Name: real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay
Uploaded: 2022-11-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från Shanghai Natural Science Foundation (bidragsnummer: 21ZR1429300 / BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (Agri-X-program, bidragsnummer: AF1500088 / 002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (bidragsnummer: ZXWH2150201 / 001) till Jiangbo, och av Medical-Engineering Collaboration Project of Shanghai Jiao Tong Univesity (bidragsnummer: 21X010301734) till Can Li.

OBS: Protokollet är tillämpligt på olika växtvävnader. Rismantel och bladskivor användes i detta protokoll för ROS-detektion vid PAMP-elicitering. Eftersom skillnader huvudsakligen beror på provtagningsmetoden beskrivs endast de gemensamma förfarandena nedan, och särskilda steg nämns vid behov.
1. Växtodling
<ol><li>Sterilisera de skalade risfröna med 70% etanol i 1 minut, sedan med 40% natriumhypoklorit (NaClO) i 1 timme. Skölj sedan fröna 5x med sterilt vatt...

<ol>
	<li>Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+as+signals+that+modulate+plant+stress+responses+and+programmed+cell+death.">Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.</a> Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).</li><li>Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+are+good.">ROS are good.</a> Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).</li><li>Gilroy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+calcium,+and+electric+signals:+key+mediators+of+rapid+systemic+signaling+in+plants.">ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).</li><li>Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+gene+network+of+plants.">Reactive oxygen gene network of plants.</a> Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).</li><li>Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+burst+of+plant+NADPH+oxidases.">A burst of plant NADPH oxidases.</a> Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).</li><li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses.">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).</li><li>Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+and+redox+signalling+in+the+response+of+plants+to+abiotic+stress.">ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 35 (2), 259-270 (2012).</li><li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+burst+oxidases:+the+engines+of+ROS+signaling.">Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).</li><li>Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+NADPH+oxidase+RBOHD+during+plant+immunity.">Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity.</a> Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).</li><li>Segonzac, C., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+plant+pattern-recognition+receptors+by+bacteria.">Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>Hong, D., Joung, H. -. A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attomolar+detection+of+cytokines+using+a+chemiluminescence+immunoassay+based+on+an+antibody-arrayed+CMOS+image+sensor.">Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).</li><li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+new+sensitive+chemiluminescence+probe,+L-012,+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells.">et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li><li>Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+regulation+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).</li></ol>

Syftet med denna studie var att etablera en mycket effektiv metod för att kvantifiera tidig ROS-produktion som svar på PAMP i risvävnader. Denna metod ger ett standardiserat förfarande för realtidsbestämning av apoplast ROS framställd av behandlade risvävnader. Denna metod är enkel i drift, låg kostnad, tydlig i sammansättning och oberoende av kommersiella kit. Med hjälp av denna metod kan forskare studera realtidsproduktionen av apoplast ROS när växter utsätts för biotiska eller abiotiska påfrestningar....

Reaktiva syreradikaler (ROS) omfattar en serie kemiskt aktiva syrederivat, inklusive superoxidanjonradikaler (O2-) och dess derivat, hydroxylradikaler (OH-), väteperoxid och produkter av singlettsyre eller oxidationsreduktionsreaktioner, som ständigt produceras i plastider och kloroplaster, mitokondrier, peroxisomer och andra subcellulära platser1 . ROS spelar viktiga roller i många biologiska processer och är viktiga för alla växter 2,3,4. Det breda spektrumet av ROS-funktioner varierar från reglering av tillväxt och utveckling till uppfattningen av abiotiska och biotiska påfrestningar 5,6,7,8.
I växtens immunsystem, växtcellplasmamembran-lokaliserade receptorer-så kallade mönsterigenkänningsreceptorer (PRR)-uppfattar patogen-härledda kemikalier-patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs). Detta erkännande utlöser en serie snabba immunsvar, inklusive kalciuminflöde, ROS-burst och MAPK-kaskad; således kallas detta lager av immunitet PAMP-utlöst immunitet (PTI). ROS-burst är ett kännetecken för PTI-svar, vars bestämning tillämpas allmänt på PTI-relaterade studier 9,10. ROS-produktion utlöst av PAMPs tillskrivs plasmamembran-bosatt NADPH-oxidas eller respiratorisk burst oxidas homolog (RBOH) familjeproteiner, som överför elektroner från cytosolisk NADPH eller NADH till extracellulärt syre för att producera superoxid (O2-) som spontant omvandlas till väteperoxid (H2O2) genom superoxiddismutas8 . PAMP-utlöst ROS-burst är ganska snabb, uppträder bara några minuter efter PAMP-behandling och toppar vid ~ 10-12 min. Den stora majoriteten av ROS-molekylerna innefattar väteperoxid (H2O2), som lätt och stadigt kan detekteras med en kemiluminiscensanalys.
Vid kemiluminescens reagerar kemiluminiscensreagenset med aktivt syre, under verkan av en katalysator, för att producera de exciterade tillståndsintermediärerna. Därefter återgår elektronerna i produkten till marktillståndet genom icke-strålningsövergång och avger fotoner. Vanliga kemiluminiscensreagens inkluderar luminol och L-012, med luminol som dominerar applikationen11,12,13. Men fler forskare väljer L-012 för att upptäcka ROS-produktion, eftersom L-012 har en mycket högre ljusemissionseffektivitet under neutrala eller nära neutrala pH-förhållanden jämfört med luminol.
Detta dokument beskriver en optimerad kemiluminiscensmetod, baserad på L-012, för realtidsdetektering av ROS-produktion efter elicitering av PAMPs i ris (Oryza sativa) vävnader-bladskivor och mantel. Metoden som tillhandahålls här är enkel, stabil och standardiserad och är mycket anpassningsbar för att möta olika experimentella behov. De data som erhålls med denna metod är mycket reproducerbara under starkt kontrollerade förhållanden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>WHB</td>
			<td>WHB-96-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Innochem</td>
			<td>A43543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flg22</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>p20973</td>
			<td>PAMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-012</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>120-04891</td>
			<td>8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Medium</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCLO</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>S101636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish (HRP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampler</td>
			<td>Miltex&#160;</td>
			<td>15110-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610195</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time detection of reactive oxygen species production in immune response in rice with a chemiluminescence assay

