Name: application of the intelligent high-throughput antimicrobial sensitivity testing/phage screening system and lar index of antimicrobial resistance
Uploaded: 2023-07-21T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of the Intelligent High-Throughput Antimicrobial Sensitivity Testing/Phage Screening System and Lar Index of Antimicrobial Resistance at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo National Key Research and Development Project (2019YFA0904003); Sistema Industrial Agrícola Moderno na Província de Shandong (SDAIT-011-09); Projeto de Otimização de Plataforma de Cooperação Internacional (CXGC2023G15); Principais tarefas de inovação do projeto de inovação de ciência e tecnologia agrícola da Academia de Ciências Agrárias de Shandong, China (CXGC2023G03).

As cepas de Salmonella utilizadas neste estudo foram coletadas de aves de capoeira em Shandong, China, após aprovação do Comitê de Biossegurança do Instituto de Ciências Animais e Medicina Veterinária da Academia de Ciências Agrárias de Shandong, China.
1. Aplicação do sistema AST inteligente de alto rendimento8
<ol><li>Preparação do inóculo<ol><li>Incubar o organismo de controle de qualidade Escherichia coli e 93 cepas...

<ol>
	<li>Ramanan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+resistance-the+need+for+global+solutions.">Antimicrobial resistance-the need for global solutions.</a> The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).</li><li>Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=inPhocus:+Perspectives+of+the+application+of+bacteriophages+in+poultry+and+aquaculture+industries+based+on+Varms+in+China.">inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China.</a> PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , (2022).</li><li>Yuqing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , (2017).</li><li>Barnini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+method+for+direct+antimicrobial+susceptibility+testing+of+bacteria+from+positive+blood+cultures.">A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).</li><li>H&#246;ring, S., Massarani, A. S., L&#246;ffler, B., R&#246;del, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+antimicrobial+susceptibility+testing+in+blood+culture+diagnostics+performed+by+direct+inoculation+using+the+VITEK&#174;-2+and+BD+PhoenixTM+platforms.">Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK&#174;-2 and BD PhoenixTM platforms.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).</li><li>Dupuis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Cobasbact+automated+antimicrobial+susceptibility+testing+system.">Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+bacterial+antimicrobial+resistance+detection+and+its+operation+method.">A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method.</a> China Patent. , (2019).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+test+plate+for+screening+bacteriophage+of+zoonotic+pathogens+and+its+application.">A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application.</a> China Patent. , (2022).</li><li>Adams, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteriophages. , (1959).</li><li>Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+appraisal+of+bacteriophage+isolation+techniques+from+environment.">An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment.</a> Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Shandong veterinary antibiotic resistance system. , (2023).</li><li>Ming, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+results+of+96-dot+agar+dilution+method+and+broth+microdilution+method.">Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method.</a> Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).</li><li>Laxminarayan, R., Klugman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+trends+in+resistance+using+a+drug+resistance+index.">Communicating trends in resistance using a drug resistance index.</a> BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+antibiotic+therapy+effectiveness+against+the+major+bacterial+pathogens+in+a+hospital+using+an+integrated+index.">Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index.</a> Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).</li><li>Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+index-based+approach+to+assess+the+population-level+appropriateness+of+empirical+antibiotic+therapy.">Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).</li><li>Yanbo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+application+of+inoculation+system+for+high-throughput+drug+susceptibility+test.">Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test.</a> China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).</li></ol>

O método de diluição em ágar foi bem estabelecido e amplamente utilizado. O princípio do sistema AST de alto rendimento foi o método de diluição em ágar. Uma das etapas críticas dentro do protocolo foi a transferência precisa de alto rendimento de 96 inóculos de uma só vez, que foi realizada várias vezes seguidas. Para completar esta etapa crítica, os pinos do inoculador de matriz de 96 pontos foram uniformes e muito lisos. A deposição natural de cada pino foi um volume de aproximadamente 2 μL, que se a...

