Name: application of the intelligent high-throughput antimicrobial sensitivity testing/phage screening system and lar index of antimicrobial resistance
Uploaded: 2023-07-21T14:45:00
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Ces travaux ont été financés par le Projet national de recherche et de développement clé (2019YFA0904003) ; Système industriel agricole moderne dans la province du Shandong (SDAIT-011-09) ; Projet d’optimisation de la plate-forme de coopération internationale (CXGC2023G15) ; Principales tâches d’innovation du projet d’innovation en sciences et technologies agricoles de l’Académie des sciences agricoles du Shandong, Chine (CXGC2023G03).

Les souches de Salmonella utilisées dans cette étude ont été prélevées sur des volailles du Shandong, en Chine, après avoir obtenu l’approbation du Comité de biosécurité de l’Institut des sciences animales et de médecine vétérinaire de l’Académie des sciences agricoles du Shandong, en Chine.
1. Application du système AST intelligent à haut débit8
<ol><li>Préparation de l’inoculum<ol><li>Incuber l’organisme de contr...

<ol>
	<li>Ramanan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+resistance-the+need+for+global+solutions.">Antimicrobial resistance-the need for global solutions.</a> The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).</li><li>Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=inPhocus:+Perspectives+of+the+application+of+bacteriophages+in+poultry+and+aquaculture+industries+based+on+Varms+in+China.">inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China.</a> PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , (2022).</li><li>Yuqing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , (2017).</li><li>Barnini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+method+for+direct+antimicrobial+susceptibility+testing+of+bacteria+from+positive+blood+cultures.">A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).</li><li>H&#246;ring, S., Massarani, A. S., L&#246;ffler, B., R&#246;del, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+antimicrobial+susceptibility+testing+in+blood+culture+diagnostics+performed+by+direct+inoculation+using+the+VITEK&#174;-2+and+BD+PhoenixTM+platforms.">Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK&#174;-2 and BD PhoenixTM platforms.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).</li><li>Dupuis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Cobasbact+automated+antimicrobial+susceptibility+testing+system.">Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+bacterial+antimicrobial+resistance+detection+and+its+operation+method.">A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method.</a> China Patent. , (2019).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+test+plate+for+screening+bacteriophage+of+zoonotic+pathogens+and+its+application.">A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application.</a> China Patent. , (2022).</li><li>Adams, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteriophages. , (1959).</li><li>Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+appraisal+of+bacteriophage+isolation+techniques+from+environment.">An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment.</a> Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Shandong veterinary antibiotic resistance system. , (2023).</li><li>Ming, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+results+of+96-dot+agar+dilution+method+and+broth+microdilution+method.">Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method.</a> Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).</li><li>Laxminarayan, R., Klugman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+trends+in+resistance+using+a+drug+resistance+index.">Communicating trends in resistance using a drug resistance index.</a> BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+antibiotic+therapy+effectiveness+against+the+major+bacterial+pathogens+in+a+hospital+using+an+integrated+index.">Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index.</a> Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).</li><li>Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+index-based+approach+to+assess+the+population-level+appropriateness+of+empirical+antibiotic+therapy.">Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).</li><li>Yanbo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+application+of+inoculation+system+for+high-throughput+drug+susceptibility+test.">Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test.</a> China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).</li></ol>

La méthode de dilution de la gélose est bien établie et largement utilisée. Le principe du système AST à haut débit était celui de la méthode de dilution sur gélose. L’une des étapes critiques du protocole a été le transfert précis à haut débit de 96 inocula en une seule fois, qui a été effectué plusieurs fois de suite. Pour compléter cette étape critique, les broches de l’inoculateur matriciel à 96 points étaient uniformes et très lisses. Le dépôt naturel de chaque broche était d’un volu...

