Name: real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay
Uploaded: 2022-11-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Шанхайского фонда естественных наук (номер гранта: 21ZR1429300 / BS1500016), Шанхайского университета Цзяотун (программа Agri-X, номер гранта: AF1500088/002), Шанхайского совместного инновационного центра сельскохозяйственных семян (номер гранта: ZXWH2150201/001) для Цзянбо Фана и Проекта сотрудничества в области медицины и инженерии Шанхайского университета Цзяотун (номер гранта: 21X010301734) для Кан Ли.

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол применим к различным тканям растений. Рисовая оболочка и листовые диски использовались в этом протоколе для обнаружения АФК при выявлении PAMP. Поскольку различия возникают главным образом из-за метода отбора проб, ниже описываются только общие процедуры, при этом п...

<ol>
	<li>Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+as+signals+that+modulate+plant+stress+responses+and+programmed+cell+death.">Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.</a> Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).</li><li>Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+are+good.">ROS are good.</a> Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).</li><li>Gilroy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+calcium,+and+electric+signals:+key+mediators+of+rapid+systemic+signaling+in+plants.">ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).</li><li>Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+gene+network+of+plants.">Reactive oxygen gene network of plants.</a> Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).</li><li>Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+burst+of+plant+NADPH+oxidases.">A burst of plant NADPH oxidases.</a> Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).</li><li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses.">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).</li><li>Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+and+redox+signalling+in+the+response+of+plants+to+abiotic+stress.">ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 35 (2), 259-270 (2012).</li><li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+burst+oxidases:+the+engines+of+ROS+signaling.">Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).</li><li>Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+NADPH+oxidase+RBOHD+during+plant+immunity.">Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity.</a> Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).</li><li>Segonzac, C., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+plant+pattern-recognition+receptors+by+bacteria.">Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>Hong, D., Joung, H. -. A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attomolar+detection+of+cytokines+using+a+chemiluminescence+immunoassay+based+on+an+antibody-arrayed+CMOS+image+sensor.">Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).</li><li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+new+sensitive+chemiluminescence+probe,+L-012,+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells.">et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li><li>Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+regulation+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).</li></ol>

Цель этого исследования состояла в том, чтобы создать высокоэффективный метод количественной оценки ранней продукции АФК в ответ на ПАМП в тканях риса. Этот метод обеспечивает стандартизированную процедуру определения в режиме реального времени апопластных АФК, полученных из обрабо?...

Активные формы кислорода (АФК) включают ряд химически активных производных кислорода, включая супероксидные анионные радикалы (O2-) и его производные, гидроксильные радикалы (OH-), перекись водорода и продукты синглетного кислорода или окислительно-восстановительных реакций, которые постоянно образуются в пластидах и хлоропластах, митохондриях, пероксисомах и других субклеточных участках 1 . АФК играют важную роль во многих биологических процессах и необходимы для всех растений 2,3,4. Широкий спектр функций АФК варьируется от регуляции роста и развития до восприятия абиотических и биотических стрессов 5,6,7,8.
В иммунной системе растений рецепторы, локализованные в плазматической мембране растительных клеток - так называемые рецепторы распознавания образов (PRR) - воспринимают химические вещества, полученные из патогенов, - молекулярные паттерны, связанные с патогенами (PAMP). Это распознавание запускает серию быстрых иммунных реакций, включая приток кальция, взрыв АФК и каскад MAPK; таким образом, этот уровень иммунитета называется иммунитетом, вызванным PAMP (PTI). Всплеск АФК является отличительной реакцией PTI, определение которой широко применяется в исследованиях, связанных с PTI 9,10. Продукция АФК, инициируемая PAMP, объясняется резидентной плазматической мембраной белками семейства НАДФН-оксидазы или гомолога респираторной взрывооксидазы (RBOH), которые переносят электроны из цитозольного НАДФН или НАДН во внеклеточный кислород с образованием супероксида (O2-), который спонтанно превращается в перекись водорода (H2O2O2) супероксиддисмутазой8 . Всплеск АФК, вызванный PAMP, довольно быстрый, появляется всего через несколько минут после лечения PAMP и достигает пика через ~ 10-12 минут. Подавляющее большинство молекул АФК содержит перекись водорода (H2O2), которую можно легко и стабильно обнаружить с помощью хемилюминесцентного анализа.
При хемилюминесценции хемилюминесцентный реагент реагирует с активным кислородом под действием катализатора с образованием промежуточных продуктов возбужденного состояния. Затем электроны в продукте возвращаются в основное состояние посредством безызлучательного перехода и испускают фотоны. Общие хемилюминесцентные реагенты включают люминол и L-012, причем люминол доминирует в применении11,12,13. Тем не менее, все больше исследователей выбирают L-012 для обнаружения образования АФК, поскольку L-012 имеет гораздо более высокую эффективность светового излучения в нейтральных или почти нейтральных условиях pH по сравнению с люминолом.
В данной работе описывается оптимизированный метод хемилюминесценции, основанный на L-012, для обнаружения продукции АФК в режиме реального времени после выявления PAMP в тканях риса (Oryza sativa), листовых дисках и оболочке. Представленный здесь метод прост, стабилен и стандартизирован и легко адаптируется к различным экспериментальным потребностям. Данные, полученные с помощью этого метода, обладают высокой воспроизводимостью в строго контролируемых условиях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>WHB</td>
			<td>WHB-96-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Innochem</td>
			<td>A43543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flg22</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>p20973</td>
			<td>PAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-012</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>120-04891</td>
			<td>8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Medium</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCLO</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>S101636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish (HRP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampler</td>
			<td>Miltex&#160;</td>
			<td>15110-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610195</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay

Активные формы кислорода (АФК) играют жизненно важную роль в различных биологических процессах, включая обнаружение абиотических и биотических стрессов. При заражении патогеном или контакте с химическими веществами, связанными с патогенами (патоген-ассоциированные молекулярные паттерны [PAMP]), в растениях быстро индуцируется множество иммунных реакций, включая взрыв АФК, что называется иммунитетом, вызванным PAMP (PTI). Всплеск АФК является отличительной реакцией PTI, которая катализируется группой локализованных в плазматической мембране НАДФН-оксидаз - белков семейства RBOH. Подавляющее большинство АФК содержит перекись водорода (H2O2), которая может быть легко и стабильно обнаружена методом хемилюминесценции на основе люминола. Хемилюминесценция представляет собой реакцию, продуцирующую фотоны, в которой люминол или его производное (например, L-012) подвергается окислительно-восстановительной реакции с АФК под действием катализатора. В этой статье описывается оптимизированный метод хемилюминесценции на основе L-012 для обнаружения продукции апопласта АФК в режиме реального времени при выявлении PAMP в тканях риса. Метод прост, устойчив, стандартизирован и легко воспроизводим в строго контролируемых условиях.

Здесь мы берем рисовый материал в качестве примера для определения АФК, полученных при обработке flg22. Генерация АФК после выявления является преходящей. В рисе увеличение продукции АФК было впервые обнаружено через 1-2 мин, достигло пика через 10-12 мин и вернулось к исходному уровню через ...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay at JoVE.com

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Здесь мы описываем метод обнаружения в режиме реального времени продукции апопластических активных форм кислорода (АФК) в тканях риса в иммунном ответе, вызванном патогенным молекулярным паттерном. Этот метод прост, стандартизирован и дает высоковоспроизводимые результаты в контролируемых условиях.

Обнаружение продукции активных форм кислорода в иммунном ответе риса в режиме реального времени с помощью хемилюминесцентного анализа

