Name: real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay
Uploaded: 2022-11-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Shanghai Natural Science Foundation (bevillingsnummer: 21ZR1429300 / BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (Agri-X-program, bevillingsnummer: AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (tilskudsnummer: ZXWH2150201 / 001) til Jiangbo Fan og af Medical-Engineering Collaboration Project of Shanghai Jiao Tong Univesity (bevillingsnummer: 21X010301734) til Can Li.

BEMÆRK: Protokollen gælder for forskellige plantevæv. Riskedese og bladskiver blev anvendt i denne protokol til ROS-detektion ved PAMP-udløsning. Da der hovedsagelig opstår forskelle på grund af prøveudtagningsmetoden, er det kun de fælles procedurer, der beskrives nedenfor, og specifikke trin nævnes, hvor det er nødvendigt.
1. Plantekultur
<ol><li>Steriliser de afskallede risfrø med 70% ethanol i 1 min, derefter med 40% natriumhypochlorit (NaClO) i 1 time. Skyl d...

<ol>
	<li>Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+as+signals+that+modulate+plant+stress+responses+and+programmed+cell+death.">Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.</a> Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).</li><li>Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+are+good.">ROS are good.</a> Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).</li><li>Gilroy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+calcium,+and+electric+signals:+key+mediators+of+rapid+systemic+signaling+in+plants.">ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).</li><li>Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+gene+network+of+plants.">Reactive oxygen gene network of plants.</a> Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).</li><li>Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+burst+of+plant+NADPH+oxidases.">A burst of plant NADPH oxidases.</a> Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).</li><li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses.">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).</li><li>Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+and+redox+signalling+in+the+response+of+plants+to+abiotic+stress.">ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 35 (2), 259-270 (2012).</li><li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+burst+oxidases:+the+engines+of+ROS+signaling.">Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).</li><li>Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+NADPH+oxidase+RBOHD+during+plant+immunity.">Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity.</a> Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).</li><li>Segonzac, C., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+plant+pattern-recognition+receptors+by+bacteria.">Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>Hong, D., Joung, H. -. A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attomolar+detection+of+cytokines+using+a+chemiluminescence+immunoassay+based+on+an+antibody-arrayed+CMOS+image+sensor.">Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).</li><li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+new+sensitive+chemiluminescence+probe,+L-012,+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells.">et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li><li>Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+regulation+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).</li></ol>

Formålet med denne undersøgelse var at etablere en yderst effektiv metode til at kvantificere tidlig ROS-produktion som reaktion på PAMP i risvæv. Denne metode giver en standardiseret procedure til realtidsbestemmelse af apoplast ROS fremstillet af behandlet risvæv. Denne metode er enkel i drift, lav i omkostninger, klar i sammensætning og uafhængig af kommercielle sæt. Ved hjælp af denne metode kan forskere studere realtidsproduktionen af apoplast ROS, når planter udsættes for biotiske eller abiotiske belastn...

Reaktive oxygenarter (ROS) omfatter en række kemisk aktive oxygenderivater, herunder superoxidanionradikaler (O2-) og dets derivater, hydroxylradikaler (OH-), hydrogenperoxid og produkter af singlet oxygen eller oxidationsreduktionsreaktioner, som konstant produceres i plastider og kloroplaster, mitokondrier, peroxisomer og andre subcellulære steder1 . ROS spiller vigtige roller i mange biologiske processer og er afgørende for alle planter 2,3,4. Det brede spektrum af ROS-funktioner varierer fra regulering af vækst og udvikling til opfattelsen af abiotiske og biotiske belastninger 5,6,7,8.
I plantens immunsystem opfatter plantecelleplasmamembranlokaliserede receptorer - såkaldte mønstergenkendelsesreceptorer (PRR'er) patogenafledte kemikalier-patogenassocierede molekylære mønstre (PAMP'er). Denne anerkendelse udløser en række hurtige immunresponser, herunder calciumtilstrømning, ROS-burst og MAPK-kaskade; således kaldes dette lag af immunitet PAMP-udløst immunitet (PTI). ROS-burst er et kendetegnende PTI-respons, hvis bestemmelse anvendes bredt til PTI-relaterede undersøgelser 9,10. ROS-produktion udløst af PAMP'er tilskrives plasmamembranresident NADPH-oxidase eller respiratorisk burstoxidasehomolog (RBOH) familieproteiner, som overfører elektroner fra cytosolisk NADPH eller NADH til ekstracellulært ilt for at producere superoxid (O2-), som spontant omdannes til hydrogenperoxid (H2O2) ved superoxiddismutase8 . PAMP-udløst ROS-udbrud er ret hurtigt, vises kun få minutter efter PAMP-behandling og topper ved ~ 10-12 minutter. Langt størstedelen af ROS-molekylerne omfatter hydrogenperoxid (H2O2), som let og støt kan detekteres med et kemiluminescensassay.
I kemiluminescens reagerer kemiluminescensreagenset med aktivt ilt under påvirkning af en katalysator for at producere de exciterede tilstandsmellemprodukter. Derefter vender elektronerne i produktet tilbage til jordtilstanden gennem ikke-strålingsovergang og udsender fotoner. Almindelige kemiluminescensreagensmidler inkluderer luminol og L-012, hvor luminol dominerer applikationen11,12,13. Imidlertid vælger flere forskere L-012 til at detektere ROS-produktion, da L-012 har en meget højere lysemissionseffektivitet under neutrale eller næsten neutrale pH-forhold sammenlignet med luminol.
Dette papir beskriver en optimeret kemiluminescensmetode, baseret på L-012, til realtidsdetektion af ROS-produktion efter udløsning af PAMP'er i risvæv-bladskiver og kappe (Oryza sativa). Metoden, der leveres her, er enkel, stabil og standardiseret og er meget tilpasningsdygtig til at imødekomme forskellige eksperimentelle behov. De data, der opnås med denne metode, er meget reproducerbare under fast kontrollerede forhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>WHB</td>
			<td>WHB-96-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Innochem</td>
			<td>A43543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flg22</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>p20973</td>
			<td>PAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-012</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>120-04891</td>
			<td>8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Medium</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCLO</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>S101636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish (HRP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampler</td>
			<td>Miltex&#160;</td>
			<td>15110-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610195</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay

Reaktive iltarter (ROS) spiller afgørende roller i en række biologiske processer, herunder sensing af abiotiske og biotiske belastninger. Ved patogeninfektion eller udfordring med patogenassocierede kemikalier (patogenassocierede molekylære mønstre [PAMP'er]) induceres en række immunresponser, herunder en ROS-burst, hurtigt i planter, der kaldes PAMP-udløst immunitet (PTI). Et ROS-udbrud er et kendetegnende PTI-respons, som katalyseres af en gruppe plasmamembranlokaliserede NADPH-oxidaser - RBOH-familiens proteiner. Langt størstedelen af ROS består af hydrogenperoxid (H2O2), som let og støt kan detekteres ved hjælp af en luminolbaseret kemiluminescensmetode. Kemiluminescens er en fotonproducerende reaktion, hvor luminol eller dets derivat (såsom L-012) gennemgår en redoxreaktion med ROS under virkningen af en katalysator. Dette papir beskriver en optimeret L-012-baseret kemiluminescensmetode til påvisning af apoplast ROS-produktion i realtid ved PAMP-udløsning i risvæv. Metoden er let, stabil, standardiseret og meget reproducerbar under stærkt kontrollerede forhold.

Her tager vi rismateriale som et eksempel for at bestemme ROS produceret med flg22-behandling. Genereringen af ROS efter udløsning er forbigående. I ris blev stigningen i ROS-produktionen først detekteret på 1-2 min, toppede ved 10-12 minutter og vendte tilbage til basislinjen i ~ 30-35 min (figur 3). Sammenlignet med kontroltesten, hvor PAMP var fraværende i udløsningsopløsningen, hvilket ikke resulterede i nogen åbenlys ROS-induktion, blev der kun induceret en specifik ROS-burst, n...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay at JoVE.com

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Her beskriver vi en metode til realtidspåvisning af apoplastiske reaktive iltarter (ROS) produktion i risvæv i patogenassocieret molekylært mønsterudløst immunrespons. Denne metode er enkel, standardiseret og genererer meget reproducerbare resultater under kontrollerede forhold.

