Name: real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay
Uploaded: 2022-11-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Shanghai Natural Science Foundation (tilskuddsnummer: 21ZR1429300 / BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (Agri-X-programmet, stipendnummer: AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (tilskuddsnummer: ZXWH2150201/001) til Jiangbo Fan, og av Medical-Engineering Collaboration Project of Shanghai Jiao Tong Univesity (tilskuddsnummer: 21X010301734) til Can Li.

MERK: Protokollen gjelder for forskjellige plantevev. Riskappe og bladskiver ble brukt i denne protokollen for ROS-deteksjon ved PAMP-fremkalling. Siden forskjeller hovedsakelig oppstår på grunn av prøvetakingsmetoden, er bare de vanlige prosedyrene beskrevet nedenfor, med spesifikke trinn nevnt der det er nødvendig.
1. Plantekultur
<ol><li>Steriliser de avskallede risfrøene med 70% etanol i 1 min, deretter med 40% natriumhypokloritt (NaClO) i 1 time. Skyll deretter fr?...

<ol>
	<li>Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+as+signals+that+modulate+plant+stress+responses+and+programmed+cell+death.">Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.</a> Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).</li><li>Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+are+good.">ROS are good.</a> Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).</li><li>Gilroy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+calcium,+and+electric+signals:+key+mediators+of+rapid+systemic+signaling+in+plants.">ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).</li><li>Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+gene+network+of+plants.">Reactive oxygen gene network of plants.</a> Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).</li><li>Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+burst+of+plant+NADPH+oxidases.">A burst of plant NADPH oxidases.</a> Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).</li><li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses.">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).</li><li>Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+and+redox+signalling+in+the+response+of+plants+to+abiotic+stress.">ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 35 (2), 259-270 (2012).</li><li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+burst+oxidases:+the+engines+of+ROS+signaling.">Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).</li><li>Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+NADPH+oxidase+RBOHD+during+plant+immunity.">Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity.</a> Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).</li><li>Segonzac, C., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+plant+pattern-recognition+receptors+by+bacteria.">Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>Hong, D., Joung, H. -. A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attomolar+detection+of+cytokines+using+a+chemiluminescence+immunoassay+based+on+an+antibody-arrayed+CMOS+image+sensor.">Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).</li><li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+new+sensitive+chemiluminescence+probe,+L-012,+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells.">et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li><li>Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+regulation+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).</li></ol>

Formålet med denne studien var å etablere en svært effektiv metode for å kvantifisere tidlig ROS-produksjon som respons på PAMP i risvev. Denne metoden gir en standardisert prosedyre for sanntidsbestemmelse av apoplast ROS produsert fra behandlet risvev. Denne metoden er enkel i drift, lav kostnad, klar i sammensetning og uavhengig av kommersielle sett. Ved hjelp av denne metoden kan forskere studere sanntidsproduksjonen av apoplast ROS når planter blir utsatt for biotiske eller abiotiske påkjenninger.
<p clas...

Reaktive oksygenarter (ROS) omfatter en serie kjemisk aktive oksygenderivater, inkludert superoksidanionradikaler (O2-) og dets derivater, hydroksylradikaler (OH-), hydrogenperoksid og produkter av singlet oksygen eller oksidasjonsreduksjonsreaksjoner, som kontinuerlig produseres i plastider og kloroplaster, mitokondrier, peroksisomer og andre subcellulære steder1 . ROS spiller viktige roller i mange biologiske prosesser og er avgjørende for alle planter 2,3,4. Det brede spekteret av ROS-funksjoner varierer fra regulering av vekst og utvikling til oppfatningen av abiotiske og biotiske påkjenninger 5,6,7,8.
I planteimmunsystemet oppfatter plantecelleplasmamembranlokaliserte reseptorer - såkalte mønstergjenkjenningsreseptorer (PRR) - patogenavledede kjemikalier-patogenassosierte molekylære mønstre (PAMP). Denne anerkjennelsen utløser en rekke raske immunresponser, inkludert kalsiumtilstrømning, ROS-burst og MAPK-kaskade; Dermed kalles dette immunitetslaget PAMP-utløst immunitet (PTI). ROS-utbrudd er en kjennetegnende PTI-respons, hvis bestemmelse er mye brukt på PTI-relaterte studier 9,10. ROS-produksjon utløst av PAMPs tilskrives plasmamembranresident NADPH-oksidase, eller respiratorisk burst oxidase homolog (RBOH) familieproteiner, som overfører elektroner fra cytosolisk NADPH eller NADH til ekstracellulært oksygen for å produsere superoksid (O 2-) som spontant omdannes til hydrogenperoksid (H 2 O 2) av superoksiddismutase 8 . PAMP-utløst ROS-utbrudd er ganske rask, og vises bare noen få minutter etter PAMP-behandling og topper seg på ~ 10-12 min. De aller fleste ROS-molekylene består av hydrogenperoksid (H2O2), som enkelt og jevnt kan detekteres med en kjemiluminescensanalyse.
Ved kjemiluminescens reagerer kjemiluminescensreagenset med aktivt oksygen, under virkningen av en katalysator, for å produsere mellomprodukter i eksitert tilstand. Deretter går elektronene i produktet tilbake til grunntilstanden gjennom ikke-strålingsovergang og avgir fotoner. Vanlige kjemiluminescensreagensreagenser inkluderer luminol og L-012, med luminol som dominerer applikasjonen11,12,13. Imidlertid velger flere forskere L-012 for å oppdage ROS-produksjon, siden L-012 har en mye høyere lysutslippseffektivitet under nøytrale eller nær nøytrale pH-forhold sammenlignet med luminol.
Denne artikkelen beskriver en optimalisert kjemiluminescensmetode, basert på L-012, for sanntidsdeteksjon av ROS-produksjon etter fremkalling av PAMP-er i risskiver (Oryza sativa) vevsbladskiver og kappe. Metoden som tilbys her er enkel, stabil og standardisert, og er svært tilpasningsdyktig for å møte ulike eksperimentelle behov. Dataene oppnådd med denne metoden er svært reproduserbare under fast kontrollerte forhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>WHB</td>
			<td>WHB-96-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Innochem</td>
			<td>A43543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flg22</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>p20973</td>
			<td>PAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-012</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>120-04891</td>
			<td>8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Medium</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCLO</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>S101636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish (HRP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampler</td>
			<td>Miltex&#160;</td>
			<td>15110-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610195</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay

Reaktive oksygenarter (ROS) spiller viktige roller i en rekke biologiske prosesser, inkludert sensing av abiotiske og biotiske påkjenninger. Ved patogeninfeksjon eller utfordring med patogenassosierte kjemikalier (patogenassosierte molekylære mønstre [PAMPs]), induseres en rekke immunresponser, inkludert et ROS-utbrudd, raskt i planter, som kalles PAMP-utløst immunitet (PTI). Et ROS-utbrudd er en kjennetegnet PTI-respons, som katalyseres av en gruppe plasmamembranlokaliserte NADPH-oksidaser - RBOH-familieproteinene. Det store flertallet av ROS består av hydrogenperoksid (H 2 O2), som enkelt og jevnt kan detekteres ved en luminolbasert kjemiluminescensmetode. Kjemiluminescens er en fotonproduserende reaksjon hvor luminol, eller dets derivat (slik som L-012), gjennomgår en redoksreaksjon med ROS under virkningen av en katalysator. Denne artikkelen beskriver en optimalisert L-012-basert kjemiluminescensmetode for å oppdage apoplast ROS-produksjon i sanntid ved PAMP-fremkalling i risvev. Metoden er enkel, stødig, standardisert og svært reproduserbar under godt kontrollerte forhold.

Her tar vi rismateriale som et eksempel for å bestemme ROS produsert med flg22-behandling. Genereringen av ROS etter fremkalling er forbigående. Hos ris ble økningen i ROS-produksjonen først oppdaget på 1-2 minutter, toppet seg ved 10-12 min, og returnert til baseline i ~30-35 min (figur 3). Sammenlignet med kontrolltesten, der PAMP var fraværende i fremkallingsløsningen som ikke resulterte i noen åpenbar ROS-induksjon, ble et spesifikt ROS-utbrudd indusert bare når fremkallingsoppl...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay at JoVE.com

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Her beskriver vi en metode for sanntidsdeteksjon av apoplastisk reaktiv oksygenart (ROS) produksjon i risvev i patogenassosiert molekylær mønsterutløst immunrespons. Denne metoden er enkel, standardisert og genererer svært reproduserbare resultater under kontrollerte forhold.

Sanntidsdeteksjon av reaktiv oksygenartsproduksjon i immunrespons i ris med en kjemiluminescensanalyse