Como os agentes antimicrobianos têm sido amplamente utilizados na prevenção de doenças infecciosas bacterianas, a resistência antimicrobiana (RAM) tornou-se um problema de saúde pública mundial1. O combate à RAM é a principal missão atual de monitoramento da RAM de patógenos epidemiológicos e terapia sinérgica de agentes antimicrobianos sensíveis e bacteriófagos líticos2.
O teste de sensibilidade antimicrobiana in vitro (AST) é a base para monitorar a terapia e detectar o nível de RAM. É uma parte importante da farmacologia antimicrobiana e a base crítica para a medicação clínica. O Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) dos Estados Unidos e o European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) formularam e revisaram critérios internacionais de AST e continuamente modificaram e complementaram os métodos AST e os pontos de interrupção para determinar a CIM de uma determinada combinação "organismo e agente antimicrobiano" como sensível (S), resistente (R) ou intermediário (I)3, 4º.
Entre as décadas de 1980 e 1990, instrumentos automáticos de microdiluição em caldo foram rapidamente desenvolvidos e aplicados à prática clínica, com exemplos como Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIX® e Cobasbact 5,6,7. No entanto, esses instrumentos eram caros, exigiam consumíveis de alto custo e suas faixas de detecção foram projetadas para medicação clínica do paciente 5,6,7. Por essas razões, não são adequados para exame clínico veterinário e detecção de grandes quantidades de cepas altamente resistentes. Neste estudo, um sistema inteligente de triagem AST/fago de alto rendimento, incluindo um inoculador de matriz de 96 pontos (Figura 1), conversor de aquisição de imagens (Figura 2) e software correspondente8, foi desenvolvido para conduzir AST para um lote de cepas de bactérias contra múltiplos agentes antimicrobianos ao mesmo tempo pelo método de diluição em ágar. Além disso, o sistema também foi usado para detectar e analisar os padrões de lise de fagos contra bactérias resistentes a antimicrobianos9, e fagos líticos foram selecionados eficientemente da biblioteca de fagos. Este sistema mostrou-se eficiente, acessível e fácil de operar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64785/64785fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama estrutural do inoculador matricial de 96 pontos. 1: Placa de pino de inoculação; 2: Operadora de celular; 3: Bloco de sementes; 4: Placa incubada; 5: Base; 6: Alça de operação; 7: Pino de limite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64785/64785fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64785/64785fig02.jpg"> Figura 2: Diagrama estrutural do conversor de aquisição de imagens. 1: Concha; 2: Tela de exibição; 3: Sala de aquisição de imagens; 4: Base da placa de detecção; 5: Placa de detecção dentro e fora do armazém; 6: Placa de controle; 7: Aparelho de conversão para aquisição de imagens; 8: Fonte de luz; 9: Scanner de imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64785/64785fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well&#160; culture plate</td>
			<td>Beijing lanjieke Technology Co., Ltd</td>
			<td>11510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-dot matrix AST image acquisition system</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-dot matrix inoculator&#160;</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Patented product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>HB8274-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amikacin&#160;</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>A857053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicillin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>A822839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>A830931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA224S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated calculation software for Lar index of AMR</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria Salmonella strains</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Animal origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftiofur</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C873619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C824343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clavulanic acid</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C824181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean worktable</td>
			<td>Suzhou purification equipment Co., Ltd</td>
			<td>SW-CJ-2D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colistin sulfate</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C805491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plate</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Patented product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>D832390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>E809130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Florfenicol</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>F809685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>G810322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle 50 mL</td>
			<td>Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd</td>
			<td>QX-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-throughput resistance detection system V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition converter</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Patented product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meropenem</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>M861173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton agar</td>
			<td>Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>HB6232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd</td>
			<td>16021-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 90 mm x 15 mm</td>
			<td>Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd</td>
			<td>16001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella phages</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd</td>
			<td>MQD-S2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbidimeter</td>
			<td>Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>F-TC2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varms base type library system V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical high-pressure steam sterilizer</td>
			<td>Shanghai Shen&#39;an medical instrument factory</td>
			<td>LDZX-75L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veterinary pathogen resistance testing management system</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of the intelligent high-throughput antimicrobial sensitivity testing/phage screening system and lar index of antimicrobial resistance

