Name: application of the intelligent high-throughput antimicrobial sensitivity testing/phage screening system and lar index of antimicrobial resistance
Uploaded: 2023-07-21T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of the Intelligent High-Throughput Antimicrobial Sensitivity Testing/Phage Screening System and Lar Index of Antimicrobial Resistance at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Key Research and Development Project (2019YFA0904003); Moderne landbrugsindustrielt system i Shandong-provinsen (SDAIT-011-09); Optimeringsprojekt for international samarbejdsplatform (CXGC2023G15); Større innovationsopgaver inden for landbrugsvidenskab og teknologisk innovationsprojekt fra Academy of Agricultural Sciences Shandong, Kina (CXGC2023G03).

De salmonellastammer, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev indsamlet fra fjerkræ i Shandong, Kina, efter at have opnået godkendelse fra Biosafety Committee of Institute of Animal Sciences and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Kina.
1. Anvendelse af det intelligente AST-system med høj kapacitet8
<ol><li>Forberedelse af podning<ol><li>Kvalitetskontrolorganismen Escherichia coli og 93 salmone...

<ol>
	<li>Ramanan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+resistance-the+need+for+global+solutions.">Antimicrobial resistance-the need for global solutions.</a> The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).</li><li>Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=inPhocus:+Perspectives+of+the+application+of+bacteriophages+in+poultry+and+aquaculture+industries+based+on+Varms+in+China.">inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China.</a> PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , (2022).</li><li>Yuqing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , (2017).</li><li>Barnini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+method+for+direct+antimicrobial+susceptibility+testing+of+bacteria+from+positive+blood+cultures.">A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).</li><li>H&#246;ring, S., Massarani, A. S., L&#246;ffler, B., R&#246;del, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+antimicrobial+susceptibility+testing+in+blood+culture+diagnostics+performed+by+direct+inoculation+using+the+VITEK&#174;-2+and+BD+PhoenixTM+platforms.">Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK&#174;-2 and BD PhoenixTM platforms.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).</li><li>Dupuis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Cobasbact+automated+antimicrobial+susceptibility+testing+system.">Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+bacterial+antimicrobial+resistance+detection+and+its+operation+method.">A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method.</a> China Patent. , (2019).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+test+plate+for+screening+bacteriophage+of+zoonotic+pathogens+and+its+application.">A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application.</a> China Patent. , (2022).</li><li>Adams, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteriophages. , (1959).</li><li>Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+appraisal+of+bacteriophage+isolation+techniques+from+environment.">An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment.</a> Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Shandong veterinary antibiotic resistance system. , (2023).</li><li>Ming, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+results+of+96-dot+agar+dilution+method+and+broth+microdilution+method.">Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method.</a> Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).</li><li>Laxminarayan, R., Klugman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+trends+in+resistance+using+a+drug+resistance+index.">Communicating trends in resistance using a drug resistance index.</a> BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+antibiotic+therapy+effectiveness+against+the+major+bacterial+pathogens+in+a+hospital+using+an+integrated+index.">Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index.</a> Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).</li><li>Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+index-based+approach+to+assess+the+population-level+appropriateness+of+empirical+antibiotic+therapy.">Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).</li><li>Yanbo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+application+of+inoculation+system+for+high-throughput+drug+susceptibility+test.">Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test.</a> China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).</li></ol>

Agarfortyndingsmetoden er veletableret og anvendes bredt. Princippet i AST-systemet med høj kapacitet var agarfortyndingsmetoden. Et af de kritiske trin i protokollen var den nøjagtige overførsel med høj gennemstrømning af 96 inokula ad gangen, som blev udført flere gange i træk. For at fuldføre dette kritiske trin var stifterne på 96-punkts matrixinokulatoren ensartede og meget glatte. Den naturlige aflejring af hver stift var et volumen på ca. 2 μL, som aggregerede i små dråber på overfladen af agarmediet...

