Name: agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of narrowleaf plantain
Uploaded: 2023-03-17T12:40:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (EDGE IOS-1923557 ל- C.Z. ו- Y.Z).

<ol>
	<li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> The Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Bragg, J. N., Anderton, A., Nieu, R., Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brachypodium+distachyon.">Brachypodium distachyon.</a> Agrobacterium Protocols. , 17-33 (2015).</li><li>Chang, C., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+guide+to+plant+model+systems.">Field guide to plant model systems.</a> Cell. 167 (2), 325-339 (2016).</li><li>M&#252;ller, B., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+organisms-a+historical+perspective.">Model organisms-a historical perspective.</a> Journal of Proteomics. 73 (11), 2054-2063 (2010).</li><li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+fruit-specific+promoters+drive+AtMYB12+expression+to+improve+phenylpropanoid+accumulation+in+tomato.">Different fruit-specific promoters drive AtMYB12 expression to improve phenylpropanoid accumulation in tomato.</a> Molecules. 27 (1), 317 (2022).</li><li>Niedba&#322;a, G., Niazian, M., Sabbatini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+agrobacterium-mediated+gene+transformation+of+tobacco+(Nicotiana+tabacum)-a+model+plant+for+gene+transformation+studies.">Modeling agrobacterium-mediated gene transformation of tobacco (Nicotiana tabacum)-a model plant for gene transformation studies.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 695110 (2021).</li><li>Kumari, D., Prasad, B., Dwivedi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genome Editing Platforms in Rice (Oryza sativa L.): Basic methodology and troubleshooting. , (2022).</li><li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+cotton.">Agrobacterium-mediated transformation of cotton.</a> Transgenic Cotton. , 31-45 (2013).</li><li>Tiwari, R., Singh, A. K., Rajam, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+and+reliable+plant+regeneration+and+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+in+soybean+(Glycine+max+L).">Improved and reliable plant regeneration and Agrobacterium-mediated genetic transformation in soybean (Glycine max L).</a> Journal of Crop Science and Biotechnology. , 1-10 (2022).</li><li>Bakhsh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+efficient,+reproducible+and+stable+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+five+potato+cultivars.">Development of efficient, reproducible and stable Agrobacterium-mediated genetic transformation of five potato cultivars.</a> Food Technology and Biotechnology. 58 (1), 57-63 (2020).</li><li>Bates, R., Craze, M., Wallington, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+oilseed+rape+(Brassica+napus).">Agrobacterium-mediated transformation of oilseed rape (Brassica napus).</a> Current Protocols in Plant Biology. 2 (4), 287-298 (2017).</li><li>Hopp, H. E., Spangenberg, G., Herrera-Estrella, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation.">Plant transformation.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 876671 (2022).</li><li>Abdelmuhsin, A. A., Alghamdi, A. A., Ibrahim, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+phenotypic+and+genotypic+variations+of+Plantago+ciliata+in+Ha'il+region,+Saudi+Arabia.">Assessing the phenotypic and genotypic variations of Plantago ciliata in Ha'il region, Saudi Arabia.</a> Entomology and Applied Science Letters. (1), 14-22 (2021).</li><li>Coleman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plantago+Lanceolata.">Plantago Lanceolata.</a> Botanical Bulletin. 1 (11), 45 (1876).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+transcriptomic+profiling+of+Plantago+major+provides+insights+for+the+involvement+of+vasculature+in+phosphate+deficiency+responses.">Tissue-specific transcriptomic profiling of Plantago major provides insights for the involvement of vasculature in phosphate deficiency responses.</a> Molecular Genetics and Genomics. 294 (1), 159-175 (2019).</li><li>Penczykowski, R. M., Sieg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plantago+spp.+as+models+for+studying+the+ecology+and+evolution+of+species+interactions+across+environmental+gradients.">Plantago spp. as models for studying the ecology and evolution of species interactions across environmental gradients.</a> The American Naturalist. 198 (1), 158-176 (2021).</li><li>Pommerrenig, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+plantain.+A+collection+of+expressed+sequence+tags+from+vascular+tissue+and+a+simple+and+efficient+transformation+method.">Common plantain. A collection of expressed sequence tags from vascular tissue and a simple and efficient transformation method.</a> Plant Physiology. 142 (4), 1427-1441 (2006).</li><li>Bergero, R., Levsen, N., Wolff, K., Charlesworth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arms+races+with+mitochondrial+genome+soft+sweeps+in+a+gynodioecious+plant,+Plantago+lanceolata.">Arms races with mitochondrial genome soft sweeps in a gynodioecious plant, Plantago lanceolata.</a> Molecular Ecology. 28 (11), 2772-2785 (2019).</li><li>Aalto, E. A., Koelewijn, H. P., Savolainen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+male+sterility+contributes+to+hybrid+incompatibility+between+subspecies+of+Arabidopsis+lyrata.">Cytoplasmic male sterility contributes to hybrid incompatibility between subspecies of Arabidopsis lyrata.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 3 (10), 1727-1740 (2013).</li><li>Bloch, K. D., Grossmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestion+of+DNA+with+restriction+endonucleases.">Digestion of DNA with restriction endonucleases.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 3 (1), (1995).</li><li>Du, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+expression,+purification,+physicochemical+properties+and+antifungal+activity+analysis+of+phloem+protein+PP2-A1+from+cucumber.">Prokaryotic expression, purification, physicochemical properties and antifungal activity analysis of phloem protein PP2-A1 from cucumber.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 194, 395-401 (2022).</li><li>Deshmukh, S. 2. 2., Kulkarni, R., Bose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+protein+expression.">Transformation and protein expression.</a> Textbook on Cloning, Expression and Purification of Recombinant Proteins. , 83-114 (2022).</li><li>Bergkessel, M., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+PCR.">Colony PCR.</a> Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).</li><li>Broehan, G., Kroeger, T., Lorenzen, M., Merzendorfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+ATP-binding+cassette+(ABC)+transporter+gene+family+of+Tribolium+castaneum.">Functional analysis of the ATP-binding cassette (ABC) transporter gene family of Tribolium castaneum.</a> BMC Genomics. 14, 6 (2013).</li><li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transformation+of+fluorescent+proteins+into+Nosema+bombycis+by+electroporation.">Stable transformation of fluorescent proteins into Nosema bombycis by electroporation.</a> Parasites &amp; Vectors. 15 (1), 141 (2022).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean.">Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 246 (2017).</li><li>Manimaran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+early+and+young+callus+tissues+of+indica+rice+BPT+5204+enhances+regeneration+and+transformation+efficiency.">Infection of early and young callus tissues of indica rice BPT 5204 enhances regeneration and transformation efficiency.</a> Rice Science. 20 (6), 415-426 (2013).</li><li>Wang, J., Nie, J., Pattanaik, S., Yuan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Artemisia+annua+L.+using+young+inflorescence.">Efficient Agrobacterium-mediated transformation of Artemisia annua L. using young inflorescence.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology-Plant. 52 (2), 204-211 (2016).</li><li>Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+planta+hairy+root+transformation:+a+powerful+platform+for+functional+analysis+of+root+traits+in+soybean.">CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in soybean.</a> Plants. 11 (8), 1044 (2022).</li><li>Geng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+root+transformation+system+for+CRISPR/Cas9-based+analyses+of+shoot-root+communication+in+cucurbit+crops.">An efficient root transformation system for CRISPR/Cas9-based analyses of shoot-root communication in cucurbit crops.</a> Horticulture Research. 9, (2022).</li><li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+using+cotyledons,+hypocotyls+and+roots+of+'Duli'(Pyrus+betulifolia+Bunge).">Efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation using cotyledons, hypocotyls and roots of 'Duli'(Pyrus betulifolia Bunge).</a> Scientia Horticulturae. 296, 110906 (2022).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