Les agents antimicrobiens ayant été largement utilisés pour prévenir les maladies infectieuses bactériennes, la résistance aux antimicrobiens (RAM) est devenue un problème de santé publique mondial1. La lutte contre la résistance aux antimicrobiens est actuellement la mission principale de surveillance de la résistance aux antimicrobiens des agents pathogènes épidémiologiques et de la thérapie synergique des agents antimicrobiens sensibles et des bactériophages lytiques2.
Les tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST) in vitro sont le pilier de la surveillance du traitement et de la détection du niveau de résistance aux antimicrobiens. Il s’agit d’une partie importante de la pharmacologie antimicrobienne et de la base essentielle de la médication clinique. Le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) des États-Unis et l’European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) ont formulé et révisé les critères internationaux de l’AST et modifié et complété en permanence les méthodes AST et les points de rupture pour déterminer la CMI d’une certaine combinaison « organisme-agent antimicrobien » comme sensible (S), résistante (R) ou intermédiaire (I)3, 4. Le
Des années 1980 aux années 1990, les instruments automatiques de dilution du micro-bouillon ont été rapidement développés et appliqués à la pratique clinique, avec des exemples tels que Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM et Cobasbact 5,6,7. Cependant, ces instruments étaient coûteux, nécessitaient des consommables coûteux et leurs plages de détection étaient conçues pour les médicaments cliniquesdes patients 5,6,7. Pour ces raisons, ils ne sont pas adaptés à l’examen clinique vétérinaire et à la détection de grandes quantités de souches hautement résistantes. Dans cette étude, un système intelligent de criblage AST/phages à haut débit, comprenant un inoculateur matriciel à 96 points (Figure 1), un convertisseur d’acquisition d’images (Figure 2) et le logiciel correspondant8, a été mis au point pour effectuer une AST pour un lot de souches bactériennes contre plusieurs agents antimicrobiens à la fois par la méthode de dilution sur gélose. De plus, le système a également été utilisé pour détecter et analyser les schémas de lyse des phages contre les bactéries résistantes aux antimicrobiens9, et les phages lytiques ont été sélectionnés efficacement dans la bibliothèque de phages. Ce système s’est avéré efficace, abordable et facile à utiliser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64785/64785fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma structurel de l’inoculateur matriciel à 96 points. 1 : Plaque d’épingle d’inoculation ; 2 : Opérateur mobile ; 3 : Bloc de semences ; 4 : Plaque incubée ; 5 : Base ; 6 : Poignée de commande ; 7 : Goupille de limite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64785/64785fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64785/64785fig02.jpg"> Figure 2 : Schéma structurel du convertisseur d’acquisition d’images. 1 : Coquille ; 2 : Écran d’affichage ; 3 : Salle d’acquisition d’images ; 4 : Base de la carte de détection ; 5 : Panneau de détection à l’intérieur et à l’extérieur de l’entrepôt ; 6 : Panneau de commande ; 7 : Dispositif de conversion d’acquisition d’images ; 8 : Source de lumière ; 9 : Scanner d’images. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64785/64785fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well&#160; culture plate</td>
			<td>Beijing lanjieke Technology Co., Ltd</td>
			<td>11510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-dot matrix AST image acquisition system</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-dot matrix inoculator&#160;</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Patented product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>HB8274-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amikacin&#160;</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>A857053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicillin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>A822839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>A830931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA224S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated calculation software for Lar index of AMR</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria Salmonella strains</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Animal origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftiofur</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C873619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C824343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clavulanic acid</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C824181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean worktable</td>
			<td>Suzhou purification equipment Co., Ltd</td>
			<td>SW-CJ-2D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colistin sulfate</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C805491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plate</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Patented product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>D832390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>E809130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Florfenicol</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>F809685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>G810322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle 50 mL</td>
			<td>Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd</td>
			<td>QX-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-throughput resistance detection system V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition converter</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Patented product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meropenem</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>M861173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton agar</td>
			<td>Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>HB6232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd</td>
			<td>16021-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 90 mm x 15 mm</td>
			<td>Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd</td>
			<td>16001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella phages</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd</td>
			<td>MQD-S2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbidimeter</td>
			<td>Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>F-TC2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varms base type library system V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical high-pressure steam sterilizer</td>
			<td>Shanghai Shen&#39;an medical instrument factory</td>
			<td>LDZX-75L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veterinary pathogen resistance testing management system</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of the intelligent high-throughput antimicrobial sensitivity testing/phage screening system and lar index of antimicrobial resistance