Da antimikrobielle stoffer i vid udstrækning er blevet anvendt til forebyggelse af bakterielle infektionssygdomme, er antimikrobiel resistens (AMR) blevet et globalt folkesundhedsproblem1. Bekæmpelse af antimikrobiel resistens er den nuværende hovedopgave med overvågning af epidemiologiske patogeners antimikrobiel resistens og synergistisk behandling af følsomme antimikrobielle stoffer og lytiske bakteriofaer2.
In vitro-test for antimikrobiel følsomhed (ASAT) er grundpillen i overvågningen af behandlingen og påvisningen af AMR-niveauet. Det er en vigtig del af antimikrobiel farmakologi og det kritiske grundlag for klinisk medicinering. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) i USA og European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) har formuleret og revideret internationale AST-kriterier og løbende ændret og suppleret AST-metoder og breakpoints til bestemmelse af MIC for en bestemt kombination af "organism-antimikrobielt stof" som følsom (S), resistent (R) eller intermediær (I)3. 4.
Fra 1980'erne til 1990'erne blev automatiske mikro bouillonfortyndingsinstrumenter hurtigt udviklet og anvendt til klinisk praksis, med eksempler som Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM og Cobasbact 5,6,7. Disse instrumenter var imidlertid dyre, krævede dyre forbrugsstoffer, og deres detektionsområder var designet til klinisk patientmedicin 5,6,7. Af disse grunde er de ikke egnede til veterinær klinisk undersøgelse og påvisning af store mængder stærkt resistente stammer. I denne undersøgelse blev der udviklet et intelligent AST/fagscreeningssystem med høj kapacitet, herunder en 96-punkts matrixinokulator (figur 1), billedoptagelseskonverter (figur 2) og tilsvarende software8, til at udføre AST for et parti bakteriestammer mod flere antimikrobielle midler ad gangen ved agarfortyndingsmetoden. Desuden blev systemet også brugt til at detektere og analysere fagernes lyseringsmønstre mod antibiotikaresistente bakterier9, og lytiske fager blev valgt effektivt fra fagbiblioteket. Dette system viste sig at være effektivt, overkommeligt og let at betjene.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64785/64785fig01.jpg"> Figur 1: Strukturdiagram over 96-punkts matrixinokulatoren. 1: Inokulationsstiftplade; 2: Mobiloperatør; 3: Frøblok; 4: Inkuberet plade; 5: Grundlag; 6: Betjening af håndtag; 7: Begræns stift. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64785/64785fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64785/64785fig02.jpg"> Figur 2: Strukturdiagram over billedoptagelseskonverteren. 1: Skal; 2: Skærm; 3: Billedoptagelsesrum; 4: Detekteringstavle base; 5: Detekteringstavle ind og ud af lager; 6: Kontrolkort; 7: Enhed til konvertering af billedoptagelse; 8: Lyskilde; 9: Billedscanner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64785/64785fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well&#160; culture plate</td>
			<td>Beijing lanjieke Technology Co., Ltd</td>
			<td>11510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-dot matrix AST image acquisition system</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-dot matrix inoculator&#160;</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Patented product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>HB8274-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amikacin&#160;</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>A857053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicillin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>A822839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>A830931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA224S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated calculation software for Lar index of AMR</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria Salmonella strains</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Animal origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftiofur</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C873619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C824343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clavulanic acid</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C824181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean worktable</td>
			<td>Suzhou purification equipment Co., Ltd</td>
			<td>SW-CJ-2D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colistin sulfate</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C805491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plate</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Patented product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>D832390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>E809130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Florfenicol</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>F809685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>G810322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle 50 mL</td>
			<td>Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd</td>
			<td>QX-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-throughput resistance detection system V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition converter</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Patented product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meropenem</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>M861173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton agar</td>
			<td>Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>HB6232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd</td>
			<td>16021-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 90 mm x 15 mm</td>
			<td>Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd</td>
			<td>16001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella phages</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd</td>
			<td>MQD-S2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbidimeter</td>
			<td>Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>F-TC2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varms base type library system V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical high-pressure steam sterilizer</td>
			<td>Shanghai Shen&#39;an medical instrument factory</td>
			<td>LDZX-75L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veterinary pathogen resistance testing management system</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of the intelligent high-throughput antimicrobial sensitivity testing/phage screening system and lar index of antimicrobial resistance

