Name: agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of narrowleaf plantain
Uploaded: 2023-03-17T12:40:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (EDGE IOS-1923557 для C.Z. и Y.Z.).

<ol>
	<li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> The Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Bragg, J. N., Anderton, A., Nieu, R., Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brachypodium+distachyon.">Brachypodium distachyon.</a> Agrobacterium Protocols. , 17-33 (2015).</li><li>Chang, C., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+guide+to+plant+model+systems.">Field guide to plant model systems.</a> Cell. 167 (2), 325-339 (2016).</li><li>M&#252;ller, B., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+organisms-a+historical+perspective.">Model organisms-a historical perspective.</a> Journal of Proteomics. 73 (11), 2054-2063 (2010).</li><li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+fruit-specific+promoters+drive+AtMYB12+expression+to+improve+phenylpropanoid+accumulation+in+tomato.">Different fruit-specific promoters drive AtMYB12 expression to improve phenylpropanoid accumulation in tomato.</a> Molecules. 27 (1), 317 (2022).</li><li>Niedba&#322;a, G., Niazian, M., Sabbatini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+agrobacterium-mediated+gene+transformation+of+tobacco+(Nicotiana+tabacum)-a+model+plant+for+gene+transformation+studies.">Modeling agrobacterium-mediated gene transformation of tobacco (Nicotiana tabacum)-a model plant for gene transformation studies.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 695110 (2021).</li><li>Kumari, D., Prasad, B., Dwivedi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genome Editing Platforms in Rice (Oryza sativa L.): Basic methodology and troubleshooting. , (2022).</li><li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+cotton.">Agrobacterium-mediated transformation of cotton.</a> Transgenic Cotton. , 31-45 (2013).</li><li>Tiwari, R., Singh, A. K., Rajam, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+and+reliable+plant+regeneration+and+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+in+soybean+(Glycine+max+L).">Improved and reliable plant regeneration and Agrobacterium-mediated genetic transformation in soybean (Glycine max L).</a> Journal of Crop Science and Biotechnology. , 1-10 (2022).</li><li>Bakhsh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+efficient,+reproducible+and+stable+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+five+potato+cultivars.">Development of efficient, reproducible and stable Agrobacterium-mediated genetic transformation of five potato cultivars.</a> Food Technology and Biotechnology. 58 (1), 57-63 (2020).</li><li>Bates, R., Craze, M., Wallington, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+oilseed+rape+(Brassica+napus).">Agrobacterium-mediated transformation of oilseed rape (Brassica napus).</a> Current Protocols in Plant Biology. 2 (4), 287-298 (2017).</li><li>Hopp, H. E., Spangenberg, G., Herrera-Estrella, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation.">Plant transformation.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 876671 (2022).</li><li>Abdelmuhsin, A. A., Alghamdi, A. A., Ibrahim, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+phenotypic+and+genotypic+variations+of+Plantago+ciliata+in+Ha'il+region,+Saudi+Arabia.">Assessing the phenotypic and genotypic variations of Plantago ciliata in Ha'il region, Saudi Arabia.</a> Entomology and Applied Science Letters. (1), 14-22 (2021).</li><li>Coleman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plantago+Lanceolata.">Plantago Lanceolata.</a> Botanical Bulletin. 1 (11), 45 (1876).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+transcriptomic+profiling+of+Plantago+major+provides+insights+for+the+involvement+of+vasculature+in+phosphate+deficiency+responses.">Tissue-specific transcriptomic profiling of Plantago major provides insights for the involvement of vasculature in phosphate deficiency responses.</a> Molecular Genetics and Genomics. 294 (1), 159-175 (2019).</li><li>Penczykowski, R. M., Sieg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plantago+spp.+as+models+for+studying+the+ecology+and+evolution+of+species+interactions+across+environmental+gradients.">Plantago spp. as models for studying the ecology and evolution of species interactions across environmental gradients.</a> The American Naturalist. 198 (1), 158-176 (2021).