Name: real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay
Uploaded: 2022-11-25T15:00:00
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这项工作得到了 上海市自然科学基金（批准号：21ZR1429300/BS1500016）、上海交通大学（Agri-X计划，批准号：AF1500088/002）、上海市农业种子协同创新中心（批准号：ZXWH2150201/001）对范江波的资助，以及上海交通大学医学工程合作项目（批准号：21X010301734）对李灿的资助。

注意：该方案适用于不同的植物组织。在该协议中，水稻鞘和叶盘用于PANP诱发时的ROS检测。由于差异主要由取样方法引起，因此下面仅介绍通用程序，并在必要时提及具体步骤。
1. 植物培养
<ol><li>用70%乙醇对去壳的水稻种子灭菌1分钟，然后用40%次氯酸钠（NaClO）灭菌1小时。然后，用无菌水冲洗种子5倍以去除余氯。</li>
	<li>将种子无菌地铺在 1/2 MS 培养基上（2.3...

<ol>
	<li>Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+as+signals+that+modulate+plant+stress+responses+and+programmed+cell+death.">Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.</a> Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).</li><li>Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+are+good.">ROS are good.</a> Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).</li><li>Gilroy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+calcium,+and+electric+signals:+key+mediators+of+rapid+systemic+signaling+in+plants.">ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).</li><li>Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+gene+network+of+plants.">Reactive oxygen gene network of plants.</a> Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).</li><li>Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+burst+of+plant+NADPH+oxidases.">A burst of plant NADPH oxidases.</a> Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).</li><li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses.">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).</li><li>Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+and+redox+signalling+in+the+response+of+plants+to+abiotic+stress.">ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 35 (2), 259-270 (2012).</li><li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+burst+oxidases:+the+engines+of+ROS+signaling.">Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).</li><li>Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+NADPH+oxidase+RBOHD+during+plant+immunity.">Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity.</a> Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).</li><li>Segonzac, C., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+plant+pattern-recognition+receptors+by+bacteria.">Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>Hong, D., Joung, H. -. A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attomolar+detection+of+cytokines+using+a+chemiluminescence+immunoassay+based+on+an+antibody-arrayed+CMOS+image+sensor.">Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).</li><li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+new+sensitive+chemiluminescence+probe,+L-012,+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells.">et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li><li>Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+regulation+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).</li></ol>

本研究的目的是建立一种高效的方法来量化水稻组织中PAMP响应的早期ROS产生。该方法为实时测定由处理过的大米组织产生的质外体ROS提供了一种标准化程序。该方法操作简单，成本低，成分清晰，独立于商业试剂盒。使用这种方法，研究人员可以研究植物受到生物或非生物胁迫时质外体ROS的实时产生。
在该协议中，L-012被选为化学发光试剂，因为它是一种无毒化学物质。鲁?...