For at forbedre effektiviteten af antimikrobiel følsomhedstest (AST) og-high-throughput screening for resistente bakterier og for at reducere detektionsomkostningerne blev der udviklet et intelligent AST/fagscreeningssystem med høj kapacitet, herunder en 96-punkts matrixinokulator, billedoptagelseskonverter og tilsvarende software, i henhold til AST-kriterier og brudpunkterne for resistens (R) formuleret af Clinical &; Laboratory Standards Institute (CLSI). ASAT og statistik over fordeling af mindste hæmmende koncentration (MIC) (fra R/8 til 8R) af 1.500 salmonellastammer isoleret fra fjerkræ i Shandong, Kina, mod 10 antimikrobielle stoffer blev udført af det intelligente AST/fagscreeningssystem med høj kapacitet. Lar-indekset, der betyder "mindre antibiose, mindre resistens og resterende indtil lidt antibiose", blev opnået ved at beregne det vægtede gennemsnit af hver MIC og dividere med R. Denne fremgangsmåde forbedrer nøjagtigheden sammenlignet med at anvende forekomsten af resistens til at karakterisere graden af antimikrobiel resistens (AMR) af stærkt resistente stammer. For stammerne af salmonella med høj AMR blev lytiske fager effektivt screenet fra fagbiblioteket af dette system, og lysisspektret blev beregnet og analyseret. Resultaterne viste, at det intelligente AST/fagscreeningssystem med høj kapacitet var funktionsdygtigt, nøjagtigt, yderst effektivt, billigt og let at vedligeholde. Kombineret med Shandongs veterinære overvågningssystem for antimikrobiel resistens var systemet egnet til videnskabelig forskning og klinisk påvisning relateret til AMR.

I overensstemmelse med protokollen for det intelligente AST-system med høj kapacitet blev dets anvendelse illustreret med salmonella fra fjerkræ i Shandong i Kina, som et eksempel.
Væksten af salmonellastammer på agarplader med ampicillin (R på 32 μg/ml) i koncentrationer fra 2 til 256 μg/ml bestemt af billedoptagelseskonverteren er vist i figur 3. Den vandrette 1. brønd A1 var den negative kontrol og viste ingen kolonivækst; ...

Watch this Scientific Journal Video about Application of the Intelligent High-Throughput Antimicrobial Sensitivity Testing/Phage Screening System and Lar Index of Antimicrobial Resistance at JoVE.com

Application of the Intelligent High-Throughput Antimicrobial Sensitivity Testing/Phage Screening System and Lar Index of Antimicrobial Resistance

Her introducerer vi princippet, strukturen og instruktionen af det intelligente high-throughput antimikrobielle følsomhedstest/fagscreeningssystem. Dens anvendelse illustreres ved at bruge salmonella isoleret fra fjerkræ i Shandong, Kina, som et eksempel. Lar-indekset beregnes, og dets betydning for evaluering af antibiotikaresistens diskuteres udførligt.

Anvendelse af det intelligente antimikrobielle følsomhedstestsystem med høj kapacitet/fagscreeningssystemet og Lar-indekset for antimikrobiel resistens

To improve the efficiency of antimicrobial susceptibility testing (AST) and phage high-throughput screening for resistant bacteria and to reduce the ...