</li><li>Pommerrenig, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+plantain.+A+collection+of+expressed+sequence+tags+from+vascular+tissue+and+a+simple+and+efficient+transformation+method.">Common plantain. A collection of expressed sequence tags from vascular tissue and a simple and efficient transformation method.</a> Plant Physiology. 142 (4), 1427-1441 (2006).</li><li>Bergero, R., Levsen, N., Wolff, K., Charlesworth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arms+races+with+mitochondrial+genome+soft+sweeps+in+a+gynodioecious+plant,+Plantago+lanceolata.">Arms races with mitochondrial genome soft sweeps in a gynodioecious plant, Plantago lanceolata.</a> Molecular Ecology. 28 (11), 2772-2785 (2019).</li><li>Aalto, E. A., Koelewijn, H. P., Savolainen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+male+sterility+contributes+to+hybrid+incompatibility+between+subspecies+of+Arabidopsis+lyrata.">Cytoplasmic male sterility contributes to hybrid incompatibility between subspecies of Arabidopsis lyrata.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 3 (10), 1727-1740 (2013).</li><li>Bloch, K. D., Grossmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestion+of+DNA+with+restriction+endonucleases.">Digestion of DNA with restriction endonucleases.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 3 (1), (1995).</li><li>Du, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+expression,+purification,+physicochemical+properties+and+antifungal+activity+analysis+of+phloem+protein+PP2-A1+from+cucumber.">Prokaryotic expression, purification, physicochemical properties and antifungal activity analysis of phloem protein PP2-A1 from cucumber.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 194, 395-401 (2022).</li><li>Deshmukh, S. 2. 2., Kulkarni, R., Bose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+protein+expression.">Transformation and protein expression.</a> Textbook on Cloning, Expression and Purification of Recombinant Proteins. , 83-114 (2022).</li><li>Bergkessel, M., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+PCR.">Colony PCR.</a> Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).</li><li>Broehan, G., Kroeger, T., Lorenzen, M., Merzendorfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+ATP-binding+cassette+(ABC)+transporter+gene+family+of+Tribolium+castaneum.">Functional analysis of the ATP-binding cassette (ABC) transporter gene family of Tribolium castaneum.</a> BMC Genomics. 14, 6 (2013).</li><li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transformation+of+fluorescent+proteins+into+Nosema+bombycis+by+electroporation.">Stable transformation of fluorescent proteins into Nosema bombycis by electroporation.</a> Parasites &amp; Vectors. 15 (1), 141 (2022).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean.">Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 246 (2017).</li><li>Manimaran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+early+and+young+callus+tissues+of+indica+rice+BPT+5204+enhances+regeneration+and+transformation+efficiency.">Infection of early and young callus tissues of indica rice BPT 5204 enhances regeneration and transformation efficiency.</a> Rice Science. 20 (6), 415-426 (2013).</li><li>Wang, J., Nie, J., Pattanaik, S., Yuan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Artemisia+annua+L.+using+young+inflorescence.">Efficient Agrobacterium-mediated transformation of Artemisia annua L. using young inflorescence.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology-Plant. 52 (2), 204-211 (2016).</li><li>Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+planta+hairy+root+transformation:+a+powerful+platform+for+functional+analysis+of+root+traits+in+soybean.">CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in soybean.</a> Plants. 11 (8), 1044 (2022).</li><li>Geng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+root+transformation+system+for+CRISPR/Cas9-based+analyses+of+shoot-root+communication+in+cucurbit+crops.">An efficient root transformation system for CRISPR/Cas9-based analyses of shoot-root communication in cucurbit crops.</a> Horticulture Research. 9, (2022).</li><li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+using+cotyledons,+hypocotyls+and+roots+of+'Duli'(Pyrus+betulifolia+Bunge).">Efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation using cotyledons, hypocotyls and roots of 'Duli'(Pyrus betulifolia Bunge).</a> Scientia Horticulturae. 296, 110906 (2022).</li></ol>

