Name: real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay
Uploaded: 2022-11-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Shanghai Natural Science Foundation (numéro de subvention: 21ZR1429300 / BS1500016), de l’Université Jiao Tong de Shanghai (programme Agri-X, numéro de subvention: AF1500088/002), du Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (numéro de subvention: ZXWH2150201/001) à Jiangbo Fan et par le projet de collaboration médico-ingénierie de l’Université Jiao Tong de Shanghai (numéro de subvention: 21X010301734) à Can Li.

NOTE: Le protocole est applicable à différents tissus végétaux. La gaine de riz et les disques foliaires ont été utilisés dans ce protocole pour la détection des ROS lors de l’obtention du PAMP. Étant donné que les différences résultent principalement de la méthode d’échantillonnage, seules les procédures communes sont décrites ci-dessous, des étapes spécifiques étant mentionnées chaque fois que nécessaire.
1. Culture végétale
<ol><li>Stériliser l...

<ol>
	<li>Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+as+signals+that+modulate+plant+stress+responses+and+programmed+cell+death.">Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.</a> Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).</li><li>Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+are+good.">ROS are good.</a> Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).</li><li>Gilroy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+calcium,+and+electric+signals:+key+mediators+of+rapid+systemic+signaling+in+plants.">ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).</li><li>Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+gene+network+of+plants.">Reactive oxygen gene network of plants.</a> Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).</li><li>Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+burst+of+plant+NADPH+oxidases.">A burst of plant NADPH oxidases.</a> Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).</li><li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses.">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).</li><li>Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+and+redox+signalling+in+the+response+of+plants+to+abiotic+stress.">ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 35 (2), 259-270 (2012).</li><li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+burst+oxidases:+the+engines+of+ROS+signaling.">Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).</li><li>Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+NADPH+oxidase+RBOHD+during+plant+immunity.">Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity.</a> Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).</li><li>Segonzac, C., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+plant+pattern-recognition+receptors+by+bacteria.">Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>Hong, D., Joung, H. -. A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attomolar+detection+of+cytokines+using+a+chemiluminescence+immunoassay+based+on+an+antibody-arrayed+CMOS+image+sensor.">Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).</li><li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+new+sensitive+chemiluminescence+probe,+L-012,+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells.">et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li><li>Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+regulation+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).</li></ol>

Le but de cette étude était d’établir une méthode très efficace pour quantifier la production précoce de ROS en réponse au PAMP dans les tissus du riz. Cette méthode fournit une procédure normalisée pour la détermination en temps réel de l’apoplast ROS produit à partir de tissus de riz traités. Cette méthode est simple à utiliser, peu coûteuse, claire dans sa composition et indépendante des kits commerciaux. Grâce à cette méthode, les chercheurs peuvent étudier la production en temps réel d’a...

