel maken. Evenzo kan schimmelbesmetting voor aanhangende cellen gemakkelijk worden herkend als wazige vlekken. Bacteriële besmetting zal normaal heldere media maken, wit en troebel.Veel soorten mycoplasma kunnen betrouwbaar worden geïdentificeerd met behulp van een PCR-gebaseerde test. De band aan de linkerkant toont de moleculaire gewichtsnormen voor DNA. De vier banden aan de rechterkant zijn positieve controles.Er verschijnen geen banden onder geteste celtypen omdat mycoplasma niet werd gedetecteerd. Celkweekmedia veranderen van kleur van rood naar geel als pH-indicatoren aanwezig zijn. De gele kleur geeft aan dat de pH laag is en dat de media moeten worden vervangen.Als andere gezwellen of celvormen onder de lichtmicroscoop worden waargenomen tijdens het uitvoeren van celtellingen, kan dit een indicator zijn van besmetting. Merk op dat een grondige reiniging van de hemocytometer moet worden uitgevoerd voorafgaand aan het tellen van de cel, omdat dit type puin alleen op de hemocytometer aanwezig kan zijn en niet in de celcultuur zelf. Hoewel besmetting een van de belangrijkste zorgen is bij het uitvoeren van celkweekwerk, kunnen deze risico's worden beperkt door de praktijken en technieken te volgen die in deze video worden beschreven.Als er elke maand een maandelijkse mycoplasma-test wordt uitgevoerd, laboratoriumpersoneel jaarlijks wordt getraind en deze praktijken strikt worden nageleefd, blijven uw cellen gezond en besmettingsvrij. Dit zal ook helpen de kosten te verlagen die gepaard gaan met de aankoop van dure celkweekmedia, de aankoop van nieuwe cellen en het zal de uitvaltijd van de decontaminatie van de incubator verminderen. Vergeet niet dat de sleutel tot een succesvolle celkweek vroege actie is om besmetting in de eerste plaats te voorkomen.

Research

JoVE Journal

Biology

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Menselijke ES-cellen: Vanaf Cultuur van bevroren cellen

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titel Cell Encapsulation door Droplets

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Het bepalen van het aantal cellen tijdens de celdeling Cultuur met de Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Inductie en testen van Hypoxie in celkweek

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

De Slice kweekmethode voor Na Ontwikkeling van Tooth Germs In explantaatkweek

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolatie, Cultuur en Transplantatie van Muscle satelliet-cellen

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detectie van RNA-bindende eiwitten door<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Cultuur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...