היעדר פרוטוקול טרנספורמציה לצמחים בסוג Plantago מגביל את השימוש בצמחים אלה כמודל, במיוחד כאשר חוקרים מעוניינים לחקור תפקודי גנים. P. lanceolata נבחר לפתח פרוטוקול טרנספורמציה גנטית מכיוון שהוא הצמח הנחקר ביותר בסוג16. הפרוטוקול שפותח ישמש ככל הנראה ככלי לקידום מחקרים נוספים הקשורים לביולוגיה של כלי הדם, אקולוגיה, אינטראקציות צמחים-חרקים ופיזיולוגיה של עקה אביוטית.
הפרוטוקול שהוצג מתאר בבירור צעדים המאפשרים למשתמש להשיג צמחים טרנסגניים. מלבד היכולת של P. lanceolata לשגשג בסביבת תרבית רקמות, גורמים רבים תרמו להצלחת שיטת הטרנספורמציה שלנו. ראשית, נצפתה החשיבות של שימוש ברקמת שורש צמח איכותית וסטרילית לצורך טרנספורמציה. לשורשים היו שיעורי השינוי הגבוהים ביותר כאשר הם נלקחו מצמחים בני 3-4 שבועות, ונראו ירוקים או לבנים בהירים. שורשים שנלקחו מקופסאות עם כל כמות של זיהום חיידקי או פטרייתי גרמו לעתים קרובות לתרביות ירי מזוהמות, ושורשים ישנים יותר שנראו חומים לא הביאו לשינוי מוצלח. רקמת שורש הייתה סוג הרקמה היעיל ביותר לטרנספורמציה בשיטה הנוכחית, שכן רקמת העלה ורקמת הפטוטרת לא הצליחו לפתח נבטים.
תצפית חשובה נוספת הייתה שהשיטה האופטימלית לאיסוף רקמת שורש לצורך טרנספורמציה היא הנחת חומר שורשים שזה עתה נחתך במים סטריליים. שלב זה איפשר למעשה לחומר השורש להישאר רווי לחות בזמן ששאר הרקמה נאספת, מכיוון שהשורשים נוטים להתייבש במהירות כאשר הם מוסרים ממיכלי הצמיחה שלהם. צעד זה גם סייע להגדיל את שיעור ההצלחה של הטרנספורמציה, מכיוון שהוא איפשר ליותר שורשים להיות מודגרים בחיידקים בו זמנית.
פרוטוקול זה יכול להשתנות על ידי הפחתת הזמן שבו רקמת השורש דוגרת במדיה co-culture ל 2 ימים. נצפה כי תקופת דגירה של 2 או 3 ימים מספיקה כדי לאפשר זיהום שתוצאתו ראשי תיבות יורה. עם זאת, זמני דגירה ארוכים יותר אינם מומלצים, שכן נצפתה כי היעדר מעכב אנטיביוטיקה בתקשורת גורם לעתים קרובות לצמיחת יתר של A. tumefaciens , אשר יכול להרוג את הרקמה המתעוררת.
מגבלה של מחקר זה היא היעדר נתונים זמינים על הביצועים של שיטות או מינים אחרים של A. tumefaciens בטרנספורמציה P. lanceolata להשוואה. למיטב ידיעתנו, פרוטוקול זה הוא חדשני. במהלך הניסויים הראשוניים נצפתה יעילות טרנספורמציה גבוהה עם A. tumefaciens GV3101, והתמקדנו בשכלול הטכניקה באמצעות זן זה במקום להתנסות בזנים אחרים. יעילות הטרנספורמציה שלנו של 20% היא גבוהה יחסית לטרנספורמציה של צמחים - שיטות קונבנציונליות רבות רואות כל דבר >1% כמוצלח26,27,28. עם זאת, שימוש בזן אחר של A. tumefaciens, כגון A. rhizogenes, הידוע בשימושו בשינוי שורשים במינים מרובים29,30,31, עשוי לגרום לשיעור הצלחה גבוה עוד יותר. יהיה צורך בניסויים נוספים כדי להעריך את ההשפעה של שימוש בזנים אחרים כדי לקדם יעילות טרנספורמציה מוגברת ב- P. lanceolata. 
הטרנספורמציה המוצלחת של P. lanceolata תועיל ככל הנראה לתחומי לימוד רבים. יעילות הטרנספורמציה הגבוהה, והצמיחה המהירה של הצמח באמצעי תרביות רקמה, הופכים את P. lanceolata למועמד אפשרי למחקרי תפקודי גנים15.