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) comprennent une série de dérivés de l’oxygène chimiquement actifs, y compris les radicaux anioniques superoxydes (O2-) et ses dérivés, les radicaux hydroxyles (OH-), le peroxyde d’hydrogène et les produits de l’oxygène singulet ou des réactions d’oxydoréduction qui sont constamment produits dans les plastes et les chloroplastes, les mitochondries, les peroxysomes et d’autres emplacements subcellulaires1 . Les ROS jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques et sont essentiels pour toutes les plantes 2,3,4. Le large spectre des fonctions ROS varie de la régulation de la croissance et du développement à la perception des stress abiotiques et biotiques 5,6,7,8.
Dans le système immunitaire des plantes, les récepteurs localisés de la membrane plasmique des cellules végétales - appelés récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) - perçoivent les profils moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMPs) dérivés de produits chimiques dérivés d’agents pathogènes. Cette reconnaissance déclenche une série de réponses immunitaires rapides, y compris l’afflux de calcium, l’éclatement des ROS et la cascade MAPK; ainsi, cette couche d’immunité est appelée immunité déclenchée par la PAMP (PTI). Le sursaut ROS est une réponse PTI caractéristique, dont la détermination est largement appliquée aux études liées à la PTI 9,10. La production de ROS déclenchée par les PAMP est attribuée à la NADPH oxydase résidant dans la membrane plasmique, ou aux protéines homologues de la famille des oxydases respiratoires éclatées (RBOH), qui transfèrent des électrons du NADPH cytosolique ou du NADH à l’oxygène extracellulaire pour produire du superoxyde (O2-) qui est spontanément converti en peroxyde d’hydrogène (H2O2) par la superoxyde dismutase8 . Le rafale ROS déclenchée par PAMP est assez rapide, apparaissant seulement quelques minutes après le traitement PAMP et culminant à ~10-12 min. La grande majorité des molécules ROS comprennent du peroxyde d’hydrogène (H2O2), qui peut être facilement et régulièrement détecté par un test de chimiluminescence.
En chimiluminescence, le réactif de chimiluminescence réagit avec l’oxygène actif, sous l’action d’un catalyseur, pour produire les intermédiaires à l’état excité. Ensuite, les électrons du produit reviennent à l’état fondamental par transition non radiative et émettent des photons. Les réactifs de chimiluminescence courants comprennent le luminol et le L-012, le luminol dominant l’application11,12,13. Cependant, de plus en plus de chercheurs choisissent L-012 pour détecter la production de ROS, car le L-012 a une efficacité d’émission de lumière beaucoup plus élevée dans des conditions de pH neutre ou quasi neutre par rapport au luminol.
Cet article décrit une méthode de chimiluminescence optimisée, basée sur L-012, pour la détection en temps réel de la production de ROS après l’obtention de PAMP dans les tissus et la gaine des tissus du riz (Oryza sativa). La méthode fournie ici est simple, stable et standardisée, et est hautement adaptable pour répondre à différents besoins expérimentaux. Les données obtenues avec cette méthode sont hautement reproductibles dans des conditions fermement contrôlées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>WHB</td>
			<td>WHB-96-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Innochem</td>
			<td>A43543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flg22</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>p20973</td>
			<td>PAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-012</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>120-04891</td>
			<td>8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Medium</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCLO</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>S101636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish (HRP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampler</td>
			<td>Miltex&#160;</td>
			<td>15110-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610195</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) jouent un rôle essentiel dans une variété de processus biologiques, y compris la détection des stress abiotiques et biotiques. En cas d’infection pathogène ou de provocation par des produits chimiques associés à des agents pathogènes (profils moléculaires associés aux agents pathogènes [PAMPs]), un éventail de réponses immunitaires, y compris une explosion de ROS, est rapidement induit chez les plantes, ce qui est appelé immunité déclenchée par PAMP (PTI). Un sursaut ROS est une réponse PTI caractéristique, qui est catalysée par un groupe de NADPH oxydases localisées dans la membrane plasmique - les protéines de la famille RBOH. La grande majorité des ROS comprennent du peroxyde d’hydrogène (H2O2), qui peut être facilement et régulièrement détecté par une méthode de chimiluminescence à base de luminol. La chimiluminescence est une réaction produisant des photons dans laquelle le luminol, ou son dérivé (tel que L-012), subit une réaction redox avec ROS sous l’action d’un catalyseur. Cet article décrit une méthode de chimiluminescence optimisée basée sur L-012 pour détecter la production d’apoplast ROS en temps réel lors de l’obtention de PAMP dans les tissus de riz. La méthode est facile, stable, standardisée et hautement reproductible dans des conditions fermement contrôlées.

Ici, nous prenons l’exemple du riz pour déterminer les ROS produites avec le traitement flg22. La génération de ROS après déclenchement est transitoire. Dans le riz, l’augmentation de la production de ROS a été détectée pour la première fois en 1-2 min, a culminé à 10-12 min, et est revenue à la ligne de base en ~30-35 min (Figure 3). Par rapport à l’essai de contrôle, dans lequel le PAMP était absent de la solution de déclenchion, ce qui n’a entraîné aucune induct...

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Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Ici, nous décrivons une méthode pour la détection en temps réel de la production d’espèces réactives apoplastiques de l’oxygène (ROS) dans les tissus de riz dans la réponse immunitaire déclenchée par un modèle moléculaire associé à des agents pathogènes. Cette méthode est simple, standardisée et génère des résultats hautement reproductibles dans des conditions contrôlées.

Détection en temps réel de la production d’espèces réactives de l’oxygène dans la réponse immunitaire dans le riz avec un test de chimiluminescence