Reaktiva syreradikaler (ROS) spelar viktiga roller i en mängd olika biologiska processer, inklusive avkänning av abiotiska och biotiska påfrestningar. Vid patogeninfektion eller utmaning med patogenassocierade kemikalier (patogenassocierade molekylära mönster [PAMP]) induceras en rad immunsvar, inklusive en ROS-burst, snabbt i växter, som kallas PAMP-utlöst immunitet (PTI). En ROS-burst är ett kännetecken PTI-svar, som katalyseras av en grupp plasmamembranlokaliserade NADPH-oxidaser - RBOH-familjeproteinerna. Den stora majoriteten av ROS består av väteperoxid (H2O2), som lätt och stadigt kan detekteras med en luminolbaserad kemiluminiscensmetod. Kemiluminescens är en fotonproducerande reaktion i vilken luminol eller dess derivat (såsom L-012) genomgår en redoxreaktion med ROS under verkan av en katalysator. Detta dokument beskriver en optimerad L-012-baserad kemiluminescensmetod för att detektera apoplast ROS-produktion i realtid vid PAMP-elicitering i risvävnader. Metoden är enkel, stadig, standardiserad och mycket reproducerbar under hårt kontrollerade förhållanden.

Här tar vi rismaterial som ett exempel för att bestämma ROS som produceras med flg22-behandling. Genereringen av ROS efter elicitering är övergående. I ris upptäcktes ökningen av ROS-produktionen först på 1-2 minuter, nådde en topp på 10-12 minuter och återvände till baslinjen på ~ 30-35 min (figur 3). Jämfört med kontrolltestet, där PAMP saknades i eliciteringslösningen vilket resulterade i ingen uppenbar ROS-induktion, inducerades en specifik ROS-burst endast när elicit...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay at JoVE.com

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Här beskriver vi en metod för realtidsdetektion av produktion av apoplastiskt reaktivt syre (ROS) i risvävnader i patogenassocierat molekylärt mönsterutlöst immunsvar. Denna metod är enkel, standardiserad och genererar mycket reproducerbara resultat under kontrollerade förhållanden.

Realtidsdetektering av reaktiv syreradikalproduktion i immunsvar i ris med en kemiluminescensanalys