Para melhorar a eficiência do teste de sensibilidade antimicrobiana (AST) e da triagem de alto rendimento de fago para bactérias resistentes e reduzir o custo de detecção, um sistema inteligente de triagem de AST/fago de alto rendimento, incluindo um inoculador de matriz de 96 pontos, conversor de aquisição de imagem e software correspondente, foi desenvolvido de acordo com os critérios AST e os pontos de quebra de resistência (R) formulados pelo Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI). AST e estatísticas de distribuição da concentração inibitória mínima (CIM) (de R/8 a 8R) de 1.500 cepas de Salmonella isoladas de aves em Shandong, China, contra 10 agentes antimicrobianos, foram realizadas pelo sistema inteligente de triagem AST/fago de alto rendimento. O índice Lar, que significa "menos antibiose, menor resistência e residual até pouca antibiose", foi obtido calculando-se a média ponderada de cada CIM e dividindo-se por R. Essa abordagem melhora a acurácia em comparação com o uso da prevalência de resistência para caracterizar o grau de resistência antimicrobiana (RAM) de cepas altamente resistentes. Para as cepas de Salmonella com alto AMR, fagos líticos foram eficientemente selecionados da biblioteca de fagos por este sistema, e o espectro de lise foi computado e analisado. Os resultados mostraram que o sistema inteligente de triagem AST/fago de alto rendimento era operável, preciso, altamente eficiente, barato e de fácil manutenção. Combinado com o sistema de monitoramento da resistência antimicrobiana veterinária Shandong, o sistema foi adequado para pesquisa científica e detecção clínica relacionada à RAM.

Seguindo o protocolo do sistema AST inteligente de alto rendimento, sua aplicação foi ilustrada por Salmonella de aves de Shandong, China, como exemplo.
O crescimento de cepas de Salmonella em placas de ágar com ampicilina (R de 32 μg/mL) nas concentrações de 2 a 256 μg/mL determinadas pelo conversor de aquisição de imagens é mostrado na Figura 3. O1º poço horizontal A1 foi o controle negativo e não apresentou crescimento ...

Watch this Scientific Journal Video about Application of the Intelligent High-Throughput Antimicrobial Sensitivity Testing/Phage Screening System and Lar Index of Antimicrobial Resistance at JoVE.com

Application of the Intelligent High-Throughput Antimicrobial Sensitivity Testing/Phage Screening System and Lar Index of Antimicrobial Resistance

Aqui apresentamos o princípio, a estrutura e a instrução do sistema inteligente de teste de sensibilidade antimicrobiana de alto rendimento/triagem de fagos. Sua aplicação é ilustrada usando Salmonella isolada de aves em Shandong, China, como exemplo. O índice Lar é calculado, e sua importância na avaliação da resistência antimicrobiana é discutida de forma abrangente.

Aplicação do Sistema Inteligente de Teste de Sensibilidade Antimicrobiana de Alto Rendimento/Phage Screening System e Índice Lar de Resistência Antimicrobiana

To improve the efficiency of antimicrobial susceptibility testing (AST) and phage high-throughput screening for resistant bacteria and to reduce the ...