Afin d’améliorer l’efficacité des tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST) et du criblage à haut débit des phages pour les bactéries résistantes et de réduire le coût de détection, un système intelligent de criblage AST/phages à haut débit, comprenant un inoculateur matriciel à 96 points, un convertisseur d’acquisition d’images et le logiciel correspondant, a été développé selon les critères AST et les points de rupture de résistance (R) formulés par le Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI). L’AST et les statistiques de distribution de la concentration minimale inhibitrice (CMI) (de R/8 à 8R) de 1 500 souches de Salmonella isolées de volailles dans le Shandong, en Chine, contre 10 agents antimicrobiens ont été réalisées par le système intelligent de criblage AST/phages à haut débit. L’indice Lar, qui signifie « moins d’antibiose, moins de résistance et résiduel jusqu’à peu d’antibiose », a été obtenu en calculant la moyenne pondérée de chaque CMI et en divisant par R. Cette approche améliore la précision par rapport à l’utilisation de la prévalence de la résistance pour caractériser le degré de résistance aux antimicrobiens (RAM) des souches hautement résistantes. Pour les souches de Salmonella présentant une résistance aux antimicrobiens élevée, les phages lytiques ont été efficacement criblés à partir de la bibliothèque de phages par ce système, et le spectre de lyse a été calculé et analysé. Les résultats ont montré que le système intelligent de criblage AST/phages à haut débit était opérationnel, précis, très efficace, peu coûteux et facile à entretenir. Combiné au système vétérinaire de surveillance de la résistance aux antimicrobiens du Shandong, le système était adapté à la recherche scientifique et à la détection clinique liée à la résistance aux antimicrobiens.

Suivant le protocole du système AST intelligent à haut débit, son application a été illustrée par Salmonella provenant de volailles du Shandong, en Chine, à titre d’exemple.
La figure 3 montre la croissance de souches de Salmonella sur des plaques de gélose contenant de l’ampicilline (R de 32 μg/mL) à des concentrations de 2 à 256 μg/mL déterminées par le convertisseur d’acquisition d’images. Le1er puits horizonta...

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Application of the Intelligent High-Throughput Antimicrobial Sensitivity Testing/Phage Screening System and Lar Index of Antimicrobial Resistance

Nous présentons ici le principe, la structure et l’instruction du système intelligent de test de sensibilité antimicrobienne à haut débit / criblage des phages. Son application est illustrée par l’utilisation de Salmonella isolée de volailles dans le Shandong, en Chine, à titre d’exemple. L’indice Lar est calculé, et son importance dans l’évaluation de la résistance aux antimicrobiens est discutée de manière approfondie.

Application du système intelligent de test de sensibilité aux antimicrobiens/criblage des phages à haut débit et de l’indice Lar de résistance aux antimicrobiens

To improve the efficiency of antimicrobial susceptibility testing (AST) and phage high-throughput screening for resistant bacteria and to reduce the ...

