Name: application of the intelligent high-throughput antimicrobial sensitivity testing/phage screening system and lar index of antimicrobial resistance
Uploaded: 2023-07-21T14:45:00
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Este trabajo contó con el apoyo del Proyecto Nacional de Investigación y Desarrollo Clave (2019YFA0904003); Sistema Agrícola Industrial Moderno en la Provincia de Shandong (SDAIT-011-09); Proyecto de Optimización de la Plataforma de Cooperación Internacional (CXGC2023G15); Principales tareas de innovación del proyecto de innovación científica y tecnológica agrícola de la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong, China (CXGC2023G03).

Las cepas de Salmonella utilizadas en este estudio se recolectaron de aves de corral en Shandong, China, después de obtener la aprobación del Comité de Bioseguridad del Instituto de Ciencias Animales y Medicina Veterinaria de la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong, China.
1. Aplicación del sistema inteligente AST de alto rendimiento8
<ol><li>Preparación del inóculo<ol><li>Incubar el organismo de control de calidad Escherichi...

<ol>
	<li>Ramanan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+resistance-the+need+for+global+solutions.">Antimicrobial resistance-the need for global solutions.</a> The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).</li><li>Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=inPhocus:+Perspectives+of+the+application+of+bacteriophages+in+poultry+and+aquaculture+industries+based+on+Varms+in+China.">inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China.</a> PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , (2022).</li><li>Yuqing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , (2017).</li><li>Barnini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+method+for+direct+antimicrobial+susceptibility+testing+of+bacteria+from+positive+blood+cultures.">A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).</li><li>H&#246;ring, S., Massarani, A. S., L&#246;ffler, B., R&#246;del, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+antimicrobial+susceptibility+testing+in+blood+culture+diagnostics+performed+by+direct+inoculation+using+the+VITEK&#174;-2+and+BD+PhoenixTM+platforms.">Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK&#174;-2 and BD PhoenixTM platforms.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).</li><li>Dupuis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Cobasbact+automated+antimicrobial+susceptibility+testing+system.">Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+bacterial+antimicrobial+resistance+detection+and+its+operation+method.">A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method.</a> China Patent. , (2019).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+test+plate+for+screening+bacteriophage+of+zoonotic+pathogens+and+its+application.">A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application.</a> China Patent. , (2022).</li><li>Adams, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteriophages. , (1959).</li><li>Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+appraisal+of+bacteriophage+isolation+techniques+from+environment.">An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment.</a> Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Shandong veterinary antibiotic resistance system. , (2023).</li><li>Ming, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+results+of+96-dot+agar+dilution+method+and+broth+microdilution+method.">Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method.</a> Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).</li><li>Laxminarayan, R., Klugman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+trends+in+resistance+using+a+drug+resistance+index.">Communicating trends in resistance using a drug resistance index.</a> BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+antibiotic+therapy+effectiveness+against+the+major+bacterial+pathogens+in+a+hospital+using+an+integrated+index.">Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index.</a> Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).</li><li>Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+index-based+approach+to+assess+the+population-level+appropriateness+of+empirical+antibiotic+therapy.">Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).</li><li>Yanbo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+application+of+inoculation+system+for+high-throughput+drug+susceptibility+test.">Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test.</a> China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).</li></ol>

El método de dilución en agar está bien establecido y se utiliza ampliamente. El principio del sistema AST de alto rendimiento era el del método de dilución en agar. Uno de los pasos críticos dentro del protocolo fue la transferencia precisa de alto rendimiento de 96 inóculos a la vez, que se realizó varias veces seguidas. Para completar este paso crítico, los pines del inoculador de matriz de 96 puntos eran uniformes y muy suaves. La deposición natural de cada pin fue de un volumen de aproximadamente 2 μL, qu...

