Name: agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of narrowleaf plantain
Uploaded: 2023-03-17T12:40:00
Duration: 7 min 50 s
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这项工作得到了美国国家科学基金会（EDGE IOS-1923557 to C.Z.和Y.Z.）的支持。

注意：步骤1.4-1.8，2.3-2.5，3.3-3.6，4.1-4.6，5.1-5.7和6.1-6.3必须在无菌条件下进行，使用干净的罩以防止污染。
1. 植物材料繁殖转化
<ol><li>根据所需植物的数量，将市售野生型（WT）车 前草 种子（见 材料表）放入50 mL离心管中，直至5 mL线。 注意：或者，当需要少量种子时，可以使用2 mL微量离心管，但应将其填充至不超过0.1 mL的体积，因为种子过多会降低灭菌效率。</li>
	<li>将种子浸泡在75%乙醇中60秒。</li>
	<li>丢弃乙醇，然后将种子浸入20%次氯酸钠（20%NaClO，80%无菌水）中40分钟，轻轻倒置管，使所有种子与溶液接触。 注意：次氯酸钠溶液必须新鲜制作以获得最佳效果。</li>
	<li>在层流罩下，弃去次氯酸钠溶液，然后用蒸馏水（五次）洗涤种子。最后一次冲洗后，在种子中加入少量水，因为这有助于植物移动到盘子上。</li>
	<li>使用灭菌的镊子，将种子转移到带有固体MS培养基的预先制备的95 mm x 100 mm培养皿上（表1）。将种子均匀地散布在板的表面上，每个种子之间约1厘米，以防止发芽的幼苗过度拥挤（图1A）。</li>
	<li>用两层石蜡膜密封板以防止污染，然后在室温（22°C，50μmolm-2 s-1，12小时天）下在冷白色生长灯（见材料表）下孵育。种子通常在5-6天内发芽。</li>
	<li>当幼苗发芽并且足够大以转移时（图1B），通常在发芽后2或3天，使用灭菌的镊子将幼苗转移到装有50-100mLMS培养基的无菌盒中（表1）。理想情况下，每箱只种植五棵幼苗，以获得最优质的根。</li>
	<li>用手术胶带密封盒子，然后让植物在冷白色生长灯下生长（见 材料表），条件与步骤1.6中提到的相同。植物应该在大约 3-4 周内准备好转化，或者当主根长约 2 厘米长并且侧根呈白色时。 注意：培养基制备配方和维生素储备包含在表 1 和 表2中。</li>
</ol>2. 质粒构建与 大肠杆菌 转化
注意：确切的质粒构建程序因目的基因而异。在此过程中，使用标准克隆程序20，使用限制性内切酶HindIII和SalII将1.5kb AtPP2启动子插入带有GUS的二元质粒pBI101（参见材料表）中。AtPP2（韧皮部蛋白2）是一种在韧皮部21中特异性表达的基因。
<ol><li>使用来自 拟南芥的引物对5'-AGTCAAGCTTCAAGTCCCTGTGGCTACTGAAC-3'（向前）和5'-AGTCGTCGACAAACCAGTATGATGTATTTTTTTG-3'（反向）克隆启动子。 图2 显示了带有 AtPP2：GUS 插入片段的二元质粒载体图。</li>
	<li>质粒构建后，使用热休克方法22将质粒转化为DH5a大肠杆菌（参见材料表）感受态细胞，然后在37°C振荡（150rpm）孵育1.5小时。</li>
	<li>取150μL每种转化培养物，以适当的选择（50mg / L卡那霉素用于本协议中使用的菌株;参见材料表）板到LB琼脂培养基平板（表1）上，然后将平板在37°C孵育16-24小时。 注意：本研究中使用的细菌菌株是 A. tumefaciens GV3101。</li>
	<li>接下来，使用菌落PCR筛选菌落中的阳性重组体23。 注意：在该协议中，以下引物用于扩增目标基因;5'-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3'（向前）和5'-TCATTGTTTGCCTCTCTCGCTGC-3'（反向）。<ol><li>在热循环仪（参见 材料表）中以95°C下3分钟的循环条件运行反应，然后进行35个循环：95°C下30秒，55°C下30秒，72°C下2分钟，最后10分钟伸长步骤在72°C。</li>