Авторам раскрывать нечего.

Отсутствие протокола трансформации для растений рода Plantago ограничивает использование этих растений в качестве моделей, особенно когда исследователи заинтересованы в изучении функций генов. P. lanceolata был выбран для разработки протокола генетической трансформации, потому что он является наиболее часто изучаемым растением своего рода16. Разработанный протокол, вероятно, будет использоваться в качестве инструмента для дальнейшего продвижения исследований, связанных с сосудистой биологией, экологией, взаимодействием растений и насекомых и физиологией абиотического стресса.
В представленном протоколе четко изложены шаги, которые позволяют пользователю получить трансгенные растения. Помимо способности P. lanceolata процветать в среде культивирования тканей, успех нашего метода трансформации способствовал множеству факторов. Во-первых, была отмечена важность использования высококачественной, стерильной ткани корня растений для трансформации. Корни имели самые высокие скорости трансформации, когда они были взяты из 3-4-недельных растений, и казались зелеными или бледно-белыми. Корни, взятые из ящиков с любым количеством бактериального или грибкового загрязнения, часто приводили к заражению побеговых культур, а старые корни, которые казались коричневыми, не приводили к успешной трансформации. Корневая ткань была наиболее эффективным типом ткани для трансформации с использованием современного метода, так как ткань листа и черешка не была успешной при развитии побегов.
Еще одно важное наблюдение заключалось в том, что оптимальным методом сбора корневой ткани для трансформации было помещение свежесрезанного корневого материала в стерильную воду. Этот этап эффективно позволял корневому материалу оставаться гидратированным, в то время как оставшаяся часть ткани была собрана, поскольку корни имеют тенденцию быстро высыхать при удалении из контейнеров для роста. Этот шаг также помог увеличить вероятность успеха трансформации, потому что он позволил одновременно инкубировать больше корней в бактериях.
Этот протокол может быть изменен путем уменьшения времени инкубации корневой ткани в среде совместного культивирования до 2 дней. Было отмечено, что 2-3-дневный инкубационный период достаточен для того, чтобы допустить заражение, которое приводит к инициалам побегов. Однако более длительное время инкубации не рекомендуется, поскольку было замечено, что отсутствие ингибитора антибиотика в среде часто приводит к чрезмерному росту A. tumefaciens , который может убить формирующуюся ткань.
Ограничением этого исследования является отсутствие доступных данных о производительности других методов или видов A. tumefaciens в трансформации P. lanceolata для сравнения. Насколько нам известно, этот протокол является новым. Во время первоначальных испытаний была отмечена высокая эффективность трансформации с A. tumefaciens GV3101, и мы сосредоточились на совершенствовании методики с использованием этого штамма вместо экспериментов с другими штаммами. Наша эффективность трансформации в 20% относительно высока для трансформации растений - многие традиционные методы считают успешным все, что >1% 26,27,28. Однако использование другого штамма A. tumefaciens, такого как A. rhizogenes, известного своим использованием в трансформации корней у нескольких видов 29,30,31, может привести к еще более высокому уровню успеха. Потребуются дальнейшие эксперименты для оценки влияния использования других штаммов на повышение эффективности трансформации P. lanceolata. 
Успешная трансформация P. lanceolata , вероятно, принесет пользу многим областям исследования. Высокая эффективность трансформации и быстрый рост растения в средах для культивирования тканей делают P. lanceolata возможным кандидатом для изучения функции генов15.