活性氧 （ROS） 包括一系列化学活性氧衍生物，包括超氧阴离子自由基 （O2-） 及其衍生物、羟基自由基 （OH-）、过氧化氢以及单线态氧或氧化还原反应的产物，它们在质体和叶绿体、线粒体、过氧化物酶体和其他亚细胞位置中不断产生1.ROS在许多生物过程中起着重要作用，对所有植物都是必不可少的2，3，4。ROS功能的广泛范围从生长发育的调节到非生物和生物胁迫的感知5，6，7，8。
在植物免疫系统中，植物细胞质膜定位的受体 - 所谓的模式识别受体（PRR） - 感知病原体衍生的化学物质 - 病原体相关分子模式（PAMP）。这种识别触发了一系列快速免疫反应，包括钙内流、ROS 爆发和 MAPK 级联反应;因此，这一层免疫被称为PAMP触发免疫（PTI）。ROS突发是PTI响应的标志性特征，其测定被广泛用于PTI相关研究9，10。由 PAMP 触发的 ROS 产生归因于质膜驻留的 NADPH 氧化酶或呼吸爆发氧化酶同系物 （RBOH） 家族蛋白，其将电子从胞质 NADPH 或 NADH 转移到细胞外氧以产生超氧化物 （O 2-），超氧化物通过超氧化物歧化酶自发转化为过氧化氢 （H 2 O 2）8.PAMP触发的ROS突发非常迅速，在PAMP治疗后几分钟出现，并在~10-12分钟达到峰值。绝大多数ROS分子由过氧化氢（H2O2）组成，可以通过化学发光测定轻松稳定地检测。
在化学发光中，化学发光试剂在催化剂的作用下与活性氧反应，产生激发态中间体。然后，产物中的电子通过非辐射跃迁返回基态并发射光子。常见的化学发光试剂包括鲁米诺和L-012，其中鲁米诺在应用中占主导地位11，12，13。然而，越来越多的研究人员选择L-012来检测ROS的产生，因为与鲁米诺相比，L-012在中性或接近中性的pH条件下具有更高的发光效率。
本文介绍了一种基于L-012的优化化学发光方法，用于实时检测水稻（水稻）组织-叶盘和鞘中PAMPs的产生。本文提供的方法简单、稳定、标准化，适应性强，可满足不同的实验需求。使用这种方法获得的数据在严格控制的条件下具有高度可重复性。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>WHB</td>
			<td>WHB-96-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Innochem</td>
			<td>A43543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flg22</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>p20973</td>
			<td>PAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-012</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>120-04891</td>
			<td>8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Medium</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCLO</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>S101636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish (HRP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampler</td>
			<td>Miltex&#160;</td>
			<td>15110-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610195</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay

活性氧（ROS）在各种生物过程中起着至关重要的作用，包括非生物和生物胁迫的传感。在病原体感染或病原体相关化学物质（病原体相关分子模式[PAMP]）攻击时，一系列免疫反应（包括ROS爆发）在植物中迅速诱导，这称为PAMP触发免疫（PTI）。ROS爆发是一种标志性的PTI反应，由一组质膜定位的NADPH氧化酶 - RBOH家族蛋白催化。绝大多数ROS由过氧化氢（H2O2）组成，可以通过基于鲁米诺的化学发光方法轻松稳定地检测。化学发光是一种产生光子的反应，其中鲁米诺或其衍生物（如L-012）在催化剂的作用下与ROS进行氧化还原反应。本文介绍了一种优化的基于L-012的化学发光方法，用于在水稻组织中引发PAMP时实时检测质外体ROS的产生。该方法简单、稳定、标准化，在严格控制的条件下具有高度可重复性。

在这里，我们以大米材料为例来确定flg22处理产生的ROS。引出后ROS的产生是短暂的。在水稻中，ROS产量的增加首先在1-2分钟内检测到，在10-12分钟达到峰值，并在~30-35分钟内恢复到基线（图3）。对照试验中，诱发溶液中没有PAMP，导致没有明显的ROS诱导，与对照测试相比，只有当含有flg22或其他PAMP（如几丁质）的诱发溶液时，才会诱导特定的ROS爆发。同时，ROS的总量可以从曲?...

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Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

在这里，我们描述了一种实时检测病原体相关分子模式触发的免疫反应中水稻组织中质外活性氧（ROS）产生的方法。该方法简单、标准化，可在受控条件下产生高度可重复的结果。