		<li>用适当的抗生素（50mg / L卡那霉素）接种6mLLB肉汤（表1）中的阳性菌落，并在37°C下以200-250rpm生长过夜。</li>
	</ol></li>
	<li>过夜生长后，使用标准程序从细菌中提取质粒24。</li>
</ol>3. 根癌杆菌 质粒转化
<ol><li>质粒提取后，使用电穿孔将修饰的质粒转化为所需的感受态细胞菌株。在此过程中，使用 根癌农 杆菌菌株GV3101。遵循电穿孔技术的标准化方法25.</li>
	<li>电穿孔后，将感受态细胞重悬于1mLLB肉汤中，然后在28°C以100rpm孵育2-4小时。</li>
	<li>通过在室温（22°C）下在台式微量离心机（参见材料表）中以6，800×g离心3分钟收集细胞，然后将50-100μL散布到具有适当选择剂的LB琼脂平板上（本协议中使用的质粒为50mg / L卡那霉素）。</li>
	<li>细胞在28°C孵育2天后，通过使用集落PCR鉴定含有目的基因的阳性菌落。在此协议中，使用步骤2.4中提到的引物和条件。</li>
	<li>接下来，使用阳性菌落用LB琼脂培养基+选择划线储备板。该板可在4°C下储存长达1个月。</li>
	<li>或者，对于长期储存，用少量LB接种阳性菌落，并进行适当的选择。将接种的培养物在28°C以200rpm振荡过夜，然后制备甘油储备液（50%w / v甘油在细菌和甘油的50：50混合物中），可在-80°C下储存长达10年。</li>
</ol>4. 根癌A. 准备
<ol><li>使用适当的选择剂将含有所需质粒的根 癌农杆菌 划线到制备的95 mm x 100 mm实心LB板上。在该协议中，使用带有质粒插入片段 AtPP2：GUS 的细菌菌株GV3101，并添加50mg / L卡那霉素进行选择。</li>
	<li>用石蜡膜密封板，然后在28°C下孵育长达48小时，或直到细菌长到足够大以进行采摘。</li>
	<li>在转化前 2 天使用移液器吸头挑选细菌菌落，并将其接种在含有 6 mL 液体 LB 的 15 mL 圆底管中，并进行适当的选择。在28°C台式摇床中以200rpm摇晃过夜，直到OD600 达到0.6-0.7。 注意：板和6 mL细菌接种物可以在4°C下储存长达1个月。</li>
	<li>当细菌达到正确的OD600时，使用移液管将 根癌曲霉 转移到含有100mL液体LB的无菌烧瓶中，并带有选择剂。通常，每 100 mL LB 含有 200 μL 细菌适合繁殖。在28°C下以200rpm摇匀过夜，直到OD600 达到0.6-0.7。</li>
	<li>将细菌转移到50mL无菌离心管中，并在室温（22°C）下在台式离心机中以2， 200xg 离心10分钟以收集细菌。</li>
	<li>使用移液管弃去上清液。通过移液将细菌沉淀重悬于5 mL室温（22°C）液体悬浮溶液（SS）（表1）中，然后加入至50 mL SS并倒置数次混合。细菌现在已经准备好转化了。 注意：液体SS必须在转化后1周内新鲜制备。 注意：所有与 根癌曲霉 接触的材料都需要丢弃在生物危害废物箱中。细菌培养物中剩余的液体可以用浓度为20%或更高的次氯酸钠（漂白剂）灭菌。</li>
</ol>5. 车前子 根的转化
<ol><li>当植物达到理想的转化阶段（幼苗3周龄）（图1C）时，使用无菌镊子和剪刀将根与植物的其余部分分开（图3A）。丢弃叶子和茎材料。</li>
	<li>切割后，立即使用无菌镊子将根片转移到装有无菌水的无菌盒中。此步骤允许根部在收集所有组织时保持水分。</li>
	<li>当所有根都被切断时，将 根癌农杆菌/ SS悬浮液倒入无菌的150 mm x 15 mm一次性培养皿中。将根转移到 根癌农 杆菌培养物中并接种至少20分钟（图3B）。</li>