Realtidspåvisning af produktion af reaktive iltarter i immunrespons i ris med et kemiluminescensassay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Denne protokol beskriver en optimeret L-012-baseret kemiluminescensmetode til at detektere ROS-produktion i realtid ved PAMP-udløsning i risvæv. Denne metode er let, standardiseret og meget reproducerbar under fast kontrollerede forhold. Demonstration af denne procedure vil være On Ying, en ph.d.-studerende fra mit laboratorium.Til at begynde med steriliseres de afskallede risfrø med 70% ethanol i et minut og derefter med 40% natriumhypochlorit i en time. Skyl frøene fem gange med sterilt vand for at fjerne resterende klor. I riskappemetoden plades frøene direkte i den sterile glasbeholder med Murashige og Skoog eller MS-medium.For at plade frøene i bladskivemetoden skal du plade dem på MS-plader i fem til syv dage og derefter transplantere dem til vækstmatrixen eller jorden. Vok frøplanterne i et vækstrum med en 12 timers lys, 12 timers mørk fotoperiode. Skær kappen fra 10 dage gamle risplanter i tre millimeter segmenter med et skarpt barberblad eller kirurgisk blad til forbehandling en dag før ROS-analysen.Placer fem kappesegmenter i en individuel brønd af en 96 brøndmikrotiterplade indeholdende 100 mikroliter dobbeltdestilleret vand i 10 til 12 timer. Skær bladskiverne fra fire til seks uger gamle risplanter ved hjælp af en biopsistans med et stempel. Skær altid bladskiverne fra den midterste tredjedel af det andet blad på hovedstyrestangen for at reducere datavariationen.Derefter anbringes en bladskive i en individuel brønd med en 96 brøndmikrotiterplade indeholdende 100 mikroliter dobbeltdestilleret vand i 10 til 12 timer til forbehandling. Hold alle bladskiverne flydende og opad i brøndene på en mikrotiterplade til vandforbehandling for at undgå variation i bladsiden. Forbered udløsningsopløsning ved at kombinere 9,4 ml 50 mikromolær Tris Hcl, 400 mikroliter L012-opløsning, 100 mikroliter peberrodsperoxidase og 100 mikroliter Flg22.Tilsæt 200 mikroliter udløsningsopløsning til brøndene. Start softwaren, og klik på eksperimentknappen for at oprette en ny protokol eller bruge en eksisterende protokol. Klik på proceduren i pop op-vinduet for at opsætte pladen og vælge brøndene fra pladen, der skal overvåges.Klik på start kinetic, og indstil kørselstiden til 30 minutter eller længere, afhængigt af eksperimentkravene. Vælg minimumsinterval for at opnå aflæsningerne så ofte som muligt. Og for integrationstid skal du vælge et sekund eller længere afhængigt af signalintensiteten.Klik på valider efterfulgt af Okay for at bekræfte indstillingerne, klik derefter på registrer den nye plade i pop op-vinduet, og vent på, at softwaren beder om dialogboksen med belastningspladen. Fjern forsigtigt det dobbeltdestillerede vand fra hullerne, der indeholder det forbehandlede væv, og undgå vævsbeskadigelse eller udtørring. Brug en flerkanalpipette til at tilsætte 200 mikroliter af udløsningsopløsningen til hullerne, der indeholder vævene.Anbring pladen, der skal testes, på holderen, og begynd detektionen. For at inducere ROS ved Flg22 blev bladskiver og tre millimeter lange skeder brugt. ROS-generering overvåges i 35 minutter.Søjlerne angiver middelværdien af standardafvigelser beregnet ud fra fem tekniske gentagelser. I ris blev stigningen i ROS-produktionen først påvist på et til to minutter, toppede ved 10 til 12 minutter og vendte tilbage til basislinjen på omkring 30 til 35 minutter. Den samlede mængde ROS blev beregnet ud fra kurven.For at opnå den samlede mængde ROS-værdier skal du anvende formlen på de tilsvarende datasæt for at beregne den ROS, der genereres ved hvert tidsinterval, som kan kombineres ved at anvende formelsummen til at beregne det samlede genererede beløb. Et enkelt hul eller to halvdele af en bladskive blev anbragt i brøndene på en 96 brøndmikrotiterplade, der var forbehandlet med 100 mikroliter dobbeltdestilleret vand i 10 til 12 timer og derefter behandlet med Flg22 til ROS-induktion. Aflæsningsværdierne fra de to halve skiveprøver er meget højere end fra hele bladskiven.I gennemsnit er de samlede værdier fra de to halvskiveprøver næsten 1,6 gange så store som fra hele bladskiven, hvilket er proportionalt med kantlængden, ikke med prøvens areal. Dette resultat understøtter, at ROS hovedsageligt genereres i celler på sårstedet. Når du forsøger med denne procedure, skal du betjene væv forsigtigt og ikke foretage ekstra nedskæringer, som kan være en kilde til en datavariation.Denne metode kan anvendes på alle andre ROS-producerende fysiologiske processer i plantevæv.

Research

JoVE Journal

Biology

Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila

Proboscis Extension Response PER Assay in Drosophila

Proboscis extension response (PER) is a taste behavior assay that has been used in flies as well as in honeybees.
On the surface of the fly's mouth ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Afsløring, visualisere og kvantificering af generation af reaktive ilt arter i en amøbe Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time Imaging af Single Engineered RNA-transkripter i levende celler Brug Ratiometrisk bimolekylær Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Forbedret Northern Blot detektering af små RNA-art i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Måling Glutathion-induceret Fodring respons i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Udvikling af en kvantitativ rekombinase Polymerase amplifikationsanalyse med et indre Positiv kontrol

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analyse - En High Throughput, Real Time PCR-analysen for Sc2.0 Genotypebestemmelse

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Stimulering af stamcellenicher og vævsregenerering i musehud ved omskiftelig protoporphyrin IX-afhængig fotogenerering af reaktive iltarter in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Real-Time Overvågning af Aurora kinase En aktivering ved hjælp af kropsbygning FRET Biosensorer i Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...