用化学发光法实时检测水稻免疫反应中活性氧的产生

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

该协议描述了一种优化的基于L-012的化学发光方法，可在水稻组织中的PANP诱导时实时检测ROS的产生。该方法简单、标准化，在严格控制的条件下具有高度可重复性。演示这个程序的是我实验室的博士生On Ying。首先，用70%乙醇对去壳的水稻种子消毒一分钟，然后用40%次氯酸钠消毒一小时。用无菌水冲洗种子五次以去除余氯。在水稻鞘法中，用Murashige和Skoog或MS培养基直接将种子板在无菌玻璃容器中。要将种子接种在叶盘法中，将它们铺在MS平板上五到七天，然后将它们移植到生长基质或土壤中。在具有12小时光照，12小时黑暗照片期的生长室中种植幼苗。在ROS测定前一天，用锋利的剃须刀片或手术刀片将10日龄水稻幼苗的鞘切成三毫米段进行预处理。将五个鞘段放入含有 100 微升双蒸水的 96 孔微量滴定板的单个孔中 10 至 12 小时。使用带有柱塞的活检冲头从四到六周龄的水稻植株上切下叶盘。始终从主分蘖第二片叶子的中间三分之一处切下叶盘，以减少数据变化。接下来，将一个叶盘放入含有 100 微升双蒸水的 96 孔微量滴定板的单个孔中 10 至 12 小时以进行预处理。将所有叶盘漂浮并朝上放在微量滴定板的孔中进行水预处理，以避免叶侧相关变化。通过混合9.4毫升50微摩尔Tris Hcl，400微升L012溶液，100微升马萝卜过氧化物酶和100微升Flg22制备启发溶液。向孔中加入200微升启发溶液。启动软件并单击实验按钮以创建新协议或使用现有协议。单击弹出窗口中的程序以设置板并从要监测的板中选择孔。单击“启动动力学”并将运行时间设置为 30 分钟或更长时间，具体取决于实验要求。选择最小间隔以尽可能频繁地获取读数。对于积分时间，根据信号强度选择一秒或更长时间。单击验证，然后单击确定以确认设置，然后单击弹出窗口中的检测新板并等待软件提示加载板对话框。小心地从包含预处理组织的孔中取出双蒸水，避免任何组织损伤或干燥。使用多通道移液器将200微升的启发溶液添加到包含组织的孔中。将要测试的板放在载体上并开始检测。为了通过Flg22诱导ROS，使用了叶盘和三毫米长的鞘。ROS 生成监控 35 分钟。条形表示从五个技术重复计算的标准差的平均值。在水稻中，ROS产量的增加首先在1至2分钟内检测到，在10至12分钟达到峰值，并在约30至35分钟内恢复到基线。根据曲线计算ROS的总量。要获得ROS值的总量，请将公式应用于相应的数据集，以计算每个时间间隔产生的ROS，可以通过应用公式总和来组合，以计算生成的总量。将叶盘的单孔或两半放入用100微升双蒸水预处理的96孔微量滴定板的孔中10至12小时，然后用Flg22处理以进行ROS诱导。两个半盘样品的读数值远高于整个叶盘的读数值。平均而言，两个半盘样品的总值几乎是整个叶盘的1.6倍，这与边缘长度成正比，而不是与样品的面积成正比。这一结果支持ROS主要在伤口部位的细胞中产生。尝试此过程时，请轻柔地操作组织，不要进行额外的切口，这可能是数据变化的来源。该方法可应用于植物组织中任何其他产生ROS的生理过程。

Research

JoVE Journal

Biology

Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila

Proboscis Extension Response PER Assay in Drosophila

长鼻扩展响应（PER）的含量在果蝇

Proboscis extension response (PER) is a taste behavior assay that has been used in flies as well as in honeybees.
On the surface of the fly's mouth ...

科研

生物学

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

检测，可视化和定量活性氧的生成在变形虫模型系统

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Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

单工程的RNA转录物的活细胞实时成像采用比例式双分子信标

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

增强Northern印迹检测小RNA种类的<em&gt;果蝇</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

测量水润谷胱甘肽诱导饲养响应

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

一个定量聚合酶重组酶扩增法的发展与内部阳性对照

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

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qPCRTag分析 - 高通量，实时定量PCR检测方法的基因分型Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

通过可切换原卟啉IX依赖性原位活性氧物种光生成刺激小鼠皮肤中的干细胞壁龛和组织再生

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

使用活细胞中的构象FRET生物传感器实时监测极光激酶A活化

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...