	<li>在孵育过程中，使用带有锋利刀片的无菌手术刀将根切成1厘米的碎片，将主根与侧根分开。在根部表面做薄而浅的切口，让细菌感染植物。 注意：如果处理大量植物，请将根部分批转移到细菌培养物中，以确保在接种过程中所有根部都浸入其中。</li>
	<li>孵育后，使用无菌镊子将根片转移到无菌纸巾上以去除多余的细菌。避免干燥根部超过60秒，因为这会导致脱水并损坏根组织。理想情况下，可以同时干燥10-15个根（图3C）。</li>
	<li>将干燥的根转移到具有固体共培养基的制备的95mm x 15mm培养皿中（表1），每个板约10-20根，具体取决于根的大小（图3D）。</li>
	<li>用两层透明塑料薄膜密封板，然后用铝箔覆盖。在室温（22°C）下孵育3天。此步骤为细菌在没有抗生素选择的情况下感染根部提供了时间（图3E）。</li>
</ol>6. 选择和全株再生
<ol><li>在共培养基中孵育后，将根块转移到制备的95 mm x 15 mm培养皿中，培养皿中含有固体芽诱导培养基（SIM）（表1）和Timentin（500mg / L;参见 材料表）和适当的抗生素选择。在该方案中，我们使用卡那霉素（100mg / L）。 注意：根部的底部必须与介质完全接触。不接触培养基表面的根太长，必须切割以防止组织逃脱选择。</li>
	<li>用两层透明塑料薄膜密封板，然后在生长灯下生长1个月（有关适当的条件，请参见步骤1.6），或直到芽开始出现。 注意：通常，在生长2周后可以观察到芽首字母，并且通常在1个月后可以看到芽。</li>
	<li>当小苗长1.5-2.0厘米时（图1D），将它们转移到带有固体根诱导培养基的准备好的无菌盒中（表1）。</li>
	<li>在生长灯下种植植物（条件见步骤1.6）数周，直到根形成。根通常可以在 1 周后首次看到。 注意：建议在移动到土壤之前让根部生长数周，因为根系较大的植物在土壤中的存活率往往更高。</li>
</ol>7. 土壤转移
<ol><li>当根系变得足够大以转移时（图1E），通常在生长1个月后，将植物转移到含有预润湿通用土壤（BM7）的3.5个方形花盆中。在该协议中，使用了BM7树皮混合物（见 材料表）。<ol><li>用水轻轻清洗，去除任何粘在根部的介质。 注意：植物可以在800至1400μmol光子m-2 s-2的温室中使用600W高钠压力灯（见材料表）在温室中生长至成熟，或在室温（22°C）的生长室中以50μmol m-2 s-1的冷白光生长至成熟，12小时天。</li>
	</ol></li>
	<li>用塑料盆盖盖住植物，然后用透明塑料袋盖住它们。这一步允许植物在适应土壤时保持在潮湿的环境中。</li>
	<li>大约3-5天后，取下塑料袋，然后慢慢取下盖子，以适应外部环境。 注意：根据一年中的时间和植物转移到的环境，植物需要适应的时间可能会有所不同。建议每天检查植物，并根据需要向花盆加水。</li>
	<li>定期给植物浇水，并根据需要添加肥料。植物也可以转移到更大的花盆中以进一步生长（图1F）。</li>
</ol>8. β-葡糖醛酸酶（GUS）组织化学染色
<ol><li>根据已发布的方案制备β-葡糖醛酸酶（GUS）染色溶液15。</li>
	<li>当芽首字母长约 0.5-1 厘米时，取出完全展开的年轻叶子的一个小尖端（<5 毫米长度通常就足够了），并立即转移到 1.5 或 2 mL 微量离心管中的 0.5-1 mL GUS 染色溶液中。溶液应完全覆盖植物组织。</li>
	<li>将打开的管放入真空干燥器中，并以20-25kPa真空5-10分钟。在真空过程中，溶液中应可见小气泡。这允许溶液进入植物的细胞。</li>
	<li>让空气过滤回真空干燥器。关闭试管并在37°C孵育过夜（12小时），或直到蓝色可见。 注意：在这项研究中，GUS活性局限于韧皮部，这意味着在积极转化的植物中，蓝色染色应该只在韧皮部组织中可见。没有转基因的植物不会经历染色（图4）。</li>
	<li>为了更好地观察污渍，将植物转移到100%乙醇中以去除叶绿素。为了提高叶绿素去除过程的效率，将管在60°C孵育10分钟。 注意：在去除所有叶绿素之前，可能需要多次更换乙醇，具体取决于被染色的叶子的大小。</li>
</ol>