Denne protokol præsenterer en metode på flere niveauer, både til EST-detektion og fagfiguren. Det introducerede også stort indeks for besparelser for at sammenligne EMR-niveauer af forskellige kontrolteknologier. Denne omkostningseffektive teknik er intelligent, høj kapacitet og multifunktionel.Det har gjort det muligt at oprette VAMS, et veterinært overvågningsnetværk, der har indsamlet 20.000 epidemiske gener og analytiske fager. Denne metode kan også bruges til overvågning og bekæmpelse af patogene bakterier inden for medicin, landbrug, dyrehjertebatteri og fiskeri. Denne protokol og dette selskabsdokument skal indeholde bestemmelser om at være en.Vi med teknisk træningsguide. At følge det ville hjælpe enhver med at mestre teknikken på kort tid. Begynd med at inkubere kvalitetskontrolorganismen E. coli og 93 test salmonellastammer på Mueller-Hinton agarplader.Fortynd derefter det forberedte inokulum af hver stamme 10 gange. Overfør 200 mikroliter steril normal saltvand til a-1-brønden på en 96 brøndplade som den negative kontrol. Derefter pipetteres to suspensioner af E. coli i a-2 og a-3 brøndene som henholdsvis positiv og kvalitetskontrol.Til de resterende 93 brønde tilsættes 200 mikroliter af den fortyndede teststamme. Til fremstilling af de antimikrobielle agarplader. Indstil først koncentrationsområderne for de forskellige antibakterielle midler, der testes, i henhold til LAR-indekset.Der udføres et log-to-fordoblingsfortyndingsskema for antibiotikaopløsningen efter CLSI-standardagarfortyndingsmetoden. Tilsæt nu to milliliter af den antimikrobielle opløsning til en steriliseret glasflaske indeholdende 18 ml smeltet Mueller-Hinton agarmedier. Efter grundig blanding hældes i plader inde i et biosikkerhedsskab.Lad agaren størkne ved stuetemperatur. Sørg for at efterlade et hul under låget på pladerne for at muliggøre tørring af agaroverfladen. Mærk typerne af antimikrobielle stoffer og deres respektive koncentrationer på undersiden af de inkuberede plader.De mange inkuberede plader for hvert antimikrobielt middel anbringes i en stak arrangeret i logbog to fordoblingsfortyndingsrækkefølge. Til sidst skal du forberede to lægemiddelfrie agarplader til at fungere som kontrol for hvert middel. Installer en steriliseret podningsstiftplade på understøttelsen af en 96 dot matrixinokulator i et biosikkerhedsskab.Derefter arrangeres den forberedte frøblok med testede stammer og en agarinkuberet plade på mobilbæreren. Skub mobilbæreren, indtil frøblokken er under podningsstiftpladen. Tryk nu på betjeningshåndtaget, og sænk podningsstiftpladen, og led de 96 stifter mod podematerialet i frøblokkens 96 brønde.Slip betjeningshåndtaget på en kontrolleret måde, og nulstil automatisk podningsstiftpladen for at røre hvert podemateriale godt og dyppe, skub betjeningshåndtaget to til tre gange. Derefter skal du skifte og placere bærepladen, så inkubationspladen er under podningsstiftpladen. Tryk betjeningshåndtaget ned, sænk podningsstiftpladen og lad den stå i et til to sekunder for at sikre fuld kontakt med overfladen af den inkuberede plade.Slip betjeningshåndtaget for at fuldføre en podningsrunde. Den inkuberede plade udskiftes, og processen gentages, indtil partiet af antimikrobielle agarplader er afsluttet. Skift til en ny podningsstiftplade og frøblok for at inokulere en anden gruppe testede stammer.De podede antimikrobielle agarplader inkuberes ved stuetemperatur, indtil fugt fra podepletterne er fuldstændigt absorberet i agaren. Efter inkubation vendes pladerne og fortsætter inkubationen for at tillade uhæmmede bakterier at danne kolonier. For at udføre billedindsamling og datastatistik skal du starte med at klikke på 96 dot matrix AST-billedoptagelsessystemet for at starte programmet.Vælg testoplysninger på proceslinjen. Klik på ny for at oprette en ny testopgave og udfylde de nødvendige oplysninger. Tryk derefter på dataindsamling efterfulgt af foto og testelement for at vælge den nyoprettede opgave.Vælg antibiotika for at vælge antibiotikanavn og gradient for at vælge den oprindelige koncentration af antibiotika. Klik til sidst på opret forbindelse for at oprette forbindelse til billedoptagelseskonverteren. Placer derefter de inkuberede plader på detekteringspladebasen, og indsæt dem i billedoptagelseskonverteren.Klik på samlingen for at tage billeder af pladerne. Tryk på antibiotika, og vælg det næste sæt plader. Vælg graduering for at identificere startforløbet, og fortsæt derefter til næste runde af billedindsamling.Afslut proceduren ved at klikke på send for at bestemme kolonidannelse og konvertere billeder til minimale hæmmende koncentrationer, det vil sige MIC-værdier. Klik på forespørgslen for at få adgang til alle MIC-resultater. Begynd med at bruge dobbeltlags agarmetoden til at producere forskellige fager.Fortynd fagerne til en passende parallel koncentration og tilsæt 200 mikroliter faginokulum i 96 brøndfrøblokken. Derefter fremstilles en dobbeltlags inkuberet plade for hver stamme, der skal undersøges. Efterlad et hul under låget på den dobbeltlagede plade for at muliggøre tørring.Anbring den forberedte fagfrøblok og dobbeltlagspladen på mobilbæreren på 96 dot matrix-inokulatoren. Overfør al faginokulær til halvagaroverfladen. Lad pladerne forblive ved stuetemperatur, indtil al inokulær fugt er absorberet i halvagaren.Inkuber nu pladerne ved 37 grader Celsius for de testede stammer i fire til seks timer. Brug konverteringsprogrammet til billedoptagelse til at hente og gemme billedet af det eksperimentelle resultat af hver dobbeltlagsplade. Optag antallet og morfologierne af de forskellige spotformer i et regneark baseret på de opnåede billeder, og beregn de respektive proportioner af de forskellige typer fager.Morfologisk undersøgelse af salmonellavækst på plader med ampicillin viste, at den negative kontrol i a-1 ikke viste nogen vækst. MIC for salmonellastammen i a-4 var 64 mikrogram pr. milliliter, mens den for a-5 var 16 mikrogram pr. milliliter. De procentvise resistensværdier for ampicillin, ciprofloxacin og amoxicillin-clavulansyre var højere end 50%Mens doxycyclin, florfenicol, cefotaxim og enrofloxacin var 30% til 50%Gentamicin, amikacin og meropenem viste procentvise resistensværdier på mindre end 30%LAR-indekserne for ciprofloxacin og amoxicillin-clavulansyre udskudt signifikant.Morfologiske analyser af salmonellavækst på dobbeltlagsplader viste, at der blev observeret fire hovedpletmorfologi af fager. Den runde klare lytiske plet var fra en, der pålideligt kunne dræbe værten på pladen, men som måske eller måske ikke med succes replikerer på værtens bekostning. Samlingen af plaques blev dannet af ægte plaques.Den uklare lytiske plet skyldtes en, der ikke pålideligt dræbte værten på pladen, og som måske eller måske ikke med succes replikerer på værtens bekostning. Den ingen lytiske plet indikerede ikke-lytisk natur. Denne teknik overfører nemt og effektivt 96 agarobjektiver på én gang, og instrumenterne genkender automatisk billeder og beregner derefter linjeterningerne.Denne teknologi forventes at fremme forskning og industrialisering af fager, og anvendelsen af fager er en af de fantastiske måder at reducere og løse problemet med AMR på.