Este protocolo apresenta um método multinível, tanto para a detecção do EST quanto para a figura do fago. Ele também introduziu um grande índice para salvamentos para comparar os níveis de EMR de diferentes tecnologias de controle. Esta técnica econômica é inteligente, de alto rendimento e multifuncional.Isso permitiu o estabelecimento do VAMS, uma rede de monitoramento veterinário que coletou 20.000 genes epidêmicos e fagos analíticos. Este método também pode ser usado para monitorar e controlar bactérias patogênicas na medicina, agricultura, bateria de coração animal, e a pesca. Este protocolo e este documento da empresa devem fornecer para ser um.Nós com guia de treinamento técnico. Segui-lo ajudaria qualquer um a dominar a técnica em um curto espaço de tempo. Comece incubando o organismo de controle de qualidade E.coli e 93 cepas de salmonela de teste em placas de ágar Mueller-Hinton.Em seguida, diluir o inóculo preparado de cada cepa 10 vezes. Transferir 200 microlitros de soro fisiológico normal estéril para o poço a-1 de uma placa de 96 poços como controle negativo. Em seguida, pipetar duas suspensões de E.coli nos poços a-2 e a-3 como controles positivos e de qualidade, respectivamente.Aos 93 poços restantes, adicionar 200 microlitros da cepa de teste diluída. Para a preparação das placas de ágar antimicrobianas. Primeiro, defina as faixas de concentração para os diferentes agentes antibacterianos que estão sendo testados, de acordo com o índice LAR.Executar um esquema de diluição log-two de duplicação para a solução antibiótica seguindo o método de diluição em ágar padrão CLSI. Agora adicione dois mililitros da solução antimicrobiana a um frasco de vidro esterilizado contendo 18 mililitros de meio de ágar Mueller-Hinton fundido. Depois de misturar completamente, despeje em placas dentro de um armário de biossegurança.Deixe o ágar solidificar à temperatura ambiente. Certifique-se de deixar uma lacuna sob a tampa das placas para permitir a secagem da superfície do ágar. Rotular os tipos de agentes antimicrobianos e suas respectivas concentrações na parte inferior das placas incubadas.Organize as múltiplas placas incubadas para cada agente antimicrobiano em uma pilha disposta em log dois duplicando a ordem de diluição. Finalmente, prepare duas placas de ágar sem drogas para atuar como controles para cada agente. Instale uma placa de pino de inoculação esterilizada no suporte de um inoculador matricial de 96 pontos dentro de um gabinete de biossegurança.Em seguida, disponha o bloco de sementes preparado com cepas testadas e uma placa incubada de ágar na transportadora móvel. Empurre o carregador móvel até que o bloco de sementes esteja abaixo da placa do pino de inoculação. Agora pressione a alça de operação e abaixe a placa do pino de inoculação, guiando os 96 pinos em direção ao inóculo nos 96 poços do bloco de sementes.Solte a alça de operação de forma controlada e redefina automaticamente a placa do pino de inoculação para agitar cada poço de inóculo e mergulhe, empurre a alça de operação de duas a três vezes. Depois, desloque e posicione a placa transportadora de modo que a placa de incubação fique sob a placa do pino de inoculação. Pressione a alça de operação, abaixando a placa do pino de inoculação e deixando-a por um a dois segundos para garantir o contato total com a superfície da placa incubada.Solte a alça de operação para completar uma rodada de inoculação. Substitua a placa incubada e repita o processo até que o lote de placas de ágar antimicrobiano esteja concluído. Mude para uma nova placa de pino de inoculação e bloco de sementes para inocular outro grupo de cepas testadas.Incubar as placas de ágar antimicrobiano inoculadas à temperatura ambiente até que a umidade dos pontos de inóculo seja completamente absorvida pelo ágar. Após a incubação, inverta as placas e continue a incubação para permitir que bactérias não inibidas formem colônias. Para realizar a aquisição de imagens e estatísticas de dados, comece clicando no sistema de aquisição de imagens AST de 96 pontos matriciais para iniciar o programa.Na barra de tarefas, selecione informações de teste. Clique em novo para criar uma nova tarefa de teste e preencher os detalhes necessários. Em seguida, pressione a coleta de dados seguida de fotografia e item de teste para selecionar a tarefa recém-criada.Escolha antibióticos para selecionar o nome do antibiótico e gradiente para selecionar a concentração inicial do antibiótico. Por fim, clique em conectar para estabelecer uma conexão com o conversor de aquisição de imagem. Em seguida, coloque as placas incubadas na base da placa de detecção e insira-as no conversor de aquisição de imagens.Clique na coleção para capturar imagens das placas. Pressione antibióticos e selecione o próximo conjunto de placas. Escolha gradiente para identificar o gradiente inicial e, em seguida, prossiga para a próxima rodada da coleção de imagens.Finalize o procedimento clicando em enviar para determinar a formação de colônias e converter as imagens em concentrações inibitórias mínimas, ou seja, valores de MIC. Clique na consulta para acessar todos os resultados do MIC. Comece utilizando o método de ágar de camada dupla para produzir diferentes fagos.Diluir os fagos para uma concentração paralela adequada e adicionar 200 microlitros do inóculo do fago no bloco de sementes de 96 poços. Em seguida, prepare uma placa incubada de camada dupla para cada cepa a ser examinada. Deixe uma lacuna sob a tampa da placa de camada dupla para permitir a secagem.Coloque o bloco de sementes de fago preparado e a placa de camada dupla no portador móvel do inoculador matricial de 96 pontos. Transfira todo o fago inocular para a superfície do semiágar. Deixe as placas permanecerem à temperatura ambiente até que toda a umidade inocular tenha sido absorvida pelo semiágar.Agora incube as placas a 37 graus Celsius para as cepas testadas por quatro a seis horas. Use o conversor de aquisição de imagens para obter e salvar a imagem do resultado experimental de cada placa de dupla camada. Registre o número e as morfologias das diferentes formas de manchas em uma planilha com base nas imagens obtidas e calcule as respectivas proporções dos diferentes tipos de fagos.O estudo morfológico do crescimento de salmonelas em placas com ampicilina mostrou que o controle negativo em a-1 não apresentou crescimento. A CIM da cepa de salmonela em a-4 foi de 64 microgramas por mililitro, enquanto a de a-5 foi de 16 microgramas por mililitro. Os valores percentuais de resistência de ampicilina, ciprofloxacina e amoxicilina-clavulanato foram superiores a 50%, enquanto os de doxiciclina, florfenicol, cefotaxima e enrofloxacina foram de 30% a 50%Gentamicina, amicacina e meropenem apresentaram valores percentuais de resistência inferiores a 30%Os índices de LAR de ciprofloxacina e amoxicilina-clavulanato diferiram significativamente.Análises morfológicas do crescimento de salmonelas em placas de camada dupla mostraram que quatro pontos principais morfológicos de fagos foram observados. O ponto lítico claro redondo era de um fago que poderia matar o hospedeiro de forma confiável na placa, mas que pode ou não se replicar com sucesso às custas desse hospedeiro. A coleção de placas foi formada por placas verdadeiras.O ponto lítico turvo resultou de um fago que não matou de forma confiável o hospedeiro na placa, e que pode ou não se replicar com sucesso às custas desse hospedeiro. A mancha não lítica indicou natureza não lítica. Esta técnica transfere facilmente uma lente de ágar 96 de uma só vez e os instrumentos reconhecem automaticamente as imagens e, em seguida, calculam os dados de linha.Espera-se que esta tecnologia promova a pesquisa e a industrialização de fagos e a aplicação de fagos é uma das maneiras surpreendentes de reduzir e resolver o problema do AMR.