<ol>
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作者没有什么可透露的。

车 前草 属植物缺乏转化方案限制了这些植物作为模型的使用，特别是当研究人员对探索基因功能感兴趣时。 选择P. lanceolata 来开发遗传转化方案，因为它是其属16中最常研究的植物。已经开发的协议可能会被用作进一步推进与血管生物学，生态学，植物 - 昆虫相互作用和非生物应激生理学相关的研究的工具。
所提出的协议清楚地概述了允许用户获得转基因植物的步骤。除了 披针叶松 在组织培养环境中茁壮成长的能力外，多种因素也促成了我们转化方法的成功。首先，观察到使用高质量、无菌的植物根组织进行转化的重要性。当根系取自3-4周龄的植物时，它们的转化率最高，呈绿色或淡白色。从具有任何细菌或真菌污染的盒子中取出的根通常会导致受污染的芽培养物，而呈现棕色的旧根不会导致成功转化。根组织是使用当前方法转化最有效的组织类型，因为叶和叶柄组织在发育芽方面不成功。
另一个重要的观察结果是，收集根组织进行转化的最佳方法是将新鲜切割的根材料放入无菌水中。这一步有效地允许根材料在收集组织的其余部分时保持水分，因为根在从其生长容器中取出时往往会迅速变干。这一步还有助于提高转化的成功率，因为它允许一次在细菌中孵化更多的根。
可以通过将根组织在共培养基中孵育的时间减少到2天来修改该方案。据观察，2或3天的潜伏期足以允许导致芽首字母的感染。然而，不建议更长的孵育时间，因为观察到培养基中缺乏抗生素抑制剂通常会导致 根癌曲霉 过度生长，从而杀死新出现的组织。
本研究的局限性是缺乏关于其他方法或种类的根癌杆菌在杉木转化中的表现的可用数据，以便进行比较。据我们所知，该协议是新颖的。在最初的试验中，注意到根癌农杆菌GV3101具有很高的转化效率，我们专注于使用该菌株改进该技术，而不是试验其他菌株。我们20%的转化效率对于工厂改造来说是相对较高的 - 许多传统方法认为任何>1%都是成功的26，27，28。然而，使用另一种根癌曲霉菌株，如根瘤菌，以其用于多个物种的根系转化而闻名29，30，31，可能会导致更高的成功率。需要进一步的实验来评估使用其他菌株促进柳叶松转化效率提高的影响。
披针叶松的成功转化可能会使许多研究领域受益。植物在组织培养基中的高转化效率和快速生长使披针叶松成为基因功能研究的可行候选者15。

