Name: real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay
Uploaded: 2022-11-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios da Shanghai Natural Science Foundation (Número de Bolsa: 21ZR1429300/BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (Programa Agri-X, Número de Bolsa:AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (Número de Bolsa: ZXWH2150201/001) para Jiangbo Fan, e pelo Projeto de Colaboração de Engenharia Médica da Shanghai Jiao Tong Univesity (Número de Bolsa: 21X010301734) para Can Li.

NOTA: O protocolo é aplicável a diferentes tecidos vegetais. Bainha de arroz e discos foliares foram utilizados neste protocolo para detecção de ROS após elicitação de PAMP. Uma vez que as diferenças surgem principalmente devido ao método de amostragem, apenas os procedimentos comuns são descritos a seguir, sendo mencionadas etapas específicas sempre que necessário.
1. Cultura vegetal
<ol><li>Esterilizar as sementes de arroz descascadas com etanol 70% por 1 min e...

<ol>
	<li>Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+as+signals+that+modulate+plant+stress+responses+and+programmed+cell+death.">Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.</a> Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).</li><li>Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+are+good.">ROS are good.</a> Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).</li><li>Gilroy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+calcium,+and+electric+signals:+key+mediators+of+rapid+systemic+signaling+in+plants.">ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).</li><li>Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+gene+network+of+plants.">Reactive oxygen gene network of plants.</a> Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).</li><li>Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+burst+of+plant+NADPH+oxidases.">A burst of plant NADPH oxidases.</a> Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).</li><li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses.">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).</li><li>Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+and+redox+signalling+in+the+response+of+plants+to+abiotic+stress.">ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 35 (2), 259-270 (2012).</li><li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+burst+oxidases:+the+engines+of+ROS+signaling.">Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).</li><li>Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+NADPH+oxidase+RBOHD+during+plant+immunity.">Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity.</a> Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).</li><li>Segonzac, C., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+plant+pattern-recognition+receptors+by+bacteria.">Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>Hong, D., Joung, H. -. A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attomolar+detection+of+cytokines+using+a+chemiluminescence+immunoassay+based+on+an+antibody-arrayed+CMOS+image+sensor.">Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).</li><li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+new+sensitive+chemiluminescence+probe,+L-012,+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells.">et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li><li>Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+regulation+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).</li></ol>

O objetivo deste estudo foi estabelecer um método altamente eficiente para quantificar a produção precoce de ERO em resposta ao PAMP em tecidos de arroz. Este método fornece um procedimento padronizado para a determinação em tempo real de ROS de apoplasto produzido a partir de tecidos de arroz tratados. Este método é simples na operação, baixo custo, claro na composição e independente de kits comerciais. Usando este método, os pesquisadores podem estudar a produção em tempo real de ROS apoplasto quando as ...

As espécies reativas de oxigênio (EROs) compreendem uma série de derivados quimicamente ativos do oxigênio, incluindo radicais ânion superóxido (O2-) e seus derivados, radicais hidroxila (OH-), peróxido de hidrogênio e produtos de oxigênio singlete ou reações de oxidação-redução, que são constantemente produzidos em plastídios e cloroplastos, mitocôndrias, peroxissomas e outros locais subcelulares 1 . As ERO desempenham papéis importantes em muitos processos biológicos e são essenciais para todas as plantas 2,3,4. O amplo espectro de funções das ROS varia desde a regulação do crescimento e desenvolvimento até a percepção de estresses abióticos e bióticos 5,6,7,8.
No sistema imune vegetal, os receptores localizados na membrana plasmática das células vegetais - os chamados receptores de reconhecimento padrão (PRRs) - percebem padrões moleculares associados a patógenos derivados de patógenos (PAMPs). Esse reconhecimento desencadeia uma série de respostas imunes rápidas, incluindo influxo de cálcio, explosão de ROS e cascata MAPK; assim, essa camada de imunidade é denominada imunidade desencadeada por PAMP (PTI). O ROS burst é uma resposta marcante do ITP, cuja determinação é amplamente aplicada em estudos relacionados a PTI 9,10. A produção de EROs desencadeada por PAMPs é atribuída às proteínas da família NADPH oxidase residentes na membrana plasmática, ou proteínas da família RBOH (respiratory burst oxidase homolog), que transferem elétrons de NADPH citosólico ou NADH para oxigênio extracelular para produzir superóxido (O 2-) que é espontaneamente convertido em peróxido de hidrogênio (H 2 O 2) pela superóxido dismutase8 . A explosão de ROS desencadeada por PAMP é bastante rápida, aparecendo apenas alguns minutos após o tratamento com PAMP e atingindo um pico de ~10-12 min. A grande maioria das moléculas de ROS compreende peróxido de hidrogênio (H2 O2), que pode ser fácil e constantemente detectado com um ensaio de quimioluminescência.
Na quimioluminescência, o reagente quimioluminescente reage com oxigênio ativo, sob a ação de um catalisador, para produzir os intermediários de estado excitado. Em seguida, os elétrons no produto retornam ao estado fundamental através de transição não radiativa e emitem fótons. Os quimioluminescentes comuns incluem luminol e L-012, com luminol dominando a aplicação11,12,13. No entanto, mais pesquisadores estão escolhendo L-012 para detectar a produção de ROS, uma vez que L-012 tem uma eficiência de emissão de luz muito maior sob condições de pH neutro ou quase neutro em comparação com o luminol.
Este trabalho descreve um método otimizado de quimioluminescência, baseado em L-012, para a detecção em tempo real da produção de ERO após a eliciação de PAMPs em tecidos-discos foliares e bainha de arroz (Oryza sativa). O método aqui apresentado é simples, estável e padronizado, e é altamente adaptável para atender a diferentes necessidades experimentais. Os dados obtidos com este método são altamente reprodutíveis sob condições firmemente controladas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>WHB</td>
			<td>WHB-96-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Innochem</td>
			<td>A43543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flg22</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>p20973</td>
			<td>PAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-012</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>120-04891</td>
			<td>8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Medium</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCLO</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>S101636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish (HRP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampler</td>
			<td>Miltex&#160;</td>
			<td>15110-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610195</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay

Espécies reativas de oxigênio (ROS) desempenham papéis vitais em uma variedade de processos biológicos, incluindo a detecção de estresses abióticos e bióticos. Após a infecção do patógeno ou desafio com produtos químicos associados a patógenos (padrões moleculares associados a patógenos [PAMPs]), uma série de respostas imunes, incluindo uma explosão de ROS, são rapidamente induzidas em plantas, o que é chamado de imunidade desencadeada por PAMP (PTI). A explosão de ROS é uma resposta característica do PTI, que é catalisada por um grupo de NADPH oxidases localizadas na membrana plasmática - as proteínas da família RBOH. A grande maioria das ERO compreende peróxido de hidrogênio (H2 O2), que pode ser fácil e constantemente detectado por um método de quimioluminescência à base de luminol. A quimioluminescência é uma reação produtora de fótons na qual o luminol, ou seu derivado (como L-012), sofre uma reação redox com ROS sob a ação de um catalisador. Este trabalho descreve um método otimizado de quimioluminescência baseado em L-012 para detectar a produção de ROS de apoplasto em tempo real após a elicitação por PAMP em tecidos de arroz. O método é fácil, estável, padronizado e altamente reprodutível sob condições firmemente controladas.

Aqui, tomamos o material de arroz como exemplo para determinar as ROS produzidas com o tratamento flg22. A geração de ROS após a elicitação é transitória. No arroz, o aumento na produção de ROS foi detectado pela primeira vez em 1-2 min, atingiu o pico em 10-12 min e retornou à linha de base em ~30-35 min (Figura 3). Em comparação com o teste controle, no qual PAMP estava ausente na solução de elicitação, resultando em indução de ROS sem óbvia, um burst específico de ROS ...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay at JoVE.com

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Aqui, descrevemos um método para a detecção em tempo real da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) apoplásicas em tecidos de arroz em resposta imune desencadeada por padrão molecular associado a patógenos. Este método é simples, padronizado e gera resultados altamente reprodutíveis em condições controladas.

Detecção em Tempo Real da Produção de Espécies Reativas de Oxigênio na Resposta Imune em Arroz com Ensaio de Quimioluminescência