הרעיון של שימוש במיני מודל כדי לחקור היבטים רבים של ביולוגיה של צמחים הופיע עם השימוש הנרחב של Arabidopsis thaliana1. Arabidopsis נבחר בתחילה כי הוא חולק תכונות עם צמחים פורחים רבים אחרים ויש לו תכונות מרובות שהופכות אותו נוח ללמוד בסביבת מעבדה, כגון להיות קטן בעל מחזור דור קצר. הכמות הגדולה של מאמרי מחקר שפורסמו יחד איתו כנושא, יחד עם גודל הגנום הקטן שלו וקלות הטרנספורמציה הגנטית2, מאפשרים לו להתמיד כאורגניזם ניסיוני בשימוש נרחב. עם זאת, Arabidopsis יכול להיות מוגבל כמודל עבור מינים עם מאפיינים שונים או תכונות ייחודיות3. זה הניע את הפיתוח של מערכות מודל חדשות, כגון תירס (Zea mays), צמח חשוב לגנטיקה התפתחותית במונוקוטים4, ועגבנייה (Solanum lycopersicum), שהוא מודל חשוב למחקרים אבולוציוניים, התפתחות פירות, וייצור, והוא ייצוג טוב לגידולי ירקות5. שיטה לטרנספורמציה גנטית היא תנאי מוקדם כדי שמין צמח ישמש כאורגניזם מודל2. טרנספורמציה בתיווך גידולים אגרובקטריום היא כלי אמין בביולוגיה של צמחים; הוא שימש לשינוי כמה מיני מודל וגידולים עיקריים, כולל טבק (Nicotiana tabacum)6, אורז (Oryza sativa)7, כותנה (Gossypium hirsutum)8, סויה (Glycine max)9, תפוח אדמה (Solanum tuberosum)10, וקנולה (Brassica napus)11. מיני צמחים משתנים מאוד במידת ההצלחה שלהם להגיב לזיהום A. tumefaciens, ופרוטוקולי טרנספורמציה לעתים קרובות צריכים להיות מותאמים באופן אינדיבידואלי לכל מין 6,12.
הסוג Plantago כולל בסך הכל 256 מיני צמחים, הנפוצים ברחבי העולם13. למינים בסוג זה יש לעתים קרובות מאפיינים ייחודיים שהופכים אותם לנחשקים כמין מודל לחקר גנטיקה, אקולוגיה, פיזיולוגיה של עקה, מטבוליטים שניוניים, כימיה רפואית, אינטראקציות צמחים-מיקרובים, התפתחות צמחים ואבולוציה. Plantago lanceolata , המכונה גם צמח צר עלים או plantein ribwort, היה צמח פופולרי של עניין מאז המאה ה- 19, כאשר הוא שימש לראשונה כדי לתאר את תופעת העקרות הגברית14. כמו צמחים אחרים מסוגו, הוא שימש במחקרים בתחומי מחקר שונים. לאחרונה, הוא הוצע כמודל לביולוגיה של כלי הדם, שכן רקמת כלי הדם שלה ניתן לאסוף בקלות15. P. lanceolata הוא המין הנחקר ביותר בסוג Plantago; כתבה משנת 2021 דיווחה כי היו >1,400 פרסומים הכוללים או מתייחסים למין זה באותה עת16, ו-102 מאמרים נוספים פורסמו מתחילת 2022, על פי חיפוש PubMed שנערך ב-9בדצמבר 2022. הצמח הבא הנחקר ביותר בסוג, P. major, הוא הנושא של 414 מאמרים בלבד כאשר מחפשים על פי אותם קריטריונים באותו תאריך.
למרות העניין המחקרי ב- P. lanceolata, מחקרים, במיוחד על אפיון תפקוד גנים, מוגבלים לעתים קרובות על ידי היעדר ערכת כלים למניפולציה גנטית עבור המין. Pommerrienig et al. עשו מאמצים לפתח פרוטוקול טרנספורמציה עבור P. major באמצעות טכניקת טבילה פרחונית17. עם זאת, שיטה זו אינה יכולה להיות מיושמת על P. lanceolata בגלל העקרות הגברית האופיינית למין זה18,19. למיטב ידיעתנו, אין פרוטוקול קיים לטרנספורמציה של P. lanceolata.
מחקר זה מציג פרוטוקול פשוט עבור A. tumefaciens-mediated transformation of P. lanceolata. על ידי התמקדות ברקמות השורש, צמחים טרנסגניים שגדלו במלואם יכולים להיווצר תוך 3 חודשים מרגע הטרנספורמציה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom TubeA4A2:A34</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Naphthylacetic acid</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>N-780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Micropore Surgical Paper Tape</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>19-027761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>163227LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 Watt High Pressure Sodium Lights</td>
			<td>Plantmax</td>
			<td>PX-LU600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (6-BAP)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>B-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary Plasmid pBI101</td>
			<td>Clontech, USA&#160;</td>
			<td>632522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool White Grow Light Sylvania LLC</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>315952205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-biotin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP232-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5a E. coli&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA&#160;</td>
			<td>18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes, Sterile 150 x 16 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes, Sterile 95 x 15 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>38DI12044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2519-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>38DI18031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelrite</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>G35020-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>241261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Tabletop Orbital Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>SHKE420HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indole-3-Acetic Acid (IAA)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indole-3-Butyric Acid (IBA)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>K-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrocentrifuge&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75007210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta Boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50255176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipet Tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipet Tips 200 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipette Tips 10 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor 0.5-10 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor 20-200 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor 2-20 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skooge Basal Medium with Vitamins</td>
			<td>PhytoTech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skooge Basal Salt Mixture</td>
			<td>PhytoTech</td>
			<td>M524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-Inositol</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0761-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (paraffin film)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>P44000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6280-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Handle</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>38DI36419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3802181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, Crystal (NaCl)</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>S24000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>23263068401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil- Bark Mix</td>
			<td>Berger, USA</td>
			<td>BM7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Pots (3.5 inches squared)</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-TRK-1835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>S24060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4625-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin Ticarcillin/Clavulanate (15/1) (Timentin)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>T-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-Zeatin Riboside (ZR)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>Z-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild Type Plantago lanceolata seeds</td>
			<td>Outsidepride Seed Source, OR, USA</td>
			<td>F1296</td>
			<td>Outsidepride.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Granulated</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>Y20025-1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of narrowleaf plantain