Концепция использования модельных видов для исследования многочисленных аспектов биологии растений возникла с широким использованием Arabidopsis thaliana1. Арабидопсис был первоначально выбран потому, что он имеет общие черты со многими другими цветковыми растениями и имеет множество признаков, которые делают его удобным для изучения в лабораторных условиях, например, маленький размер и короткий цикл генерации. Большой объем исследовательских работ, опубликованных с ним в качестве субъекта, наряду с его небольшим размером генома и простотой генетической трансформации2, позволяют ему сохраняться в качестве широко используемого экспериментального организма. Тем не менее, Arabidopsis может быть ограничен в качестве модели для видов с различными характеристиками или уникальными признаками3. Это послужило толчком к разработке новых модельных систем, таких как кукуруза (Zea mays), важное растение для генетики развития у однодольныхрастений 4, и томат (Solanum lycopersicum), который является важной моделью для эволюционных исследований, развития плодов и производства и является хорошим представлением для овощных культур5. Метод генетической трансформации является предпосылкой для того, чтобы вид растений служил модельным организмом2. Трансформация, опосредованная Agrobacterium tumefaciens, является надежным инструментом в биологии растений; он был использован для преобразования нескольких модельных видов и основных сельскохозяйственных культур, включая табак (Nicotiana tabacum)6, рис (Oryza sativa)7, хлопок (Gossypium hirsutum)8, сою (Glycine max)9, картофель (Solanum tuberosum)10 и рапс (Brassica napus)11. Виды растений сильно различаются по тому, насколько успешно они реагируют на инфекцию A. tumefaciens, и протоколы трансформации часто должны быть индивидуально адаптированы к каждому виду 6,12.
Род Plantago включает в себя в общей сложности 256 видов растений, широко распространенных по всему миру13. Виды этого рода часто обладают уникальными характеристиками, которые делают их желательными в качестве модельных видов для изучения генетики, экологии, физиологии стресса, вторичных метаболитов, медицинской химии, взаимодействия растений и микробов, развития и эволюции растений. Подорожник ланцетный , также называемый узколистным или ребристым подорожником, был популярным растением, представляющим интерес с 19века , когда он был впервые использован для описания явления мужского бесплодия14. Как и другие растения этого рода, он использовался в исследованиях в различных областях исследований. Совсем недавно он был предложен в качестве модели для сосудистой биологии, так как его сосудистая ткань может быть легко собрана15. P. lanceolata является наиболее часто изучаемым видом рода Plantago; в статье 2021 года сообщалось, что в то время насчитывалось >1,1,400 публикаций, включающих или относящихся к этому виду16, и еще 102 статьи были опубликованы с начала 2022 года, согласно поиску PubMed, проведенному 9декабря 2022 года. Следующее наиболее изученное растение рода, P. major, является предметом только 414 статей при поиске с использованием тех же критериев в ту же дату.
Несмотря на исследовательский интерес к P. lanceolata, исследования, особенно по характеристике функций генов, часто ограничиваются отсутствием инструментария генетических манипуляций для вида. Pommerrienig et al. предприняли усилия по разработке протокола трансформации для P. major, используя технику цветочного погружения17. Однако этот метод не может быть применен к P. lanceolata из-за мужской стерильности, характерной для этого вида18,19. Насколько нам известно, не существует протокола трансформации P. lanceolata.
В этом исследовании представлен простой протокол для A. tumefaciens-опосредованной трансформации P. lanceolata. Воздействуя на корневые ткани, полностью выращенные трансгенные растения могут быть получены в течение 3 месяцев после трансформации.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom TubeA4A2:A34</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Naphthylacetic acid</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>N-780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Micropore Surgical Paper Tape</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>19-027761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>163227LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 Watt High Pressure Sodium Lights</td>
			<td>Plantmax</td>
			<td>PX-LU600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (6-BAP)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>B-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary Plasmid pBI101</td>
			<td>Clontech, USA&#160;</td>
			<td>632522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool White Grow Light Sylvania LLC</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>315952205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-biotin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP232-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5a E. coli&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA&#160;</td>
			<td>18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes, Sterile 150 x 16 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes, Sterile 95 x 15 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>38DI12044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2519-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>38DI18031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelrite</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>G35020-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>241261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated Tabletop Orbital Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>SHKE420HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indole-3-Acetic Acid (IAA)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indole-3-Butyric Acid (IBA)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>K-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrocentrifuge&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75007210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta Boxes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50255176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipet Tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipet Tips 200 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipette Tips 10 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor 0.5-10 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor 20-200 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor 2-20 &#181;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skooge Basal Medium with Vitamins</td>
			<td>PhytoTech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skooge Basal Salt Mixture</td>
			<td>PhytoTech</td>
			<td>M524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-Inositol</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0761-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (paraffin film)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>P44000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6280-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Handle</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>38DI36419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3802181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, Crystal (NaCl)</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>S24000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>23263068401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil- Bark Mix</td>
			<td>Berger, USA</td>
			<td>BM7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Pots (3.5 inches squared)</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-TRK-1835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>S24060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4625-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin Ticarcillin/Clavulanate (15/1) (Timentin)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>T-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-Zeatin Riboside (ZR)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>Z-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild Type Plantago lanceolata seeds</td>
			<td>Outsidepride Seed Source, OR, USA</td>
			<td>F1296</td>
			<td>Outsidepride.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Granulated</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>Y20025-1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of narrowleaf plantain