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Este protocolo descreve um método otimizado de quimioluminescência baseado em L-012 para detectar a produção de ROS em tempo real após a elicitação de PAMP em tecidos de arroz. Este método é fácil, padronizado e altamente reprodutível sob condições firmemente controladas. Quem demonstrará esse procedimento será On Ying, estudante de doutorado do meu laboratório.Para começar, esterilize as sementes de arroz descascadas com etanol 70% por um minuto e, em seguida, com hipoclorito de sódio a 40% por uma hora. Enxágue as sementes cinco vezes com água estéril para remover o cloro residual. No método da bainha de arroz, plaquear diretamente as sementes no recipiente de vidro estéril com meio Murashige e Skoog ou MS.Para plaquear as sementes pelo método do disco foliar, plaqueie-as em placas MS por cinco a sete dias e, em seguida, transplante-as para a matriz de crescimento ou solo. Cultivar as mudas em uma sala de crescimento com um período de fotos de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Cortar a bainha de mudas de arroz com 10 dias de idade em segmentos de três milímetros com lâmina de barbear afiada ou lâmina cirúrgica para pré-tratamento um dia antes do ensaio de ROS.Coloque cinco segmentos de bainha em um poço individual de uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 100 microlitros de água bidestilada por 10 a 12 horas. Corte os discos foliares de plantas de arroz de quatro a seis semanas usando um punch de biópsia com um êmbolo. Sempre corte os discos foliares a partir do terço médio da segunda folha do perfilhador principal para reduzir a variação dos dados.Em seguida, colocar um disco foliar em um poço individual de uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 100 microlitros de água bidestilada por 10 a 12 horas para pré-tratamento. Mantenha todos os discos foliares flutuando e virados para cima nos poços de uma placa de microtitulação para pré-tratamento de água para evitar variação associada ao lado da folha. Prepare a solução de elicitação combinando 9,4 mililitros de 50 micromolares Tris Hcl, 400 microlitros de solução L012, 100 microlitros de peroxidase de rabanete de cavalo e 100 microlitros de Flg22.Adicionar 200 microlitros de solução de elicitação aos poços. Inicie o software e clique no botão de experimentos para criar um novo protocolo ou usar um protocolo existente. Clique no procedimento no pop-up para configurar a placa e selecionar os poços da placa a serem monitorados.Clique em iniciar cinética e defina o tempo de execução para 30 minutos ou mais, dependendo dos requisitos experimentais. Selecione o intervalo mínimo para obter as leituras com a maior frequência possível. E para o tempo de integração, escolha um segundo ou mais, dependendo da intensidade do sinal.Clique em validar, seguido de Ok para confirmar as configurações, em seguida, clique em detectar a nova placa no pop-up e aguarde até que o software avise a caixa de diálogo da placa de carga. Remova cuidadosamente a água bidestilada dos poços que contêm os tecidos pré-tratados, evitando qualquer dano tecidual ou dessecação. Use uma pipeta multicanal para adicionar 200 microlitros da solução de elicitação aos poços contendo os tecidos.Coloque a placa a ser testada no suporte e inicie a detecção. Para a indução de ERO por Flg22, foram utilizados discos foliares e bainhas de três milímetros de comprimento. A geração de ROS é monitorada por 35 minutos.As barras indicam as médias dos desvios-padrão calculados a partir de cinco repetições técnicas. No arroz, o aumento na produção de ERO foi detectado pela primeira vez em um a dois minutos, atingiu o pico em 10 a 12 minutos e retornou à linha de base em cerca de 30 a 35 minutos. A quantidade total de ROS foi calculada a partir da curva.Para obter a quantidade total de valores de ROS, aplique a fórmula aos conjuntos de dados correspondentes para calcular o ROS gerado em cada intervalo de tempo, que pode ser combinado aplicando a soma da fórmula para calcular a quantidade total gerada. Um único orifício ou duas metades de um disco foliar foram colocados nos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços pré-tratada com 100 microlitros de água bidestilada por 10 a 12 horas e, em seguida, tratada com Flg22 para indução de EROs. Os valores de leitura das duas amostras de meio disco são muito maiores do que os do disco de folha inteira.Em média, os valores totais das duas amostras de meio disco são quase 1,6 vezes maiores do que os do disco foliar inteiro, o que é proporcional ao comprimento da borda, não à área das amostras. Esse resultado confirma que as ERO são geradas principalmente nas células do local da ferida. Ao tentar com este procedimento, opere com os tecidos suavemente e não faça cortes extras que poderiam ser uma fonte de variação de dados.Este método pode ser aplicado a qualquer outro processo fisiológico produtor de ERO em tecidos vegetais.

Research

JoVE Journal

Biology

Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila

Proboscis Extension Response PER Assay in Drosophila

Extensão Proboscis Response Assay (PER) em Drosophila

Proboscis extension response (PER) is a taste behavior assay that has been used in flies as well as in honeybees.
On the surface of the fly's mouth ...

Biologia

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Detectando, visualizar e quantificar a geração de espécies reativas de oxigênio em um modelo de sistema Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Aprimorada do Norte Detecção Blot de pequeno RNA de espécies em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Medindo alimentação resposta induzida por glutationa em Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Desenvolvimento de um Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Ensaio com um controlo positivo interno

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Análise qPCRTag - A High Throughput, PCR em Tempo Real Ensaio para Sc2.0 Genotipagem

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Estimulação de nichos de células-tronco e regeneração tecidual em pele de camundongo por fotogeração dependente de protoporfirina IX comutável de espécies reativas de oxigênio in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Monitoramento em tempo real da aurora quinase Uma ativação usando biosensores de FRET conformacional em células vivas

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...