Ce protocole présente une méthode à plusieurs niveaux, à la fois pour la détection de l’EST et pour la figure du phage. Il a également introduit un grand indice pour les sauvegardes afin de comparer les niveaux de DME de différentes technologies de contrôle. Cette technique économique est intelligente, à haut débit et multifonctionnelle.Il a permis la mise en place du VAMS, un réseau de surveillance vétérinaire qui a collecté 20 000 gènes épidémiques et phages analytiques. Cette méthode peut également être utilisée pour surveiller et contrôler les bactéries pathogènes en médecine, en agriculture, en batterie cardiaque animale et en pêche. Ce protocole et ce document d’entreprise devraient prévoir d’être un.Nous avons un guide de formation technique. Le suivre aiderait n’importe qui à maîtriser la technique en peu de temps. Commencez par incuber l’organisme de contrôle de la qualité E. coli et 93 souches de salmonelles d’essai sur des plaques de gélose Mueller-Hinton.Ensuite, diluez 10 fois l’inoculum préparé de chaque souche. Transférez 200 microlitres de solution saline normale stérile dans le puits a-1 d’une plaque à 96 puits comme témoin négatif. Ensuite, pipeter deux suspensions d’E. coli dans les puits a-2 et a-3 en tant que contrôles positifs et de qualité respectivement.Aux 93 puits restants, ajouter 200 microlitres de la souche d’essai diluée. Pour la préparation des plaques de gélose antimicrobienne. Tout d’abord, définissez les plages de concentration pour les différents agents antibactériens testés, selon l’indice LAR.Effectuer un schéma de dilution de doublement log-deux pour la solution d’antibiotique en suivant la méthode de dilution de gélose standard CLSI. Ajoutez maintenant deux millilitres de solution antimicrobienne dans une bouteille en verre stérilisée contenant 18 millilitres de gélose Mueller-Hinton fondue. Après avoir bien mélangé, verser dans des assiettes à l’intérieur d’une armoire de sécurité bio.Laissez la gélose se solidifier à température ambiante. Assurez-vous de laisser un espace sous le couvercle des plaques pour permettre le séchage de la surface de la gélose. Étiquetez les types d’agents antimicrobiens et leurs concentrations respectives sur la face inférieure des plaques incubées.Disposez les multiples plaques incubées pour chaque agent antimicrobien dans une pile disposée en log deux en doublant l’ordre de dilution. Enfin, préparez deux plaques de gélose sans médicament pour servir de témoins pour chaque agent. Installez une plaque d’inoculation stérilisée sur le support d’un inoculateur à matrice de 96 points à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique.Ensuite, disposez le bloc de graines préparé avec des souches testées et une plaque incubée d’agar sur le support mobile. Poussez le support mobile jusqu’à ce que le bloc de semences se trouve sous la plaque de broches d’inoculation. Appuyez maintenant sur la poignée de commande et abaissez la plaque de broches d’inoculation, en guidant les 96 broches vers l’inoculum dans les 96 puits du bloc de semences.Relâchez la poignée de commande de manière contrôlée et réinitialisez automatiquement la plaque de goupille d’inoculation pour bien remuer chaque inoculum et tremper, appuyez sur la poignée de commande deux à trois fois. Ensuite, déplacez et positionnez la plaque de support de manière à ce que la plaque d’incubation se trouve sous la plaque de broches d’inoculation. Appuyez sur la poignée de commande, abaissez la plaque de la broche d’inoculation et laissez-la pendant une à deux secondes pour assurer un contact complet avec la surface de la plaque incubée.Relâchez la poignée de commande pour terminer un cycle d’inoculation. Replacez la plaque incubée et répétez le processus jusqu’à ce que le lot de plaques de gélose antimicrobienne soit terminé. Passez à une nouvelle plaque d’inoculation et à un nouveau bloc de graines pour inoculer un autre groupe de souches testées.Incuber les plaques de gélose antimicrobienne inoculées à température ambiante jusqu’à ce que l’humidité des taches d’inoculum soit complètement absorbée par la gélose. Après l’incubation, inversez les plaques et poursuivez l’incubation pour permettre aux bactéries non inhibées de former des colonies. Pour effectuer l’acquisition d’images et les statistiques de données, commencez par cliquer sur le système d’acquisition d’images AST à matrice de 96 points pour lancer le programme.Dans la barre des tâches, sélectionnez Informations de test. Cliquez sur Nouveau pour créer une nouvelle tâche de test et renseignez les informations requises. Appuyez ensuite sur la collecte de données, puis sur la photo et l’élément de test pour sélectionner la tâche nouvellement créée.Choisissez antibiotiques pour sélectionner le nom de l’antibiotique et gradient pour sélectionner la concentration initiale de l’antibiotique. Enfin, cliquez sur connecter pour établir une connexion avec le convertisseur d’acquisition d’images. Ensuite, placez les plaques incubées sur la base de la plaque de détection et insérez-les dans le convertisseur d’acquisition d’images.Cliquez sur collection pour capturer des images des plaques. Appuyez sur antibiotiques et sélectionnez le prochain jeu de plaques. Choisissez le dégradé pour identifier le dégradé de départ, puis passez à la prochaine série de collecte d’images.Finalisez la procédure en cliquant sur Soumettre pour déterminer la formation de colonies et convertir les images en concentrations inhibitrices minimales, c’est-à-dire les valeurs CMI. Cliquez sur la requête pour accéder à tous les résultats du MIC. Commencez par utiliser la méthode de gélose à double couche pour produire différents phages.Diluez les phages à une concentration parallèle appropriée et ajoutez 200 microlitres d’inoculum de phages dans le bloc de semences à 96 puits. Ensuite, préparez une plaque incubée à double couche pour chaque souche à examiner. Laissez un espace sous le couvercle de l’assiette à double couche pour permettre le séchage.Placez le bloc de graines de phage préparé et la plaque à double couche sur le support mobile de l’inoculateur à matrice à 96 points. Transférez tous les phages inoculaires sur la surface semi-gélosée. Laissez les plaques rester à température ambiante jusqu’à ce que toute l’humidité inoculaire ait été absorbée par la gélose semi-gélose.Maintenant, incubez les plaques à 37 degrés Celsius pour les souches testées pendant quatre à six heures. Utilisez le convertisseur d’acquisition d’images pour obtenir et enregistrer l’image du résultat expérimental de chaque plaque double couche. Enregistrez le nombre et les morphologies des différentes formes de taches dans un tableur à partir des images obtenues et calculez les proportions respectives des différents types de phages.L’étude morphologique de la croissance de la salmonelle sur des plaques contenant de l’ampicilline a montré que le témoin négatif dans a-1 ne présentait aucune croissance. La CMI de la souche de salmonelle dans a-4 était de 64 microgrammes par millilitre, tandis que celle de a-5 était de 16 microgrammes par millilitre. Les valeurs de résistance en pourcentage de l’ampicilline, de la ciprofloxacine et de l’amoxicilline-acide clavulanique étaient supérieures à 50 %Alors que celles de la doxycycline, du florfénicol, du céfotaxime et de l’enrofloxacine étaient de 30 % à 50 %La gentamicine, l’amikacine et le méropénème présentaient des valeurs de résistance en pourcentage inférieures à 30 %Les indices LAR de la ciprofloxacine et de l’amoxicilline-acide clavulanique différaient de manière significative.Des analyses morphologiques de la croissance de salmonelles sur des plaques à double couche ont montré que quatre taches principales ont été observées dans la morphologie des phages. La tache lytique claire et ronde provenait d’un phage qui pouvait tuer de manière fiable l’hôte sur la plaque, mais qui peut ou non se répliquer avec succès aux dépens de cet hôte. La collection de plaques a été formée par de vraies plaques.La tache lytique trouble résultait d’un phage qui ne tuait pas de manière fiable l’hôte sur la plaque, et qui peut ou non se répliquer avec succès aux dépens de cet hôte. La tache non lytique indiquait une nature non lytique. Cette technique permet de transférer efficacement 96 lentilles de gélose à la fois et les instruments reconnaissent automatiquement les images, puis calculent les dés de ligne.Cette technologie devrait promouvoir la recherche et l’industrialisation des phages et l’application des phages est l’un des moyens étonnants de réduire et de résoudre le problème de la résistance aux antimicrobiens.