使用模式物种研究植物生物学多个方面的概念随着拟南芥1的广泛使用而出现。最初选择拟南芥是因为它与许多其他开花植物具有共同特征，并且具有多种特征，便于在实验室环境中研究，例如体积小且生成周期短。以它为主题发表的大量研究论文，以及其小基因组大小和易于遗传转化2，使其能够作为一种广泛使用的实验生物体持续存在。然而，拟南芥作为具有不同特征或独特性状的物种的模型可能受到限制3.这促使了新的模型系统的发展，例如玉米（Zea mays）和番茄（Solanum lycopersicum），它是进化研究，水果发育和生产的重要模型，并且是蔬菜作物5的良好代表。遗传转化方法是植物物种作为模式生物的先决条件2. 根癌农杆菌介导的转化是植物生物学中的可靠工具;它已被用于转化一些模式物种和主要作物，包括烟草（烟草）6，水稻（水稻）7，棉花（棉）8，大豆（甘氨酸max）9，马铃薯（Solanum tuberosum）10和油菜（芸苔油菜）11。 植物物种对根癌曲霉感染的反应成功程度差异很大，转化方案通常需要针对每个物种单独定制6，12。
车前子属共有256种植物，广泛分布于全世界13种。该属的物种通常具有独特的特征，使它们成为研究遗传学，生态学，压力生理学，次生代谢物，药物化学，植物 - 微生物相互作用，植物发育和进化的理想模型物种。车前草，也称为窄叶或苔藓车前草，自 19世纪以来一直是一种受欢迎的植物，当时它首次用于描述雄性不育现象14。像其属的其他植物一样，它已被用于各种研究领域的研究。最近，它被提议作为血管生物学的模型，因为它的血管组织可以很容易地收集15。P. lanceolata是车前草属中最常研究的物种;根据 2022 年 12 月 9 日进行的 PubMed 搜索，2021 年的一篇文章报告说，当时>有 1，400 份出版物包括或与该物种有关16 篇，自 2022 年初以来又发表了 102 篇文章。该属中研究量第二大的植物P. major在同一天使用相同的标准进行搜索时，只有414篇文章的主题。
尽管对 披针叶松的研究感兴趣，但研究，特别是关于基因功能表征的研究，往往受到缺乏该物种遗传操作工具包的限制。Pommerrienig等人努力使用花卉浸渍技术开发P . major 的转化方案17。然而，该方法不能应用于 披针叶松 ，因为该物种的雄性不育特性18，19。据我们所知，没有现有的方案可以转化 披针叶松。
本研究提出了根 癌杆菌介导的 披针叶松转化的简单方案。通过靶向根组织，可以在转化后3个月内产生完全生长的转基因植物。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom TubeA4A2:A34</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Naphthylacetic acid</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>N-780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Micropore Surgical Paper Tape</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>19-027761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>163227LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 Watt High Pressure Sodium Lights</td>
			<td>Plantmax</td>
			<td>PX-LU600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (6-BAP)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>B-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary Plasmid pBI101</td>
			<td>Clontech, USA&#160;</td>
			<td>632522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool White Grow Light Sylvania LLC</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>315952205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-biotin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP232-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5a E. coli&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA&#160;</td>
			<td>18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes, Sterile 150 x 16 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes, Sterile 95 x 15 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>38DI12044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2519-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>38DI18031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelrite</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>G35020-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>241261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Tabletop Orbital Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>SHKE420HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indole-3-Acetic Acid (IAA)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indole-3-Butyric Acid (IBA)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>K-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrocentrifuge&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75007210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta Boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50255176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipet Tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipet Tips 200 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipette Tips 10 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor 0.5-10 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor 20-200 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor 2-20 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skooge Basal Medium with Vitamins</td>
			<td>PhytoTech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skooge Basal Salt Mixture</td>
			<td>PhytoTech</td>
			<td>M524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-Inositol</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0761-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (paraffin film)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>P44000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6280-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Handle</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>38DI36419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3802181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, Crystal (NaCl)</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>S24000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>23263068401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil- Bark Mix</td>
			<td>Berger, USA</td>
			<td>BM7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Pots (3.5 inches squared)</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-TRK-1835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>S24060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4625-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin Ticarcillin/Clavulanate (15/1) (Timentin)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>T-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-Zeatin Riboside (ZR)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>Z-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild Type Plantago lanceolata seeds</td>
			<td>Outsidepride Seed Source, OR, USA</td>
			<td>F1296</td>
			<td>Outsidepride.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Granulated</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>Y20025-1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of narrowleaf plantain

车前子属的物种有几个独特的特征，导致它们被改编为各个研究领域的模式植物。然而，缺乏遗传操作系统阻碍了对基因功能的深入研究，限制了该属作为模型的多功能性。在这里，提出了车前草的转化协议，车前草是最常见的研究车前草物种。 使用根癌农杆菌介导的转化，将无菌生长的杉木植株的3周龄根部感染细菌，孵育2-3天，然后转移到具有适当抗生素选择的芽诱导培养基中。枝条通常在1个月后从培养基中出来，根在芽转移到根诱导培养基后1-4周发育。然后将植物适应土壤环境，并使用β-葡糖醛酸酶（GUS）报告基因测定法测试转基因的存在。目前方法的转化效率为~20%，每转化10个根组织就有2株转基因植物出现。建立窄叶车前草的转化协议将有助于该植物作为各个领域的新模式物种的采用。