למינים בסוג Plantago מספר תכונות ייחודיות שהובילו להתאמתם כצמחי מודל בתחומי מחקר שונים. עם זאת, היעדר מערכת מניפולציה גנטית מונע חקירה מעמיקה של תפקוד הגנים, ומגביל את הרבגוניות של סוג זה כמודל. כאן, פרוטוקול טרנספורמציה מוצג עבור Plantago lanceolata, המין הנחקר ביותר Plantago. באמצעות טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium tumefaciens, שורשים בני 3 שבועות של צמחי P. lanceolata שגדלו באופן אספטי היו נגועים בחיידקים, הודגרו במשך 2-3 ימים, ולאחר מכן הועברו למדיום השראת נבטה עם בחירת אנטיביוטיקה מתאימה. הנבטים יצאו בדרך כלל מהמדיום לאחר חודש, והשורשים התפתחו 1-4 שבועות לאחר העברת הנבטים למדיום השראת השורש. לאחר מכן התאקלמו הצמחים בסביבת קרקע ונבדקו לנוכחות טרנסגן באמצעות בדיקת כתב β-glucuronidase (GUS). יעילות הטרנספורמציה של השיטה הנוכחית היא ~20%, כאשר שני צמחים טרנסגניים מופיעים לכל 10 רקמות שורש שעברו טרנספורמציה. קביעת פרוטוקול טרנספורמציה לצמח צר עלים תקל על אימוץ צמח זה כמין מודל חדש בתחומים שונים.

