Name: real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay
Uploaded: 2022-11-25T15:00:00
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本研究は、上海 自然科学基金会(研究課題番号:21ZR1429300/BS1500016)、上海交通大学(Agri-Xプログラム、研究課題番号:AF1500088/002)、上海農業種子共同イノベーションセンター(研究課題番号:ZXWH2150201/001)から江波ファン氏への助成金、上海交通大学医工連携プロジェクト(課題番号:21X010301734)のカン・リー氏の助成を受けて行われました。

注:このプロトコルは、さまざまな植物組織に適用できます。このプロトコルでは、イネの鞘と葉のディスクを、PAMP誘発時のROS検出に使用しました。主にサンプリングの方法によって違いが生じるため、一般的な手順のみを以下に説明し、必要に応じて具体的な手順について説明します。
1.植物培養
<ol><li>脱皮したイネの種子を70%エタノールで1分間殺菌し?...

<ol>
	<li>Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+as+signals+that+modulate+plant+stress+responses+and+programmed+cell+death.">Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.</a> Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).</li><li>Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+are+good.">ROS are good.</a> Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).</li><li>Gilroy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+calcium,+and+electric+signals:+key+mediators+of+rapid+systemic+signaling+in+plants.">ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).</li><li>Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+gene+network+of+plants.">Reactive oxygen gene network of plants.</a> Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).</li><li>Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+burst+of+plant+NADPH+oxidases.">A burst of plant NADPH oxidases.</a> Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).</li><li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses.">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).</li><li>Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+and+redox+signalling+in+the+response+of+plants+to+abiotic+stress.">ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 35 (2), 259-270 (2012).</li><li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+burst+oxidases:+the+engines+of+ROS+signaling.">Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).</li><li>Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+NADPH+oxidase+RBOHD+during+plant+immunity.">Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity.</a> Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).</li><li>Segonzac, C., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+plant+pattern-recognition+receptors+by+bacteria.">Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>Hong, D., Joung, H. -. A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attomolar+detection+of+cytokines+using+a+chemiluminescence+immunoassay+based+on+an+antibody-arrayed+CMOS+image+sensor.">Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).</li><li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+new+sensitive+chemiluminescence+probe,+L-012,+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells.">et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li><li>Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+regulation+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).</li></ol>

本研究の目的は、イネ組織におけるPAMPに応答した初期ROS産生を非常に効率的に定量する方法を確立することである。この方法は、処理されたイネ組織から産生されたアポプラストROSをリアルタイムで測定するための標準化された手順を提供します。この方法は、操作が簡単で、低コストで、組成が明確で、市販のキットとは無関係です。この方法を使用すると、研究者は、植物が生物的また...