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Denne protokollen beskriver en optimalisert L-012-basert kjemiluminescensmetode for å oppdage ROS-produksjon i sanntid ved PAMP-fremkalling i risvev. Denne metoden er enkel, standardisert og svært reproduserbar under godt kontrollerte forhold. Demonstrere denne prosedyren vil være på Ying, en doktorgradsstudent fra laboratoriet mitt.For å begynne med, steriliser de avskallede risfrøene med 70% etanol i ett minutt, deretter med 40% natriumhypokloritt i en time. Skyll frøene fem ganger med sterilt vann for å fjerne gjenværende klor. I risskjeden metoden, direkte plate frøene i det sterile glassbeholderen med Murashige og Skoog eller MS medium.For å plate frøene i bladskivemetoden, Plate dem på MS-plater i fem til syv dager og transplanter dem deretter til vekstmatrisen eller jord. Voks plantene i et vekstrom med en 12 timers lys, 12 timers mørk fotoperiode. Klipp skjeden fra 10 dager gamle risplanter i tre millimeter segmenter med et skarpt barberblad eller kirurgisk blad for forbehandling en dag før ROS-analysen.Plasser fem skjede segmenter i en individuell brønn av en 96 brønn mikrotiter plate inneholdende 100 mikroliter dobbelt destillert vann i 10 til 12 timer. Klipp bladskivene fra fire til seks uker gamle risplanter ved hjelp av en biopsi-stans med et stempel. Klipp alltid bladskivene fra den midterste tredjedelen av det andre bladet på hovedrorkulten for å redusere datavariasjonen.Deretter plasserer du en bladskive i en individuell brønn på en 96 brønnmikrotiterplate som inneholder 100 mikroliter dobbeltdestillert vann i 10 til 12 timer for forbehandling. Hold alle bladskivene flytende og vendt opp i brønnene på en mikrotiterplate for vannforbehandling for å unngå variasjon i bladsiden. Forbered fremkallingsløsning ved å kombinere 9,4 ml 50 mikromolar Tris Hcl, 400 mikroliter L012-løsning, 100 mikroliter hestreddikperoksidase og 100 mikroliter Flg22.Tilsett 200 mikroliter fremkallingsløsning til brønnene. Start programvaren og klikk på eksperimenter-knappen for å opprette en ny protokoll eller bruke en eksisterende protokoll. Klikk prosedyre i popup-vinduet for å sette opp platen og velg brønnene fra platen som skal overvåkes.Klikk start kinetikk og sett kjøretiden til 30 minutter eller lenger, avhengig av eksperimentelle krav. Velg minimumsintervall for å få avlesningene så ofte som mulig. Og for integrasjonstid, velg ett sekund eller lenger, avhengig av signalintensiteten.Klikk på valider, etterfulgt av OK for å bekrefte innstillingene, og klikk deretter på oppdag den nye platen i popup-vinduet og vent til programvaren ber om lastplatedialogen. Fjern forsiktig det dobbeltdestillerte vannet fra brønnene som inneholder det forbehandlede vevet, og unngå vevskader eller uttørking. Bruk en flerkanals pipette for å tilsette 200 mikroliter av elicitasjonsløsningen til brønnene som inneholder vevene.Plasser platen som skal testes på holderen og begynn deteksjonen. For å indusere ROS ved Flg22 ble bladskiver og tre millimeter lange skjeder brukt. ROS-genereringen overvåkes i 35 minutter.Stolpene angir gjennomsnittet av standardavvik beregnet fra fem tekniske repetisjoner. I ris ble økningen i ROS-produksjonen først oppdaget på ett til to minutter, toppet på 10 til 12 minutter og returnert til baseline på rundt 30 til 35 minutter. Den totale mengden ROS ble beregnet ut fra kurven.For å få den totale mengden ROS-verdier, bruk formelen på de tilsvarende datasettene for å beregne ROS generert ved hvert tidsintervall, som kan kombineres ved å bruke formelsummen til å beregne den totale mengden generert. Et enkelt hull eller to halvdeler av en bladskive ble plassert i brønnene til en 96-brønns mikrotiterplate forbehandlet med 100 mikroliter dobbeltdestillert vann i 10 til 12 timer og deretter behandlet med Flg22 for ROS-induksjon. Leseverdiene fra de to halve skiveprøvene er mye høyere enn fra hele bladskiven.I gjennomsnitt er de totale verdiene fra de to halve skiveprøvene nesten 1,6 ganger de fra hele bladskiven, som er proporsjonal med kantlengden, ikke med prøvenes areal. Dette resultatet støtter at ROS hovedsakelig genereres i celler på sårstedet. Når du prøver med denne prosedyren, operer med vev forsiktig og ikke gjør ekstra kutt ut som kan være en kilde til en datavariasjon.Denne metoden kan brukes på andre ROS-produserende fysiologiske prosesser i plantevev.

Research

JoVE Journal

Biology

Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila

Proboscis Extension Response PER Assay in Drosophila

Proboscis extension response (PER) is a taste behavior assay that has been used in flies as well as in honeybees.
On the surface of the fly's mouth ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Oppdager, visualisere og kvantifisere generasjon av reaktive oksygen arter i en Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time Imaging av Enkelt Engineered RNA transkripsjoner i levende celler ved hjelp Proporsjonellekspansjon bimolekylære Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Forbedret Northern Blot Påvisning av små RNA Arter i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Måling glutation-indusert Fôring Response i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Utvikling av en kvantitativ rekombinase Polymerase Amplification analysen med en intern positiv kontroll

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analysis - En høy gjennomstrømning, Real Time PCR-analyse for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Stimulering av stamcellenisjer og vevregenerering i musehud ved byttbar protoporfyrin IX-avhengig fotogenerering av reaktive oksygenarter in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Sanntidsovervåking av Aurora kinase A-aktivering ved hjelp av konforme FRET Biosensorer i levende celler

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...