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Ce protocole décrit une méthode de chimiluminescence optimisée à base de L-012 pour détecter la production de ROS en temps réel lors de l’obtention de PAMP dans les tissus de riz. Cette méthode est facile, standardisée et hautement reproductible dans des conditions fermement contrôlées. Cette procédure sera démontrée par On Ying, un doctorant de mon laboratoire.Pour commencer, stérilisez les graines de riz décortiquées avec de l’éthanol à 70% pendant une minute, puis avec de l’hypochlorite de sodium à 40% pendant une heure. Rincez les graines cinq fois avec de l’eau stérile pour éliminer le chlore résiduel. Dans la méthode de la gaine de riz, plaquez directement les graines dans le récipient en verre stérile avec Murashige et Skoog ou MS milieu.Pour plaquer les graines selon la méthode du disque foliaire, placez-les sur des plaques de SEP pendant cinq à sept jours, puis transplantez-les dans la matrice de croissance ou le sol. Cultivez les plants dans une salle de croissance avec une période de photo lumineuse de 12 heures et 12 heures sombre. Couper la gaine des plants de riz âgés de 10 jours en segments de trois millimètres avec une lame de rasoir tranchante ou une lame chirurgicale pour le prétraitement un jour avant le test ROS.Placer cinq segments de gaine dans un puits individuel d’une plaque de microtitrage de 96 puits contenant 100 microlitres d’eau distillée double pendant 10 à 12 heures. Coupez les disques foliaires des plants de riz âgés de quatre à six semaines à l’aide d’un poinçon de biopsie avec un piston. Coupez toujours les disques foliaires du tiers médian de la deuxième feuille du motoculteur principal pour réduire la variation des données.Ensuite, placez un disque de feuilles dans un puits individuel d’une plaque de microtitrage de 96 puits contenant 100 microlitres d’eau distillée double pendant 10 à 12 heures pour le prétraitement. Gardez tous les disques de feuilles flottants et orientés vers le haut dans les puits d’une plaque de microtitrage pour le prétraitement de l’eau afin d’éviter toute variation associée au côté feuille. Préparer la solution d’élicitation en combinant 9,4 millilitres de 50 micromolaires Tris Hcl, 400 microlitres de solution L012, 100 microlitres de peroxydase de raifort et 100 microlitres de Flg22.Ajouter 200 microlitres de solution de déclenchement dans les puits. Démarrez le logiciel et cliquez sur le bouton expérimentations pour créer un nouveau protocole ou utiliser un protocole existant. Cliquez sur procédure dans la fenêtre contextuelle pour configurer la plaque et sélectionner les puits de la plaque à surveiller.Cliquez sur Démarrer la cinétique et définissez le temps d’exécution sur 30 minutes ou plus, selon les exigences expérimentales. Sélectionnez l’intervalle minimum pour obtenir les lectures aussi souvent que possible. Et pour le temps d’intégration, choisissez une seconde ou plus en fonction de l’intensité du signal.Cliquez sur valider, suivi de OK pour confirmer les paramètres, puis cliquez sur détecter la nouvelle plaque dans la fenêtre contextuelle et attendez que le logiciel invite la boîte de dialogue de la plaque de charge. Retirez soigneusement l’eau bidistillée des puits contenant les tissus prétraités, en évitant tout dommage tissulaire ou dessiccation. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 200 microlitres de la solution de déclenchement aux puits contenant les tissus.Placez la plaque à tester sur le support et commencez la détection. Pour induire les ROS par Flg22, des disques foliaires et des gaines de trois millimètres de long ont été utilisés. La génération ROS est surveillée pendant 35 minutes.Les barres indiquent les moyennes des écarts-types calculés à partir de cinq répétitions techniques. Dans le riz, l’augmentation de la production de ROS a été détectée pour la première fois en une à deux minutes, a culminé à 10 à 12 minutes et est revenue à la valeur de référence en environ 30 à 35 minutes. Le montant total des MDE a été calculé à partir de la courbe.Pour obtenir le montant total des valeurs ROS, appliquez la formule aux ensembles de données correspondants pour calculer le ROS généré à chaque intervalle de temps, qui peut être combiné en appliquant la somme de la formule pour calculer le montant total généré. Un seul trou ou deux moitiés d’un disque de feuilles ont été placés dans les puits d’une plaque de microtitrage de 96 puits prétraitée avec 100 microlitres d’eau distillée double pendant 10 à 12 heures, puis traitée avec Flg22 pour l’induction ROS. Les valeurs de lecture des échantillons des deux demi-disques sont beaucoup plus élevées que celles des échantillons de feuilles entières.En moyenne, les valeurs totales des deux demi-disques sont presque 1,6 fois supérieures à celles de l’ensemble du disque feuille, ce qui est proportionnel à la longueur du bord et non à la surface des échantillons. Ce résultat confirme que les ROS sont principalement générées dans les cellules du site de la plaie. Lorsque vous essayez avec cette procédure, opérez avec des mouchoirs doucement et ne faites pas de découpes supplémentaires qui pourraient être une source de variation de données.Cette méthode peut être appliquée à tout autre processus physiologique produisant des ROS dans les tissus végétaux.

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