פרוטוקול פשוט מדווח כאן להשגת צמחי P. lanceolata טרנסגניים באמצעות טרנספורמציה בתיווך A. tumefaciens. הגן המדווח GUS (המקודד β-glucuronidase) הופך למונע על-ידי מקדם הביטוי של AtPP2, לשורשי P. lanceolata בני 3 שבועות באמצעות זן A. tumefaciens GV3101 (איור 2). מקדם ספציפי לפלואם נבחר מכיוון שהעניין העיקרי שלנו היה להקים מערכת לגנומיקה פונקציונלית של רקמות כלי הדם של צמחים, במיוחד פלואם. השיטה נבדקה על השורש, העלה ורקמת הפטוטרת בניסוי הראשוני. אף על פי שניתן היה לגרום ליבלות בכל סוגי הרקמות, רק רקמת השורש הפיקה ראשי תיבות של יורים (איור 5A) לאחר חודש אחד ב-SIM; העלה והפטוטרת הפכו חומים ומתו (איור 5B). זה הוביל למסקנה שרקמת השורש היא סוג הרקמה האופטימלי לשימוש בשיטת הטרנספורמציה. השורשים הודגרו בחיידקים מוכנים שהורחפו בתמיסת תרחיף (SS) (טבלה 1) למשך 20 דקות לפחות, ואז הודגרו בטמפרטורת החדר על לוחות SS מוצקים למשך עד 3 ימים בחושך (איור 3E). לאחר מכן הועברו השורשים למדיום האינדוקציה של הנבטה (SIM) ונשמרו תחת אור גידול, בתנאים המצוינים בפרוטוקול (שלב 1.6). איור 1 ואיור 3 מציגים תמונות מייצגות של כל שלב בפרוטוקול לצורך התייחסות.
איור 6 מראה את ההתקדמות של ראשי התיבות של הנבטים שיצאו מרקמה שעברה טרנספורמציה, מהיום הראשון שבו השורשים הונחו על ה-SIM (איור 6A) ועד שהנבטים היו מוכנים להשתרש (איור 6D). לאחר שבוע אחד, רקמת השורש יצרה יבלות (איור 6B), וניתן היה לראות את ההתחלה של ראשי התיבות של הירי (איור 6B1). הנבטים המשיכו להופיע במהלך שבועות 2 ו-3 (איור 6C), ולאחר 4 שבועות, הנבטים היו מוכנים להעברה למדיום השראת השורש (איור 6D).
זיהוי הצמחים הטרנסגניים המשוערים נעשה באמצעות הבדיקה ההיסטוכימית β-glucuronidase (GUS), באמצעות מקטעי עלים שנלקחו לאחר שהנבטים היו באורך של כ-0.5 ס"מ. צמחים טרנסגניים חיוביים הראו את דפוס הצביעה הצפוי ברקמה המקומית של פלואם, כפי שהודגם באיור 4. נבטים חיוביים המוכתמים ב-GUS הועברו למדיום השראת השורש, שבו הם פיתחו מערכות השתרשות חזקות לאחר 4 שבועות (איור 1E). צמחים מושרשים הועברו אז לאדמה. איור 4 מראה את התוצאה של צביעה בצמח צר עלים שעבר טרנספורמציה עם מקדם AtPP2 והגן β-glucuronidase (GUS), יחד עם סוג בר וצמח צר עלים שעברו טרנספורמציה עם מקדם AtPP2 , לשם השוואה. כל הצילומים שיצאו אושרו כטרנסגניים. יעילות הטרנספורמציה נקבעה בממוצע של 20%, עם כשני נבטים שהופיעו על כל 10 שורשים שעברו טרנספורמציה. צמחים טרנסגניים מאושרים הועברו לעציצים גדולים יותר וגודלו במשך 4-8 שבועות עד שהגיעו לשלב הבוגר (איור 1F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig01.jpg"> איור 1: ציר הזמן של טרנספורמציית Plantago lanceolata . תמונות מייצגות של כל שלב בפרוטוקול. (A) זרעים לא מונבטים מצופים על צלחת MS. (B) זרעים שנבטו לאחר שבוע, מוכנים להעברה לקופסאות מגנטה. (C) צמחים בקופסאות טרשת נפוצה לאחר 3 שבועות של צמיחה. השורשים ירוקים ובריאים, בשלב האידיאלי לטרנספורמציה. (D) צילומים במדיית אינדוקציה לצילום לאחר 4 שבועות מוכנים להעברה למדיום ההשתרשות. בשלב זה ניתן לבצע צביעה היסטוכימית β-glucuronidase (GUS), אם רלוונטי. (E) צמחים בקופסאות עם אמצעי השראת שורשים, שם נוצרו שורשים לאחר 4 שבועות של צמיחה. (F) צמחים טרנסגניים גדלים באורך מלא לאחר 4 שבועות של צמיחה באדמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig02.jpg"> איור 2: דיאגרמה של פלסמיד וקטורי בינארי pBI101 + β-glucuronidase (GUS) עם המקדם הספציפי לפלואם