Виды рода Plantago обладают несколькими уникальными чертами, которые привели к тому, что они были адаптированы в качестве модельных растений в различных областях исследования. Однако отсутствие системы генетических манипуляций препятствует углубленному исследованию функции генов, ограничивая универсальность этого рода в качестве модели. Здесь представлен протокол трансформации для Plantago lanceolata, наиболее часто изучаемого вида Plantago. С помощью Agrobacterium tumefaciens-опосредованной трансформации 3-недельные корни асептически выращенных растений P. lanceolata заражали бактериями, инкубировали в течение 2-3 дней, а затем переносили в среду для индукции побегов с соответствующим подбором антибиотика. Побеги обычно появлялись из среды через 1 месяц, а корни развивались через 1-4 недели после того, как побеги были перенесены в среду для индукции корней. Затем растения акклиматизировали в почвенной среде и проверяли на наличие трансгена с помощью репортерного анализа β-глюкуронидазы (GUS). Эффективность трансформации текущего метода составляет ~ 20%, при этом на 10 трансформированных тканей корня появляются два трансгенных растения. Создание протокола трансформации подорожника узколистного облегчит принятие этого растения в качестве нового модельного вида в различных районах.

Здесь сообщается о простом протоколе получения трансгенных растений P. lanceolata с использованием A. tumefaciens-опосредованной трансформации. Репортерный ген GUS (кодирующий β-глюкуронидазу) трансформируется, движимый экспрессируемым флоэмой промотором AtPP2, в 3-недельные корни P. lanceolata через штамм A. tumefaciens GV3101 (рис. 2). Флоэм-специфический промотор был выбран потому, что наш основной интерес заключался в создании системы функциональной геномики сосудистых тканей растений, в частности флоэмы. Метод был протестирован на ткани корня, листа и черешка в предварительном эксперименте. Хотя мозоль может быть индуцирована во всех типах тканей, только корневая ткань продуцировала инициалы побегов (рис. 5A) через 1 месяц в SIM; лист и черешок побурели и отмерли (рис. 5Б). Это привело к выводу, что корневая ткань является оптимальным типом ткани для использования в методе трансформации. Корни инкубировали в подготовленных бактериях, ресуспендированных в суспензионном растворе (СС) (таблица 1) в течение не менее 20 мин, затем инкубировали при комнатной температуре на твердых пластинах СС до 3 дней в темноте (рис. 3E). Затем корни переносили в индукционную среду для побегов (SIM) и держали под растущим светом в условиях, указанных в протоколе (шаг 1.6). На рисунках 1 и 3 показаны репрезентативные изображения каждого шага протокола для справки.
На рисунке 6 показана прогрессия инициалов побегов, появляющихся из преобразованной ткани, с первого дня, когда корни были помещены на SIM (рис. 6A), до момента, когда побеги были готовы к укоренению (рис. 6D). Через 1 неделю в ткани корня образовалась каллус (рис. 6Б), и можно было наблюдать зачатки инициалов побегов (рис. 6В1). Всходы продолжали появляться в течение 2 и 3 недель (рис. 6C), а через 4 недели побеги были готовы к переносу в среду для индукции корней (рис. 6D).
Идентификация предполагаемых трансгенных растений проводилась с использованием гистохимического анализа β-глюкуронидазы (GUS) с использованием сегментов листьев, взятых после того, как побеги достигли длины около 0,5 см. Положительные трансгенные растения показали ожидаемую картину окрашивания в локализованной ткани флоэмы, показанную на рисунке 4. Побеги, окрашенные положительным GUS, были перенесены в среду для индукции корней, в которой через 4 недели у них развилась надежная корневая система (рис. 1E). Затем укоренившиеся растения переносили в почву. На рисунке 4 показан результат окрашивания в узколистном подорожнике, трансформированном промотором AtPP2 и геном β-глюкуронидазы (GUS), а также в подорожнике дикого типа и подорожнике узколистном, трансформированном промотором AtPP2 , для сравнения. Все появившиеся побеги были подтверждены как трансгенные. Было определено, что эффективность трансформации составляет в среднем 20%, при этом на каждые 10 преобразованных корней появляется примерно два побега. Подтвержденные трансгенные растения переносили в большие горшки и выращивали в течение 4-8 недель, пока они не достигли взрослой стадии (рис. 1F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig01.jpg"> Рисунок 1: Хронология трансформации подорожника ланцетного . Репрезентативные изображения каждого этапа протокола. (А) Непроросшие семена, нанесенные на тарелку МС. (B) Семена, проросшие через 1 неделю, готовы к переносу в пурпурные коробочки. (C) Растения в коробках MS после 3 недель роста. Корни зеленые и здоровые, на идеальной стадии преображения. (D) Побеги в индукционных средах через 4 недели готовы к переносу в среду для укоренения. На этом этапе можно провести гистохимическое окрашивание β-глюкуронидазы (GUS), если это применимо. (E) Растения в ящиках с индукционными средами для корней, где корни образовались после 4 недель роста. (F) Трансгенные растения выращиваются до полной длины после 4 недель роста в почве. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig02.jpg"> Рисунок 2: Диаграмма бинарной векторной плазмиды pBI101 + β-глюкуронидазы (GUS) со вставленным флоэм-специфическим промотором AtPP2. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig02large.jpg" target="_blank">нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig03.jpg"> Рисунок 3: Этапы трансформации. Репрезентативные изображения каждого шага трансформации. (А) Отделение корней от побегов во время трансформации. (B) Замачивание корней в суспензии бактерий / SS. (C) Сушка корней на бумажных полотенцах для удаления лишних бактерий. (D) Корни, нанесенные на среду для совместной культуры. (E) Пластины SS, завернутые в алюминиевую фольгу. Растения инкубировали в течение 2-3 дней перед переносом на съемочную среду. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig04.jpg"> Рисунок 4: GUS-окрашивание. Результаты окрашивания β-глюкуронидазы (GUS ) сегментов листьев подорожника узколистного. (А) Дикий тип. (B) Узколистный подорожник, трансформированный плазмидой, которая содержит промотор AtPP2 (пустой вектор). (C) Подорожник узколистный, трансформированный плазмидой, содержащей промотор AtPP2 и ген β-глюкуронидазы (GUS). Каждый лист окрашивали с использованием протокола гистохимического окрашивания GUS, а затем визуализировали с помощью микроскопической камеры. Изображения (B) и (C) не показывают окрашивания из-за отсутствия гена GUS. На правом изображении видно четкое синее окрашивание в прожилках, подтверждающее, что растения являются трансгенными. Стержень представляет собой 1 мм, при этом каждый сегмент листа имеет длину около 1 см. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig05.jpg"> Рисунок 5: Сравнение эффективности трансформации различных типов тканей после инкубации >1 месяца на съемочных средах . (A) Корневые ткани после роста более 1 месяца. Корни испытали расширенную мозоль, и появились инициалы побегов. Нетрансформированная мозоль начала отмирать в ответ на подбор антибиотиков. (B) Ткани листьев и черешков после роста более 1 месяца. Ткани испытали некоторое расширение мозоли, но вскоре умерли в ответ на антибиотик. Ни из одной из тканей не появилось ни одного побега. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig06.jpg"> Рисунок 6: Появление мозоли и побегов на трансформированной ткани. Репрезентативные изображения тканей, помещенных на съемочную среду после разной продолжительности инкубации. (A) Корневые ткани сразу после нанесения на стреляющую среду. (Б) Корневые ткани через 1 неделю на съемочной среде. Можно наблюдать расширение костной костли, и (B1) начали появляться первые инициалы побега. (С) Корневые ткани через 3 недели на съемочной среде. Появилось больше инициалов съемки. (С1) Побег, возникший из начального выстрела B1. (D) Ткани корня после 4 недель инкубации. Нетрансформированные ткани начали становиться черными/коричневыми и отмирать, а появляющиеся побеги продолжают расти. На этом этапе побеги готовы к перемещению в среду для укоренения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Таблица 1: Рецепты приготовления среды. Описание того, как подготовить медиумы к трансформации. Количество добавляемых витаминов рассчитывается исходя из указанной концентрации исходного раствора. В таблице 2 приведено приготовление раствора витаминного сырья. Для всех сред добавьте реагенты в 900 мл двойной дистилляции H2O, pH до указанного уровня, а затем добавьте воду до конечного объема 1000 мл. * = добавить после стерилизации. ** = рН с 1 М КОН. = рН с 1 М NaOH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777_Table%201_Media%20Preparation%20Recipes.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Таблица 2: Запасы витаминов для сред Plantago . Все витамины перед хранением должны быть отфильтрованы, стерилизованы и точно маркированы. Там, где указано, сначала растворите порошки в 1 N NaOH, затем заполните желаемый объем двойной дистиллированной H2O. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777_Table%202_Vitamin%20Stocks%20for%20Plantago%20Mediums.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain at JoVE.com

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

Из-за его универсального применения в качестве модельного вида в различных областях исследования существует необходимость в наборе инструментов генетической трансформации у подорожника узколистного (Plantago lanceolata). Здесь с использованием Agrobacterium tumefaciens-опосредованного превращения представлен протокол, в результате которого получаются стабильные трансгенные линии с эффективностью трансформации 20%.