这里报告了使用根癌农杆菌介导的转化获得转基因柳叶松植物的简单方案。报告基因GUS（编码β-葡萄糖醛酸酶）在韧皮部表达的AtPP2启动子的驱动下，通过根癌曲霉菌株GV3101转化为3周龄的披针叶松根（图2）。之所以选择韧皮部特异性启动子，是因为我们的主要兴趣是建立一个植物维管组织（特别是韧皮部）的功能基因组学系统。在初步实验中，该方法在根，叶和叶柄组织上进行了测试。尽管可以在所有组织类型中诱导愈伤组织，但在SIM中1个月后，只有根组织产生首字母（图5A）;叶子和叶柄变成棕色并死亡（图5B）。由此得出的结论是，根组织是用于转化方法的最佳组织类型。将根在悬浮溶液（SS）（表1）中重悬的制备细菌中孵育至少20分钟，然后在室温下在固体SS板上在黑暗中孵育长达3天（图3E）。然后将根转移到芽诱导介质（SIM）中，并在协议中指示的条件下（步骤1.6）保持在生长灯下。图1和图3显示了协议每个步骤的代表性图像以供参考。
图6显示了从转化组织中出现的芽首字母的进展，从根放在SIM上的第一天（图6A）到芽准备生根（图6D）。1周后，根组织形成愈伤组织（图6B），并且可以观察到芽首字母的开始（图6B1）。芽在第2周和第3周继续出现（图6C），4周后，芽准备转移到根诱导培养基（图6D）。
使用β-葡萄糖醛酸酶（GUS）组织化学测定法对假定的转基因植物进行鉴定，使用枝条长约0.5厘米后采集的叶段。阳性转基因植物在韧皮部局部组织中显示出预期的染色模式，如图 4所示。将GUS染色的阳性枝条转移到根诱导培养基中，其中它们在4周后发展出强大的生根系统（图1E）。然后将有根的植物转移到土壤中。 图4 显示了用AtPP2启动子和β-葡糖醛酸酶（GUS）基因转化的窄叶车前草染色的结果，以及用 AtPP2 启动子转化的野生型和窄叶车前草，以进行比较。 所有出现的枝条都被证实是转基因的。转化效率平均为20%，每转化10根根约发2个芽。将确认的转基因植物转移到较大的盆中并生长4-8周，直到它们达到成虫阶段（图1F）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig01.jpg"> 图1： 车前草 转化时间线。 协议每个阶段的代表性图像。（A）未发芽的种子接种在MS板上。（B）种子在1周后发芽，准备转移到洋红色盒子中。（C）生长3周后MS盒中的植物。根是绿色和健康的，处于理想的转化阶段。（D）4周后在芽诱导介质中的芽准备转移到生根培养基中。在此阶段，如果适用，可以进行β-葡糖醛酸酶 （GUS） 组织化学染色。（E）植物装在带有根诱导培养基的盒子中，根在生长4周后形成。（F）转基因植物在土壤中生长4周后生长至全长。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig02.jpg"> 图 2：插入韧皮部特异性启动子 AtPP2 的二元载体质粒 pBI101 + β-葡萄糖醛酸酶 （GUS） 示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig03.jpg"> 图 3：转换步骤。 每个转换步骤的代表性图像。（A）转化过程中将根与芽分离。（B）将根浸泡在细菌/SS悬浮液中。（C）在纸巾上擦干根部以去除多余的细菌。（D）根铺在共培养基上。（E） 用铝箔包裹的不锈钢板。将植物孵育2-3天，然后转移到射击介质中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig04.jpg"> 图 4：GUS 染色。 窄叶车前草叶段的β-葡糖醛酸酶 （GUS） 染色结果。（A）野生型。（B）用含有AtPP2启动子的质粒（空载体）转化的窄叶车前草。（C）用含有AtPP2启动子和β-葡糖醛酸酶（GUS）基因的质粒转化的窄叶车前草。使用GUS组织化学染色方案对每片叶子进行染色，然后用显微相机成像。图像（B）和（C）由于缺乏GUS基因而没有显示染色模式。右图显示了静脉中清晰的蓝色染色图案，确认这些植物是转基因的。条代表1毫米，每个叶段长约1厘米。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig05.jpg"> 图5：在注射培养基上孵育>1个月后不同组织类型的转化效率比较 。 （A）生长超过1个月的根组织。根部经历了扩大的愈伤组织，并且出现了芽首字母。未转化的愈伤组织已开始因抗生素选择而死亡。（B）生长超过1个月的叶和叶柄组织。组织经历了一些愈伤组织扩张，但很快就因抗生素而死亡。两个组织均未出枝。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig06.jpg"> 图6：转化组织上愈伤组织和芽的出现。 不同孵育长度后放置在拍摄培养基上的组织的代表性图像。（A）刚铺在拍摄介质上的根组织。（B）在注射培养基上1周后的根组织。可以观察到愈伤组织扩张，并且（B1）第一个芽首字母已经开始出现。（C）在拍摄介质上3周后的根组织。出现了更多的拍摄首字母。（C1）从B1拍摄开始的拍摄。（D）孵育4周后的根组织。未转化的组织已开始变成黑色/棕色并死亡，并且新芽继续生长。在这个阶段，芽准备移动到生根培养基。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
表 1：培养基制备配方。 描述如何准备转化介质。添加的维生素量是根据指示的储备溶液浓度计算的。维生素储备溶液的制备见 表2 。对于所有培养基，将试剂加入 900 mL 双蒸 H 2 O 中，pH值至指定水平，然后加水至最终体积为 1，000 mL。* = 灭菌后添加。** = pH 值，1 M KOH。= 含 1 M 氢氧化钠的 pH 值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777_Table%201_Media%20Preparation%20Recipes.xlsx" target="_blank">请按此下载此表格。</a>
表2： 车前子 培养基的维生素储备。 所有维生素在储存前必须经过过滤灭菌并准确贴标。如有指示，首先将粉末溶解在1N NaOH中，然后用双蒸H2O补充所需 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777_Table%202_Vitamin%20Stocks%20for%20Plantago%20Mediums.xlsx" target="_blank">体积。</a>