שהוכנס AtPP2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig03.jpg"> איור 3: שלבי טרנספורמציה. תמונות מייצגות של כל שלב בטרנספורמציה. (A) הפרדת שורשים מנבטים במהלך הטרנספורמציה. (B) השריית שורשים בתרחיף חיידקים/SS. (C) ייבוש שורשים על מגבות נייר לסילוק עודפי חיידקים. (D) שורשים מצופים במדיום של תרבות משותפת. (E) לוחות SS עטופים ברדיד אלומיניום. הצמחים הודגרו במשך 2-3 ימים לפני שהועברו למדיום הירי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig04.jpg"> איור 4: צביעת GUS. תוצאות צביעה של β-glucuronidase (GUS) של מקטעי עלים צרים. (A) סוג פראי. (B) פלנטיין צר עלים שעבר טרנספורמציה עם הפלסמיד שמכיל את מקדם AtPP2 (וקטור ריק). (C) צמח צר עלים שעבר טרנספורמציה עם הפלסמיד שמכיל את מקדם AtPP2 ואת הגן β-glucuronidase (GUS). כל עלה הוכתם באמצעות פרוטוקול הצביעה ההיסטוכימי GUS, ולאחר מכן צולם במצלמה מיקרוסקופית. בתמונות (B) ו-(C) אין דפוס צביעה עקב היעדר הגן GUS. התמונה הימנית מראה דפוס כתמים כחול ברור בוורידים, המאשר כי הצמחים הם טרנסגניים. אורכו של המוט 1 מ"מ, כאשר אורכו של כל קטע עלה הוא כ-1 ס"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig05.jpg"> איור 5: השוואת יעילות הטרנספורמציה של סוגי רקמות שונים לאחר דגירה של > חודש על מדיית צילום . (A) רקמות שורש לאחר יותר מחודש אחד של גדילה. שורשים חוו יבלות מורחבות, וראשי תיבות של יורים צצו. יבלות שלא עברו טרנספורמציה החלו למות בתגובה לברירה אנטיביוטית. (B) רקמות עלים ופטוטרות לאחר יותר מחודש אחד של צמיחה. רקמות חוו התרחבות מסוימת של יבלות אך מתו במהרה בתגובה לאנטיביוטיקה. מאף אחת מהרקמות, לא יצאו נבטים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig06.jpg"> איור 6: הופעה של יבלות ויורה על רקמה שעברה טרנספורמציה. תמונות מייצגות של רקמות שהונחו על מדיום הירי לאחר אורכים שונים של דגירה. (A) רקמות שורש מיד לאחר הציפוי על מדיום הצילום. (B) רקמות שורש לאחר שבוע על מדיום צילום. ניתן להבחין בהתפשטות יבלות, ו-(B1) ראשי התיבות הראשונים של הירי החלו להופיע. (C) רקמות שורש לאחר 3 שבועות על מדיום צילום. ראשי תיבות נוספים של צילומים צצו. (ג1) הצילומים שיצאו מראשוני הירי B1. (D) רקמות שורש לאחר 4 שבועות של דגירה. רקמה שלא עברה טרנספורמציה החלה להפוך לשחורה/חומה ולמות, ונבטים מתפתחים ממשיכים לגדול. בשלב זה, יורה מוכנים לעבור למדיום ההשתרשות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: מתכונים להכנת מדיה. תיאור כיצד להכין מדיומים לטרנספורמציה. כמות הויטמינים שנוספו מחושבת על בסיס ריכוז תמיסת המלאי שצוין. ראו טבלה 2 להכנת תמיסת מלאי ויטמינים. עבור כל המדיומים, הוסף ריאגנטים ל- 900 מ"ל של H2O מזוקק כפול, pH לרמה שצוינה, ולאחר מכן הוסף מים לנפח סופי של 1,000 מ"ל. * = להוסיף לאחר עיקור. ** = pH עם 1 M KOH. = pH עם 1 M NaOH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777_Table%201_Media%20Preparation%20Recipes.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 2: מלאי ויטמינים למדיומים של Plantago . כל הוויטמינים חייבים להיות מסוננים, מעוקרים ומסומנים במדויק לפני האחסון. היכן שצוין, יש להמיס את האבקות תחילה ב-1 N NaOH, ולאחר מכן להשלים את הנפח הרצוי עם H2O מזוקק כפול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777_Table%202_Vitamin%20Stocks%20for%20Plantago%20Mediums.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain at JoVE.com