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Détermination de l&#39;activité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, les sols et les sédiments de haut débit microplaques dosages

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Recherche

Environnement

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

À haut débit Fluorometric Mesure de sol Potentiel activités enzymatiques extracellulaires

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimisé coloration négative: un protocole à haut débit pour examen petites et asymétrique structure des protéines par microscopie électronique

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Application de deux tétranyque<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; D&#39;études des plantes-parasites interaction

The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae, is a ubiquitous polyphagous arthropod herbivore that feeds on a remarkably broad array of species, with ...

Modifying the Bank Erosion Hazard Index (BEHI) Protocol for Rapid Assessment of Streambank Erosion in Northeastern Ohio

Modifying the Bank Erosion Hazard Index BEHI Protocol for Rapid Assessment of Streambank Erosion in Northeastern Ohio

Modification de l&#39;Indice (BEHI) Protocole Banque érosion de risques pour l&#39;évaluation rapide des berges contre l&#39;érosion dans le nord de l&#39;Ohio

Understanding the source of pollution in a stream is vital to preserving, restoring, and maintaining the stream&#8217;s function and habitat it provides. ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

Criblage à semi-haute de la sécheresse de tolérance potentiel dans la laitue (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) de matériel génétique dans les collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Haut-débit dépistage des Variations récalcitrant dans la biomasse lignocellulosique: Total lignine, la lignine monomères et enzymatique sucre sortie

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

The Effect of the Application of Thyme Essential Oil on Microbial Load During Meat Drying

L’effet de l’Application d’huile essentielle de thym sur la charge microbienne pendant le séchage de la viande

Meat is a high protein meal that is used in the preparation of jerky, a popular food snack, where preservation and safety are important. To assure food ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Le Test de Infection de plantes : Spray et induite par la plaie de l’Inoculation avec la plante pathogène Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Haut-débit, Microscale protocole pour l’analyse des paramètres de traitement et les qualités nutritionnelles du maïs (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...