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Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

由于其作为模型物种在各个研究领域的多功能应用，因此需要窄叶车前草（车前草）的遗传转化工具包。 在这里，使用 根癌农杆菌介导的转化，提出了一种方案，该方案可产生转化效率为20%的稳定转基因系。

根癌农杆菌介导的窄叶车前草遗传转化

Species in the genus Plantago have several unique traits that have led to them being adapted as model plants in various fields of study. However, the lack ...

车前子物种可作为植物维管生物学和胁迫生理学的模式植物。转化方案的建立使得对这些植物的深入研究能够探索基因与其相关表型之间的关系。该技术的主要优点是它使用食物作为外植体，以高效率转化窄叶车前草。首先，将市售的野生型车前草种子放入50毫升离心管中，最高可达5毫升标记，具体取决于所需的植物数量。将种子浸泡在75%乙醇中60秒。丢弃乙醇后，轻轻倒置试管，将种子浸入新鲜制备的20%次氯酸钠中40分钟。在层压流动罩下，丢弃次氯酸钠溶液，然后用蒸馏水洗涤种子五次。最后一次冲洗后，在种子中加入少量水，因为这有助于植物移动到盘子上。使用无菌镊子，将种子均匀地散布在板表面，每个种子之间约1厘米，将种子转移到带有固体MS培养基的预先准备好的培养皿上，以防止发芽幼苗过度拥挤。用两层石蜡膜密封板以防止污染，并在室温下在冷白色生长灯下孵育。一旦幼苗发芽并且足够大，通常在发芽两到三天后，使用无菌镊子将幼苗转移到装有 50 至 100 毫升 MS 培养基的无菌盒中。用手术胶带密封盒子，让植物在凉爽的白色生长灯下生长约三到四周。将含有所需质粒的根癌农杆菌划线到具有适当选择剂的制备的固体LB板上。将石蜡密封板在 28 摄氏度下孵育长达 48 小时，或直到细菌长到足以采摘。孵育后，在转化前两天使用移液器吸头挑选细菌菌落，并将其接种在含有6毫升液体LB的15毫升圆底管中，并带有适当的选择剂。在 28 摄氏度的台式摇床中以 200 RPM 摇晃过夜，直到 OD 600 达到 0.6 至 0.7。一旦细菌达到所需的OD，将200微升细菌培养物转移到含有100毫升LB的无菌烧瓶中。在 200 摄氏度下以 28 rpm 摇匀过夜。然后将细菌培养物转移到50毫升无菌离心管中，并在室温下以2， 200G离心10分钟以收集细菌。弃去上清液，并通过移液在室温下将细菌沉淀重悬于5毫升新鲜制备的悬浮溶液或SS中。然后加入更多的SS至50毫升标记，并倒置以混合几次。一旦植物达到理想的转化阶段，在大约三周内，使用无菌镊子和剪刀将根与植物分离并丢弃叶子和茎材料。切割后，立即使用镊子将根片无菌转移到装有无菌水的盒子中，以保持水分。接下来，将SS悬浮的根癌农杆菌细菌培养物倒入无菌的150 x 15毫米一次性培养皿中。将切好的根转移到细菌培养物中并孵育至少20分钟。在孵育过程中，使用带有锋利刀片的无菌手术刀将根切成一厘米的碎片，将主根与侧根分开。然后在根部表面做薄的浅切口，让细菌感染植物。孵育后，将根片转移到无菌纸巾上以去除多余的细菌。然后将干燥的根转移到准备好的培养皿中，该培养皿含有固体共培养基，每个板约10至20根，具体取决于根的大小。用两层透明塑料薄膜密封板，然后用铝箔在室温下孵育三天。孵育三天后。在共培养基中，将根块转移到准备好的培养皿中，用固体芽诱导培养基或SIM卡（每升500毫克temetin）和适当的抗生素选择。将透明塑料薄膜密封板在生长灯下孵育一个月或直到芽开始出现。一旦小苗长到1.5至2.0厘米长。将它们转移到准备好的无菌盒中。使用实根感应介质。在生长灯下种植植物数周，直到根形成。通常，一周后，当根系变得足够大以转移时，通常在生长一个月后，将植物带上并用水轻轻清洗根部，以去除粘附在根部的任何介质。然后将植物转移到装有预润湿通用土壤BM seven的3.5英寸方形花盆中，用塑料盆盖覆盖植物，然后用透明塑料袋覆盖植物，以确保植物保持在潮湿的环境中。