活性酸素種(ROS)は、スーパーオキシドアニオンラジカル(O2-)およびその誘導体、ヒドロキシルラジカル(OH-)、過酸化水素、および一重項酸素または酸化還元反応の生成物を含む一連の化学的に活性な酸素誘導体を含み、色素体および葉緑体、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、およびその他の細胞内位置で絶えず生成されます1。.ROSは多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしており、すべての植物にとって不可欠です2,3,4。ROS機能の幅広いスペクトルは、成長と発達の調節から非生物的および生物的ストレスの知覚までさまざまです5,6,7,8。
植物免疫系では、植物細胞原形質膜に局在する受容体、いわゆるパターン認識受容体(PRR)が病原体由来の化学物質-病原体関連分子パターン(PAMP)を知覚します。この認識は、カルシウム流入、ROSバースト、MAPKカスケードなどの一連の高速免疫応答を引き起こします。したがって、この免疫層はPAMPトリガー免疫(PTI)と呼ばれます。ROSバーストは特徴的なPTI応答であり、その決定はPTI関連の研究に広く適用されています9,10。PAMPによって引き起こされるROS産生は、細胞質質NADPHまたはNADHから細胞外酸素に電子を移動してスーパーオキシド(O 2-)を生成し、スーパーオキシドジスムターゼ8によって自発的に過酸化水素(H 2 O 2)に変換される原形質膜常在型NADPHオキシダーゼ、または呼吸バーストオキシダーゼホモログ(RBOH)ファミリータンパク質に起因します。.PAMPトリガーROSバーストは非常に速く、PAMP治療後わずか数分で現れ、~10〜12分でピークに達します。ROS分子の大部分は過酸化水素(H 2 O2)を含み、これは化学発光アッセイで容易かつ着実に検出することができる。
化学発光においては、化学発光試薬は活性酸素と反応し、触媒の作用により、励起状態中間体を生成する。その後、生成物中の電子は非放射遷移によって基底状態に戻り、光子を放出する。一般的な化学発光試薬には、ルミノールおよびL-012が含まれ、ルミノールがアプリケーションを支配しています11、12、13。しかし、L-012はルミノールと比較して中性または中性に近いpH条件下ではるかに高い発光効率を有するため、より多くの研究者がROS産生を検出するためにL-012を選択しています。
本稿では,イネ(Oryza sativa)組織-葉板および鞘中のPAMPs誘発後のROS産生をリアルタイムに検出するためのL-012に基づく最適化された化学発光法について述べる。ここで提供される方法は、シンプルで安定しており、標準化されており、さまざまな実験ニーズを満たすために高度に適応可能です。この方法で得られたデータは、しっかりと制御された条件下で再現性が高いです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>WHB</td>
			<td>WHB-96-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Innochem</td>
			<td>A43543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flg22</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>p20973</td>
			<td>PAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-012</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>120-04891</td>
			<td>8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Medium</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCLO</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>S101636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish (HRP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampler</td>
			<td>Miltex&#160;</td>
			<td>15110-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610195</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay

活性酸素種(ROS)は、非生物的および生物的ストレスの感知を含む、さまざまな生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。病原体の感染または病原体関連化学物質(病原体関連分子パターン[PAMP])への挑戦により、ROSバーストを含む一連の免疫応答が植物に迅速に誘導され、これはPAMPトリガー免疫(PTI)と呼ばれます。ROSバーストは特徴的なPTI応答であり、原形質膜に局在するNADPHオキシダーゼ(RBOHファミリータンパク質)のグループによって触媒されます。ROSの大部分は過酸化水素(H2O2)を含み、ルミノールベースの化学発光法によって容易かつ着実に検出することができる。化学発光は、ルミノールまたはその誘導体(L-012など)が触媒の作用下でROSと酸化還元反応を起こす光子生成反応です。本論文では、イネ組織におけるPAMP誘発時にアポプラストROS産生をリアルタイムで検出するための最適化されたL-012ベースの化学発光法について説明します。この方法は、しっかりと制御された条件下で、簡単で、安定しており、標準化されており、再現性が高いです。

ここでは、flg22処理で生成されるROSを決定するために、イネ材料を例に挙げます。誘発後のROSの生成は一過性である。イネでは、ROS産生の増加は1-2分で最初に検出され、10-12分でピークに達し、~30-35分でベースラインに戻りました(図3)。誘発溶液中にPAMPが存在せず、明らかなROS誘導を示さなかった対照試験と比較して、特定のROSバーストは、flg22またはキチンなどの他の...

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Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

ここでは、病原体関連分子パターン誘発免疫応答におけるイネ組織における遊性活性酸素種(ROS)産生をリアルタイムに検出する方法について述べる。この方法はシンプルで標準化されており、制御された条件下で再現性の高い結果を生成します。