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Этот протокол описывает оптимизированный метод хемилюминесценции на основе L-012 для обнаружения продукции АФК в режиме реального времени при обнаружении PAMP в тканях риса. Этот метод прост, стандартизирован и легко воспроизводим в строго контролируемых условиях. Продемонстрирует эту процедуру Он Ин, аспирант из моей лаборатории.Для начала стерилизуйте очищенные семена риса 70% этанолом в течение одной минуты, затем 40% гипохлоритом натрия в течение одного часа. Промойте семена пять раз стерильной водой, чтобы удалить остатки хлора. В методе рисовой оболочки непосредственно поместите семена в стерильный стеклянный сосуд со средой Murashige и Skoog или MS.Чтобы разместить семена методом листового диска, положите их на пластины MS на пять-семь дней, а затем пересадите в матрицу роста или почву. Выращивайте рассаду в комнате для выращивания с 12-часовым светом, 12-часовым темным фотопериодом. Разрежьте оболочку с 10-дневных рассад риса на трехмиллиметровые сегменты острым бритвенным лезвием или хирургическим лезвием для предварительной обработки за день до анализа АФК.Поместите пять сегментов оболочки в отдельную лунку из 96-луночной микротитровальной пластины, содержащей 100 микролитров двойной дистиллированной воды, на 10-12 часов. Срежьте листовые диски с четырех-шестинедельных рисовых растений с помощью биопсийного перфоратора с поршнем. Всегда обрезайте листовые диски от средней трети второго листа основного культиватора, чтобы уменьшить отклонение данных.Затем поместите один листовой диск в отдельную лунку из 96-луночной микротитровальной пластины, содержащей 100 микролитров двойной дистиллированной воды, на 10-12 часов для предварительной обработки. Держите все листовые диски плавающими и обращенными вверх в лунках микротитровальной пластины для предварительной обработки воды, чтобы избежать отклонений, связанных со стороной листа. Приготовьте раствор для выявления, комбинируя 9,4 миллилитра 50 микромолярного Tris Hcl, 400 микролитров раствора L012, 100 микролитров пероксидазы хрена и 100 микролитров Flg22.Добавьте в лунки 200 микролитров раствора. Запустите программное обеспечение и нажмите кнопку экспериментов, чтобы создать новый протокол или использовать существующий протокол. Нажмите «Процедура» во всплывающем окне, чтобы настроить пластину, и выберите скважины из пластины, которые необходимо контролировать.Нажмите кнопку start kinetic и установите время выполнения на 30 минут или больше, в зависимости от экспериментальных требований. Выберите минимальный интервал, чтобы получать показания как можно чаще. А для времени интеграции выберите одну секунду или дольше в зависимости от интенсивности сигнала.Нажмите «Подтвердить», затем «ОК», чтобы подтвердить настройки, затем нажмите «Обнаружить новую пластину» во всплывающем окне и подождите, пока программное обеспечение не предложит диалоговое окно загрузочной пластины. Осторожно удалите двойную дистиллированную воду из лунок, содержащих предварительно обработанные ткани, избегая повреждения тканей или высыхания. Используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 200 микролитров раствора в лунки, содержащие ткани.Поместите тестируемую пластину на носитель и начните обнаружение. Для индуцирования АФК с помощью Flg22 использовались листовые диски и трехмиллиметровые ножны. Генерация АФК контролируется в течение 35 минут.Столбцы обозначают средние значения стандартных отклонений, рассчитанные на основе пяти технических повторов. В рисе увеличение производства АФК было впервые обнаружено через одну-две минуты, достигло пика через 10-12 минут и вернулось к исходному уровню примерно через 30-35 минут. Общее количество АФК рассчитывалось по кривой.Чтобы получить общее количество значений ROS, примените формулу к соответствующим наборам данных, чтобы вычислить ROS, сгенерированные за каждый интервал времени, которые можно объединить, применив сумму формулы для расчета общей сгенерированной суммы. Одно отверстие или две половинки листового диска помещали в лунки 96-луночной микротитровальной пластины, предварительно обработанной 100 микролитрами двойной дистиллированной воды в течение 10-12 часов, а затем обрабатывали Flg22 для индукции АФК. Значения показаний двух образцов половинного диска намного выше, чем у всего листового диска.В среднем, общие значения из двух образцов полудиска почти в 1,6 раза выше, чем для всего листового диска, что пропорционально длине края, а не площади образцов. Этот результат подтверждает, что АФК в основном генерируются в клетках в месте раны. Пытаясь выполнить эту процедуру, работайте с тканями осторожно и не делайте лишних надрезов, которые могут быть источником вариации данных.Этот метод может быть применен к любым другим физиологическим процессам, продуцирующим АФК в тканях растений.

Research

JoVE Journal

Biology

Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila

Proboscis Extension Response PER Assay in Drosophila

Хоботок Расширение отклика (PER) Пробирной у дрозофилы

Proboscis extension response (PER) is a taste behavior assay that has been used in flies as well as in honeybees.
On the surface of the fly's mouth ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Обнаружение, Визуализация и количественного генерации активных форм кислорода в модельной системе Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Улучшенная Северная Клякса обнаружения малых РНК видов в<em&gt; Дрозофилы</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Измерение глутатион-индуцированной кормления ответ в Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Развитие количественной рекомбиназу полимеразной амплификации с внутреннего положительного контроля

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag анализ - Высокая пропускная способность, ПЦР в реальном времени Анализ на Sc2.0 Генотипирование

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Стимуляция ниш стволовых клеток и регенерация тканей в коже мышей с помощью переключаемой протопорфирина IX-зависимой фотогенерации активных форм кислорода in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Мониторинг активации А аврора-киназы в режиме реального времени с использованием конформационных биосенсоров FRET в живых клетках

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...