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Detta protokoll beskriver en optimerad L-012-baserad kemiluminiscensmetod för att detektera ROS-produktion i realtid vid PAMP-elicitering i risvävnader. Denna metod är enkel, standardiserad och mycket reproducerbar under hårt kontrollerade förhållanden. Demonstrerar denna procedur kommer att vara On Ying, en doktorand från mitt labb.För att börja, sterilisera de skalade risfrön med 70% etanol i en minut, sedan med 40% natriumhypoklorit i en timme. Skölj fröna fem gånger med sterilt vatten för att avlägsna kvarvarande klor. I rismantelmetoden plattar du fröna direkt i det sterila glaskärlet med Murashige och Skoog eller MS-medium.För att platta fröna i bladskivmetoden, platta dem på MS-plattor i fem till sju dagar och transplantera dem sedan till tillväxtmatrisen eller jorden. Odla plantorna i ett tillväxtrum med en 12 timmars ljus, 12 timmars mörk fotoperiod. Skär manteln från 10 dagar gamla risplantor i tre millimeter segment med ett vasst rakblad eller kirurgiskt blad för förbehandling en dag före ROS-analysen.Placera fem mantelsegment i en enskild brunn på en 96-brunns mikrotiterplatta innehållande 100 mikroliter dubbeldestillerat vatten i 10 till 12 timmar. Skär bladskivorna från fyra till sex veckor gamla risplantor med en biopsistans med en kolv. Klipp alltid bladskivorna från den mellersta tredjedelen av huvudrorkultens andra blad för att minska datavariationen.Placera sedan en bladskiva i en individuell brunn på en 96-brunns mikrotiterplatta innehållande 100 mikroliter dubbeldestillerat vatten i 10 till 12 timmar för förbehandling. Håll alla bladskivor flytande och vända uppåt i brunnarna på en mikrotiterplatta för förbehandling av vatten för att undvika variation på bladsidan. Förbered eliciteringslösningen genom att kombinera 9,4 ml 50 mikromolar Tris Hcl, 400 mikroliter L012-lösning, 100 mikroliter pepparrotperoxidas och 100 mikroliter Flg22.Tillsätt 200 mikroliter eliciteringslösning till brunnarna. Starta programvaran och klicka på experimentknappen för att skapa ett nytt protokoll eller använda ett befintligt protokoll. Klicka på proceduren i popup-fönstret för att ställa in plattan och välj brunnarna från plattan som ska övervakas.Klicka på startkinetik och ställ in körningstiden på 30 minuter eller längre, beroende på experimentkraven. Välj minsta intervall för att få avläsningarna så ofta som möjligt. Och för integrationstid, välj en sekund eller längre beroende på signalintensiteten.Klicka på validera, följt av Okej för att bekräfta inställningarna, klicka sedan på upptäcka den nya plattan i popup-fönstret och vänta tills programvaran uppmanar dialogrutan för lastplattan. Ta försiktigt bort det dubbeldestillerade vattnet från brunnarna som innehåller de förbehandlade vävnaderna och undvik vävnadsskada eller uttorkning. Använd en flerkanalig pipett för att tillsätta 200 mikroliter av eliciteringslösningen till brunnarna som innehåller vävnaderna.Placera plattan som ska testas på bäraren och börja detektera. För att inducera ROS av Flg22 användes bladskivor och tre millimeter långa mantlar. ROS-generering övervakas i 35 minuter.Staplarna anger medelvärdet för standardavvikelser beräknade från fem tekniska upprepningar. I ris upptäcktes ökningen av ROS-produktionen först på en till två minuter, nådde en topp på 10 till 12 minuter och återvände till baslinjen på cirka 30 till 35 minuter. Den totala mängden ROS beräknades från kurvan.Om du vill hämta den totala mängden ROS-värden använder du formeln på motsvarande datauppsättningar för att beräkna ROS som genereras vid varje tidsintervall, vilket kan kombineras genom att använda formelsumman för att beräkna det totala genererade beloppet. Ett enda hål eller två halvor av en bladskiva placerades i brunnarna på en 96-brunns mikrotiterplatta förbehandlad med 100 mikroliter dubbeldestillerat vatten i 10 till 12 timmar och behandlades sedan med Flg22 för ROS-induktion. Läsvärdena från de två halvskivproverna är mycket högre än från hela bladskivan.I genomsnitt är de totala värdena från de två halva skivproverna nästan 1,6 gånger de från hela bladskivan, vilket är proportionellt mot kantlängden, inte mot provernas yta. Detta resultat stöder att ROS huvudsakligen genereras i celler på sårstället. När du försöker med denna procedur, arbeta försiktigt med vävnader och gör inte extra utskärningar som kan vara en källa till en datavariation.Denna metod kan tillämpas på alla andra ROS-producerande fysiologiska processer i växtvävnader.

Research

JoVE Journal

Biology

Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila

Proboscis Extension Response PER Assay in Drosophila

SNABEL Förlängning Response (PER) analys i Drosophila

Proboscis extension response (PER) is a taste behavior assay that has been used in flies as well as in honeybees.
On the surface of the fly's mouth ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Att upptäcka, Visualisering och kvantifiering Generation av reaktiva syreradikaler i en Amoeba modellsystem

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Förbättrad Northern blot detektering av små RNA arter i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Mätning Glutation-inducerad Foder Response i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Utveckling av en kvantitativ Recombinase polymeras amplifieringsanalysen med en intern positiv kontroll

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analys - En hög genomströmning, Realtid PCR-analys för Sc2.0 Genotypning

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Stimulering av stamcellsnischer och vävnadsregenerering i mushud genom omkopplingsbar protoporfyrin IX-beroende fotogenerering av reaktiva syreradikaler in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Realtidsövervakning av aurorakinas en aktivering med konformationella FRET-biosensorer i levande celler

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...