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

בגלל היישום הרב-תכליתי שלו כמין מודל בתחומי מחקר שונים, יש צורך בארגז כלים לשינוי גנטי בפלנטיין צר עלים (Plantago lanceolata). כאן, באמצעות טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium tumefaciens, מוצג פרוטוקול שמביא לקווים טרנסגניים יציבים עם יעילות טרנספורמציה של 20%.

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

Species in the genus Plantago have several unique traits that have led to them being adapted as model plants in various fields of study. However, the lack ...

מיני Plantago יכולים לשמש כצמחי מודל לביולוגיה של כלי הדם של צמחים ולפיזיולוגיה של עקה. קביעת פרוטוקול טרנספורמציה מאפשרת מחקרים מעמיקים על צמחים אלה לחקור את היחסים בין גנים לבין הפנוטיפ הקשור אליהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת במזונות כמו explants כדי להפוך plantain צר עם יעילות גבוהה.כדי להתחיל, מניחים זרעי בר מסוג Plantago lanceolata הזמינים מסחרית בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר עד לסימן 5 מיליליטר, בהתאם למספר הצמחים הרצוי. טבלו את הזרעים באתנול 75% למשך 60 שניות. לאחר השלכת האתנול, לטבול את הזרעים בהיפוכלוריט 20% נתרן טרי מוכן במשך 40 דקות על ידי היפוך עדין של הצינור.תחת מכסה מנוע זרימה למינציה, להשליך את תמיסת hypochlorite נתרן, ולאחר מכן לשטוף את הזרעים חמש פעמים עם מים מזוקקים. הוסיפו כמות קטנה של מים לזרעים לאחר השטיפה הסופית, מכיוון שזה יכול לעזור לתנועה של הצמחים על הצלחות. בעזרת מלקחיים סטריליים, מעבירים את הזרעים לצלחת פטרי מוכנה מראש עם מדיום MS מוצק על ידי פיזור הזרעים באופן שווה על פני הצלחת, כסנטימטר אחד בין כל זרע כדי למנוע צפיפות יתר של השתילים הנובטים.אוטמים את הצלחת בשתי שכבות של סרט פרפין למניעת זיהום ודגרים תחת אור גידול לבן וקריר בטמפרטורת החדר. ברגע שהשתילים נובטים והם גדולים מספיק כדי להעביר, בדרך כלל לאחר יומיים או שלושה של נביטה, השתמשו במלקחיים סטריליים והעבירו את השתילים לקופסאות סטריליות המכילות 50 עד 100 מיליליטר של MS Medium. אטמו את הקופסאות בסרט כירורגי, ואפשרו לצמחים לגדול תחת אור הגידול הלבן והקריר במשך כשלושה עד ארבעה שבועות.פס Agrobacterium tumefaciens המכיל את הפלסמיד הרצוי על צלחת LB מוצק מוכן עם סוכן הבחירה המתאים. דוגרים על הצלחת האטומה בפרפין בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות, או עד שהחיידקים גדלים מספיק כדי לקטוף. לאחר הדגירה, בוחרים מושבת חיידקים באמצעות קצה פיפטה יומיים לפני הטרנספורמציה, ומחסנים אותה בצינור תחתון עגול של 15 מיליליטר המכיל שישה מיליליטר של LB נוזלי עם חומר הבחירה המתאים.נערו במהירות של 200 סל"ד בשייקר שולחני של 28 מעלות צלזיוס, למשך הלילה, עד שה-OD 600 יגיע ל-0.6 עד 0.7. ברגע שהחיידקים מגיעים ל-OD הנדרש, מעבירים 200 מיקרוליטר של תרבית החיידקים לבקבוק סטרילי המכיל 100 מיליליטר LB עם חומר הבחירה. נערו ב-200 סל"ד ב-28 מעלות צלזיוס, למשך הלילה.לאחר מכן להעביר את תרבית החיידקים לתוך צינורות צנטריפוגות סטריליות 50 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 2, 200G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את החיידקים. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית החיידקים בחמישה מיליליטר של תמיסת תרחיף טרייה או SS בטמפרטורת החדר על ידי פיפט. לאחר מכן מוסיפים עוד SS עד לסימן 50 מיליליטר והופכים לערבוב מספר פעמים.לאחר שהצמחים מגיעים לשלב האידיאלי לטרנספורמציה, תוך כשלושה שבועות, השתמשו במלקחיים ובמספריים סטריליים כדי להפריד את השורשים מהצמח ולהשליך את חומר העלה והגבעול. מיד לאחר החיתוך, מעבירים את חתיכות השורש לקופסאות המכילות מים סטריליים באמצעות מלקחיים כדי לשמור עליהם רוויים. לאחר מכן, שפכו את תרבית החיידקים Agrobacterium tumefaciens התלויה של האס אס לתוך צלחות פטרי חד פעמיות סטריליות בגודל 150 על 15 מילימטר.