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Bestemmelse af Mikrobiel Extracellular enzymaktivitet i Vand, Jord og sediment ved hjælp af High Throughput Mikropladekrav Analyser

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

High-throughput Fluorometric Måling af Potentiel Jord Ekstracellulære enzymaktiviteter

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimeret negativ farvning: en High-throughput protokol for behandlingen Små og asymmetrisk proteiners struktur ved elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Anvendelsen af ​​to bønnespindemide<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; For Plant-pest Interaktionsundersøgelser

The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae, is a ubiquitous polyphagous arthropod herbivore that feeds on a remarkably broad array of species, with ...

Modifying the Bank Erosion Hazard Index (BEHI) Protocol for Rapid Assessment of Streambank Erosion in Northeastern Ohio

Modifying the Bank Erosion Hazard Index BEHI Protocol for Rapid Assessment of Streambank Erosion in Northeastern Ohio

Ændring af brederosion Hazard Index (Behi) Protokol til hurtig vurdering af Streambank Erosion i det nordøstlige Ohio

Understanding the source of pollution in a stream is vital to preserving, restoring, and maintaining the stream&#8217;s function and habitat it provides. ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

Semi-højkapacitetsscreening for Potentiel tørke-tolerance i salat (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) kimplasmasamlinger

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

High-throughput screening af Modstridigheden Variationer i lignocelluloseholdige biomasse: Total Lignin lignin Monomerer og enzymatisk Sugar Frigivelse

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

The Effect of the Application of Thyme Essential Oil on Microbial Load During Meat Drying

Effekten af anvendelsen af timian æteriske olie på mikrobielle belastning under kød tørring

Meat is a high protein meal that is used in the preparation of jerky, a popular food snack, where preservation and safety are important. To assure food ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plante infektion Test: Spray og sår-medieret podning med plante patogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Høj overførselshastighed, individuel protokol for analyse af behandling parametre og ernæringsmæssige kvaliteter i majs (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...