Agrobacterium tumefaciens - опосредованная генетическая трансформация подорожника узколистного

Species in the genus Plantago have several unique traits that have led to them being adapted as model plants in various fields of study. However, the lack ...

Виды подорожника могут быть использованы в качестве модельных растений для сосудистой биологии растений и физиологии стресса. Создание протокола трансформации позволяет проводить углубленные исследования этих растений для изучения взаимосвязи между генами и связанным с ними фенотипом. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он использует продукты в качестве эксплантов для преобразования узколистного подорожника с высокой эффективностью.Для начала поместите имеющиеся в продаже семена подорожника ланцетного дикого типа в центрифугу объемом 50 миллилитров до отметки 5 миллилитров, в зависимости от желаемого количества растений. Погрузите семена в 75% этанол на 60 секунд. После выброса этанола погрузите семена в свежеприготовленный 20% гипохлорит натрия на 40 минут, осторожно перевернув трубку.Под проточным колпаком ламината выбросьте раствор гипохлорита натрия, затем промойте семена пять раз дистиллированной водой. Добавьте небольшое количество воды к семенам после окончательного ополаскивания, так как это может помочь перемещению растений на тарелки. Используя стерильные щипцы, перенесите семена на заранее подготовленную чашку Петри с твердой средой MS, равномерно распределив семена по поверхности пластины, примерно на 1 сантиметр между каждым семенем, чтобы предотвратить переполнение прорастающих сеянцев.Запечатайте пластину двумя слоями парафиновой пленки, чтобы предотвратить загрязнение, и инкубируйте под холодным белым светом для выращивания при комнатной температуре. Как только саженцы прорастут и станут достаточно большими для переноса, обычно после двух или трех дней прорастания, используйте стерильные щипцы и перенесите саженцы в стерильные коробки, содержащие от 50 до 100 миллилитров MS Medium. Заклейте коробки хирургической лентой и дайте растениям расти под прохладным белым светом в течение трех-четырех недель.Нанесите полосы Agrobacterium tumefaciens, содержащие желаемую плазмиду, на подготовленную твердую пластину LB с соответствующим селекционным агентом. Инкубируйте запечатанную парафином пластину при температуре 28 градусов Цельсия до 48 часов или до тех пор, пока бактерии не станут достаточно большими, чтобы их можно было собирать. После инкубации соберите колонию бактерий с помощью наконечника пипетки за два дня до трансформации и инокулируйте ее в 15-миллилитровую пробирку с круглым дном, содержащую шесть миллилитров жидкого LB, с соответствующим селекционным агентом.Встряхивайте при 200 об/мин в настольном шейкере с температурой 28 градусов Цельсия в течение ночи, пока OD 600 не достигнет 0.6–0.7. Как только бактерии достигнут требуемого OD, перенесите 200 микролитров бактериальной культуры в стерильную колбу, содержащую 100 миллилитров LB с селекционным агентом. Встряхните со скоростью 200 об/мин при 28 градусах Цельсия на ночь.Затем переложите бактериальную культуру в стерильные центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров и центрифугу при 2 200 г в течение 10 минут при комнатной температуре для сбора бактерий. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте бактериальную гранулу в пяти миллилитрах свежеприготовленного раствора суспензии или SS при комнатной температуре путем пипетки. Затем добавьте еще SS до отметки 50 миллилитров и переверните несколько раз, чтобы перемешать.Как только растения достигнут идеальной стадии трансформации, примерно через три недели, используйте стерильные щипцы и ножницы, чтобы отделить корни от растения и выбросить листовой и стеблевой материал. Сразу после срезания асептически перенесите кусочки корня в ящики со стерильной водой с помощью щипцов, чтобы они не обезвоживались. Затем перелейте суспендированную бактериальную культуру SS Agrobacterium tumefaciens в стерильные одноразовые чашки Петри размером 150 на 15 миллиметров.Перенесите срезанные корни в бактериальную культуру и выдерживайте не менее 20 минут. Во время инкубации стерильным скальпелем с острым лезвием разрежьте корни на односантиметровые фрагменты, отделяющие первичные корни от боковых. Затем сделайте тонкие неглубокие надрезы на поверхности корней, чтобы позволить бактериям заразить растение.