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Determinação da Microbial Extracelular Enzyme actividade nas águas, solos e sedimentos, utilizando alta taxa de transferência de microplaca Ensaios

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Ambiente

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

De alta capacidade Fluorometric Medição do Potencial dos Solos extracelulares atividades enzimáticas

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimizado coloração negativa: um protocolo de alta capacidade para Examinando pequeno e assimétrico Estrutura de proteínas por microscopia eletrônica

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Aplicação de duas avistou Ácaro<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; De Estudos Planta-praga de Interação

The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae, is a ubiquitous polyphagous arthropod herbivore that feeds on a remarkably broad array of species, with ...

Modifying the Bank Erosion Hazard Index (BEHI) Protocol for Rapid Assessment of Streambank Erosion in Northeastern Ohio

Modifying the Bank Erosion Hazard Index BEHI Protocol for Rapid Assessment of Streambank Erosion in Northeastern Ohio

Modificando o Index (BEHI) Protocolo Banco Erosão Hazard para Avaliação Rápida de Streambank Erosão na Northeastern Ohio

Understanding the source of pollution in a stream is vital to preserving, restoring, and maintaining the stream&#8217;s function and habitat it provides. ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

Screening Semi-High Throughput para o Potencial tolerância à seca em alface ( Lactuca sativa) Germoplasma Colecções

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Rastreio de alto rendimento de Variações recalcitrância da biomassa lignocelulósica em: Total lignina, a lignina monómeros, e enzimática Sugar lançamento

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

The Effect of the Application of Thyme Essential Oil on Microbial Load During Meat Drying

O efeito da aplicação do óleo essencial de tomilho na carga microbiana durante a secagem da carne

Meat is a high protein meal that is used in the preparation of jerky, a popular food snack, where preservation and safety are important. To assure food ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

O teste de infecção da planta: Spray e inoculação mediada por ferimento com o de patógeno vegetal Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Elevado-throughput, microescala protocolo para a análise de parâmetros de processamento e qualidades nutricionais em milho (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...