化学発光アッセイによるイネの免疫応答における活性酸素種産生のリアルタイム検出

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

このプロトコルは、イネ組織におけるPAMP誘発時にROS産生をリアルタイムで検出するための最適化されたL-012ベースの化学発光法について説明しています。この方法は、しっかりと制御された条件下で簡単で標準化されており、再現性が高いです。この手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるOn Yingです。まず、脱皮した米の種子を70%エタノールで1分間殺菌し、次に40%次亜塩素酸ナトリウムで1時間殺菌します。残留塩素を除去するために滅菌水で種子を5回すすいでください。稲鞘法では、滅菌ガラス容器内の種子をムラシゲとスクーグまたはMS培地で直接播種する。リーフディスク法で種子をプレートするには、MSプレートに5〜7日間プレートしてから、成長マトリックスまたは土壌に移植します。12時間の明、12時間の暗い写真期間の成長室で苗を育てます。10日齢のイネ苗の鞘を鋭利なカミソリの刃または手術用刃で3ミリメートルのセグメントに切り、ROSアッセイの前日の前処理を行います。100マイクロリットルの二重蒸留水を含む96ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに5つのシースセグメントを10〜12時間配置します。プランジャー付きの生検パンチを使用して、4〜6週齢のイネから葉のディスクを切り取ります。データのばらつきを減らすために、常にメインティラーの2番目のリーフの中央3分の1からリーフディスクを切り取ります。次に、前処理のために100マイクロリットルの二重蒸留水を含む96ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに1枚のリーフディスクを10〜12時間入れます。葉の側面に関連する変動を避けるために、水の前処理のためにすべてのリーフディスクを浮かせて上向きに保ちます。9.4ミリリットルの50マイクロモルのトリス塩酸塩、400マイクロリットルのL012溶液、100マイクロリットルの西洋ワサビペルオキシダーゼ、および100マイクロリットルのFlg22を組み合わせて、誘発溶液を調製します。200マイクロリットルの誘発溶液をウェルに加える。ソフトウェアを起動し、実験ボタンをクリックして新しいプロトコルを作成するか、既存のプロトコルを使用します。ポップアップの手順をクリックしてプレートを設定し、監視するプレートからウェルを選択します。[キネティックを開始] をクリックし、実験の要件に応じてランタイムを 30 分以上に設定します。最小間隔を選択して、できるだけ頻繁に読み取り値を取得します。また、積分時間については、信号強度に応じて1秒以上を選択してください。[検証]をクリックし、[OK]をクリックして設定を確認し、ポップアップで[新しいプレートを検出]をクリックして、ソフトウェアがロードプレートダイアログボックスを表示するのを待ちます。前処理された組織を含むウェルから二重蒸留水を慎重に取り除き、組織の損傷や乾燥を避けます。マルチチャンネルピペットを使用して、組織を含むウェルに200マイクロリットルの誘発溶液を追加します。テストするプレートをキャリアに置き、検出を開始します。Flg22によるROSの誘導には、リーフディスクと3ミリメートルの長さの鞘を使用しました。ROSの生成は35分間監視されます。バーは、5つのテクニカルリピートから計算された標準偏差の平均を示します。イネでは、ROS産生の増加は1〜2分で最初に検出され、10〜12分でピークに達し、約30〜35分でベースラインに戻りました。ROSの総量は曲線から計算した。ROS値の合計量を取得するには、対応するデータセットに式を適用して各時間間隔で生成されたROSを計算し、式の合計を適用して生成された合計量を計算することで組み合わせることができます。リーフディスクの単一穴または2つの半分を、100マイクロリットルの二重蒸留水で10〜12時間前処理した96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れ、次にROS誘導のためにFlg22で処理しました。2つのハーフディスクサンプルからの読み取り値は、リーフディスク全体からの読み取り値よりもはるかに高くなります。平均して、2つのハーフディスクサンプルの合計値はリーフディスク全体の値のほぼ1.6倍であり、これはサンプルの面積ではなくエッジの長さに比例します。この結果は、ROSが主に創傷部位の細胞で生成されることを裏付けている。この手順を試みるときは、組織を穏やかに操作し、データのばらつきの原因となる可能性のある余分な切り抜きをしないでください。この方法は、植物組織における他の任意のROS産生生理学的プロセスに適用することができる。

Research

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Biology

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、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量

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