После инкубации переложите кусочки корня на стерильные бумажные полотенца, чтобы удалить лишние бактерии. Затем перенесите высушенные корни в подготовленные чашки Петри, содержащие твердые среды для совместной культуры, от 10 до 20 корней на тарелку, в зависимости от размера корней. Запечатайте пластины двумя слоями прозрачной пластиковой пленки, а затем алюминиевой фольгой для инкубации при комнатной температуре в течение трех дней.После трех дней инкубации. В средах для совместной культуры перенесите кусочки корня в подготовленные чашки Петри с твердой индукционной средой или SIM с 500 миллиграммами на литр теметина и соответствующим подбором антибиотиков. Инкубируйте прозрачные пластиковые пластины, закрытые пленкой, под растущим светом в течение одного месяца или до тех пор, пока не начнут появляться всходы.После того, как ростки вырастут от 1,5 до 2,0 сантиметров в длину. Переложите их в подготовленные стерильные коробки. С твердыми корневыми индукционными средами.Выращивайте растения под растущим светом в течение нескольких недель, пока не образуются корни. Как правило, через неделю, когда корневые системы становятся достаточно большими, чтобы их можно было переносить, как правило, через месяц роста, возьмите растение и осторожно промойте корни водой, чтобы удалить любую среду, которая прилипает к корням. Затем переложите растения в квадратные горшки диаметром 3,5 дюйма, содержащие предварительно увлажненную универсальную почву, накройте растения пластиковой крышкой, а затем прозрачным пластиковым пакетом, чтобы растения оставались во влажной среде.Этот метод был опробован на корневом листе и мелких старых тканях. В предварительном эксперименте, хотя мозоль могла быть индуцирована во всех типах тканей, только корневая ткань произвела инициалы побегов через один месяц в SIM, лист и педаль стали коричневыми и умерли. Прогрессирование инициалов побегов, выходящих из трансформированной ткани, наблюдалось с первых суток.Корни помещали на SIM-карту до тех пор, пока побеги не были готовы к укоренению. Через неделю в корневой ткани образовалась мозолистая в начале побега инициалы. Всходы продолжали появляться в течение второй и третьей недель, а через четыре недели побеги были готовы к переносу в среду для индукции корней.Идентификация карательных трансгенных растений проводилась с использованием гистохимического анализа бета-глюкуронидазы GUS с использованием сегментов листьев, взятых после того, как побеги достигли длины около 0,5 сантиметра. Дикий тип в преобразовании с пустыми векторами не показывает узор окрашивания. Из-за отсутствия гена GUS трансформация с геном GUS бета-глюкуронидазы показала четкий синий окрас в венах, подтверждающий, что растения являются трансгенными. Корни всегда следует держать гидратированными, чтобы предотвратить высыхание во время процедуры. Переносите корни примерно по 10 за раз, чтобы предотвратить это.

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Агробактериальной вирус-индуцированного Пробирной Отключение гена В Хлопок

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Оптимизация и использование<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Опосредованного переходных Белок Производство в<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

ДНК Электропорация, Изоляция и изображений из мышечных волокон

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium- Посредника незрелых эмбрионов Преобразование непокорных кукурузы инбредных линий с использованием морфогенных генов

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Подготовка и инъекция эмбрионов комаров Culex для генерации нулевых мутаций с использованием CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Опосредованная генетическая трансформация, трансгенное производство и его применение для изучения репродуктивного развития мужчин в рисе

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

One-Step Hairy Root Transformation Method for Advancing Root-Related Biology

An Efficient and Reproducible Method for Producing Composite Plants by Agrobacterium rhizogenes-Based Hairy Root Transformation

Streamlining Composite Plant Production via Agrobacterium rhizogenes-Mediated Hairy Root Transformation (Video) | JoVE

Эффективный и воспроизводимый метод получения сложных растений путем трансформации волосистых корней на основе Agrobacterium rhizogenes

Producing composite plants with transgenic roots and nontransgenic stems and buds using Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation is a ...