该方法在根叶和小旧组织上进行了测试。在初步实验中，虽然在所有组织类型中都可以诱导老茧，但只有根组织在SIM中一个月后产生芽首字母，叶子和踏板变成棕色并死亡。从第一天开始观察从转化组织中出现的芽首字母的进展。根部放在SIM卡上，当芽准备生根时。一周后，根组织在芽首字母开始时形成老茧。芽在第二周和第三周继续出现，四周后，芽准备转移到根诱导培养基中。使用β-葡糖醛酸酶GUS组织化学测定法对惩罚性转基因植物进行鉴定，使用枝条长约0.5厘米后采集的叶段。具有空载体的变换中的野生类型没有染色模式。由于缺乏GUS基因，与β-葡糖醛酸酶GUS基因的转化在静脉中显示出清晰的蓝色染色模式，确认植物是转基因的根应始终保持水分，以防止在过程中干燥，一次转移大约10根根以防止这种情况。

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

文化早期鸡胚体外（新文化）的方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

科研

生物学

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

双整装原位杂交技术在早期鸡胚

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

农杆菌介导的病毒诱导的基因沉默含量在棉花

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

优化和利用<em&gt;农杆菌</em&gt;介导的瞬态蛋白生产中<em&gt;烟草</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA电穿孔，肌纤维的分离和成像

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

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使用形态基因的农业细菌 -顽固玉米近亲繁殖系的介导未成熟胚胎转化

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

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准备和注射 Culex 蚊子的胚胎，使用CRISPR/Cas9产生空突变

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

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农业细菌-中生菌遗传转化、转基因生产及其在水稻雄性生殖发育研究中的应用

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

One-Step Hairy Root Transformation Method for Advancing Root-Related Biology

An Efficient and Reproducible Method for Producing Composite Plants by Agrobacterium rhizogenes-Based Hairy Root Transformation

Streamlining Composite Plant Production via Agrobacterium rhizogenes-Mediated Hairy Root Transformation (Video) | JoVE

一种基于根 茎农杆菌毛根转化生产复合植物的高效且可重复的方法

Producing composite plants with transgenic roots and nontransgenic stems and buds using Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation is a ...