מעבירים את השורשים החתוכים לתרבית החיידקים ודגרים במשך 20 דקות לפחות. במהלך הדגירה, השתמש באזמל סטרילי עם להב חד כדי לחתוך את השורשים לשברים של סנטימטר אחד המפרידים בין השורשים הראשוניים לשורשים הרוחביים. לאחר מכן בצעו חתכים רדודים דקים על פני השטח של השורשים כדי לאפשר לחיידקים להדביק את הצמח.לאחר הדגירה, מעבירים את חתיכות השורש למגבות נייר סטריליות כדי להסיר עודפי חיידקים. לאחר מכן מעבירים את השורשים המיובשים לצלחות פטרי מוכנות המכילות מצע מוצק של תרבית משותפת בסביבות 10 עד 20 שורשים בכל צלחת, תלוי בגודל השורשים. אוטמים את הצלחות בשתי שכבות של סרט פלסטיק שקוף ולאחר מכן ברדיד אלומיניום כדי לדגור בטמפרטורת החדר במשך שלושה ימים.לאחר שלושה ימי דגירה. במדיה של תרבית משותפת, העבירו את חתיכות השורש לצלחות פטרי מוכנות עם מדיה אינדוקציה של יורה מוצק או סים עם 500 מיליגרם לליטר טמטין ובחירה אנטיביוטית מתאימה. דוגרים על לוחות אטומים של סרט פלסטיק שקוף תחת אור גידול למשך חודש או עד שהנבטים מתחילים לצאת.פעם הצמחים גדלים 1.5 עד 2.0 ס"מ אורך. מעבירים אותם לקופסאות סטריליות מוכנות. עם מדיה אינדוקציה שורש מוצק.מגדלים את הצמחים תחת אור גידול במשך מספר שבועות עד להיווצרות שורשים. בדרך כלל, לאחר שבוע, כאשר מערכות השורשים הופכות גדולות מספיק כדי לעבור בדרך כלל לאחר חודש של צמיחה לקחת את הצמח בעדינות לשטוף את השורשים עם מים כדי להסיר כל מדיום שנדבק לשורשים. לאחר מכן מעבירים את הצמחים לעציצים מרובעים בגודל 3.5 אינץ' המכילים אדמה רב-תכליתית רטובה מראש, BM שבע מכסים את הצמחים בכיסוי עציץ פלסטיק ולאחר מכן בשקית ניילון שקופה כדי להבטיח שהצמחים יישארו בסביבה לחה.שיטה זו נבדקה על עלה השורש ועל רקמה ישנה קטנונית. בניסוי הראשוני, למרות שניתן היה לגרום לקשקשים בכל סוגי הרקמות, רק רקמת השורש הפיקה ראשי תיבות לאחר חודש ב-SIM, העלה והדוושה הפכו חומים ומתים. ההתקדמות של ראשי תיבות יורים היוצאים מרקמה שעברה טרנספורמציה נצפתה מהיום הראשון.השורשים הונחו על הסים לזמן שבו הנבטים היו מוכנים להשתרש. לאחר שבוע, רקמת השורש יצרה קשקוש בתחילת ראשי התיבות של יורה ניתן היה לראות. הנבטים המשיכו לצוץ במהלך השבועות השני והשלישי ולאחר ארבעה שבועות, הנבטים היו מוכנים להעברה למדיום השראת השורש.זיהוי הצמחים המהונדסים-עונשיים בוצע באמצעות בדיקת בטא גלוקורונידאז GUS היסטוכימית באמצעות מקטעי העלים שנלקחו לאחר שהנבטים היו באורך של כ-0.5 סנטימטרים. הכתב הפראי בטרנספורמציה עם וקטורים ריקים אינו מציג תבנית צביעה. בשל היעדר הגן GUS, השינוי עם הגן GUS בטא glucuronidase הראה דפוס כתמים כחול ברור בוורידים המאשר כי הצמחים הם טרנסגניים שורשים תמיד צריך להישמר hydrated כדי למנוע התייבשות במהלך ההליך להעביר את השורשים כ 10 בכל פעם כדי למנוע זאת.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג&#39;ין השתקת Assay כותנה

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-תיווך המעבר העובר בלתי בוגר של הסרבן מתוך תירס שורות באמצעות גנים מורפולגניים

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

אגרובקטריום -תווךטרנספורמציה גנטית, ייצור טרנסגנית, ויישום שלה לחקר התפתחות הרבייה הגברית באורז

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

One-Step Hairy Root Transformation Method for Advancing Root-Related Biology

An Efficient and Reproducible Method for Producing Composite Plants by Agrobacterium rhizogenes-Based Hairy Root Transformation

Streamlining Composite Plant Production via Agrobacterium rhizogenes-Mediated Hairy Root Transformation (Video) | JoVE

שיטה יעילה וניתנת לשחזור לייצור צמחים מרוכבים על ידי טרנספורמציית שורשים שעירים מבוססי קנה שורש אגרובקטריום

Producing composite plants with transgenic roots and nontransgenic stems and buds using Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation is a ...