Dado que los agentes antimicrobianos se han utilizado ampliamente para prevenir enfermedades infecciosas bacterianas, la resistencia a los antimicrobianos (RAM) se ha convertido en un problema de salud pública mundial1. La lucha contra la resistencia a los antimicrobianos es la misión principal actual de seguimiento de la resistencia a los antimicrobianos de patógenos epidemiológicos y la terapia sinérgica de agentes antimicrobianos sensibles y bacteriófagos líticos2.
Las pruebas de sensibilidad antimicrobiana (AST) in vitro son el pilar para monitorizar el tratamiento y detectar el nivel de RAM. Es una parte importante de la farmacología antimicrobiana y la base crítica de la medicación clínica. El Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) de los Estados Unidos y el Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST) han formulado y revisado los criterios internacionales de AST y han modificado y complementado continuamente los métodos AST y los puntos de corte para determinar la CMI de una determinada combinación de "organismo-agente antimicrobiano" como sensible (S), resistente (R) o intermedio (I)3, 4.
Desde la década de 1980 hasta la década de 1990, los instrumentos automáticos de dilución de microcaldo se desarrollaron rápidamente y se aplicaron a la práctica clínica, con ejemplos como Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM y Cobasbact 5,6,7. Sin embargo, estos instrumentos eran costosos, requerían consumibles de alto costo y sus rangos de detección fueron diseñados para la medicación clínicade pacientes 5,6,7. Por estas razones, no son adecuados para el examen clínico veterinario y la detección de grandes cantidades de cepas altamente resistentes. En este estudio, se desarrolló un sistema inteligente de cribado de AST/fagos de alto rendimiento, que incluye un inoculador de matriz de 96 puntos (Figura 1), un convertidor de adquisición de imágenes (Figura 2) y el software correspondiente8, para realizar AST para un lote de cepas de bacterias contra múltiples agentes antimicrobianos a la vez mediante el método de dilución en agar. Además, el sistema también se utilizó para detectar y analizar los patrones de lisis de los fagos frente a bacterias resistentes a los antimicrobianos9, y los fagos líticos se seleccionaron de forma eficiente de la biblioteca de fagos. Se comprobó que este sistema era eficiente, asequible y fácil de operar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64785/64785fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama estructural del inoculador de matriz de 96 puntos. 1: Placa de clavija de inoculación; 2: Operador de telefonía móvil; 3: Bloque de semillas; 4: Placa incubada; 5: Base; 6: Mango de operación; 7: Pin de límite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64785/64785fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64785/64785fig02.jpg"> Figura 2: Diagrama estructural del convertidor de adquisición de imágenes. 1: Concha; 2: Pantalla de visualización; 3: Sala de adquisición de imágenes; 4: Base de la placa de detección; 5: Tablero de detección dentro y fuera del almacén; 6: Tablero de control; 7: Dispositivo de conversión de adquisición de imágenes; 8: Fuente de luz; 9: Escáner de imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64785/64785fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well&#160; culture plate</td>
			<td>Beijing lanjieke Technology Co., Ltd</td>
			<td>11510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-dot matrix AST image acquisition system</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-dot matrix inoculator&#160;</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Patented product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>HB8274-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amikacin&#160;</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>A857053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicillin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>A822839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>A830931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA224S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated calculation software for Lar index of AMR</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria Salmonella strains</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Animal origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftiofur</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C873619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C824343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clavulanic acid</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C824181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean worktable</td>
			<td>Suzhou purification equipment Co., Ltd</td>
			<td>SW-CJ-2D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colistin sulfate</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>C805491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plate</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Patented product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>D832390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>E809130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Florfenicol</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>F809685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>G810322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle 50 mL</td>
			<td>Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd</td>
			<td>QX-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-throughput resistance detection system V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition converter</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Patented product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meropenem</td>
			<td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td>
			<td>M861173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton agar</td>
			<td>Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>HB6232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd</td>
			<td>16021-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 90 mm x 15 mm</td>
			<td>Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd</td>
			<td>16001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella phages</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd</td>
			<td>MQD-S2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbidimeter</td>
			<td>Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>F-TC2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varms base type library system V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical high-pressure steam sterilizer</td>
			<td>Shanghai Shen&#39;an medical instrument factory</td>
			<td>LDZX-75L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veterinary pathogen resistance testing management system</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0</td>
			<td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td>
			<td>In-house software copyright</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of the intelligent high-throughput antimicrobial sensitivity testing/phage screening system and lar index of antimicrobial resistance

Para mejorar la eficiencia de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos (AST) y el cribado de alto rendimiento de fagos para bacterias resistentes y para reducir el coste de detección, se desarrolló un sistema inteligente de cribado de AST/fagos de alto rendimiento, que incluye un inoculador de matriz de 96 puntos, un convertidor de adquisición de imágenes y el software correspondiente, de acuerdo con los criterios AST y los puntos de ruptura de resistencia (R) formulados por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI). La AST y las estadísticas de las distribuciones de la concentración inhibitoria mínima (CMI) (de R/8 a 8R) de 1.500 cepas de Salmonella aisladas de aves de corral en Shandong, China, frente a 10 agentes antimicrobianos se llevaron a cabo mediante el sistema inteligente de cribado de ast/fagos de alto rendimiento. El índice Lar, que significa "menos antibiosis, menos resistencia y residual hasta poca antibiosis", se obtuvo calculando la media ponderada de cada CMI y dividiéndola por R. Este enfoque mejora la precisión en comparación con el uso de la prevalencia de resistencia para caracterizar el grado de resistencia a los antimicrobianos (RAM) de cepas altamente resistentes. Para las cepas de Salmonella con alta resistencia a los antimicrobianos, los fagos líticos se seleccionaron eficientemente de la biblioteca de fagos mediante este sistema, y se calculó y analizó el espectro de lisis. Los resultados mostraron que el sistema inteligente de cribado de fagos y AST de alto rendimiento era operable, preciso, altamente eficiente, económico y fácil de mantener. En combinación con el sistema de monitoreo de la resistencia a los antimicrobianos veterinarios de Shandong, el sistema era adecuado para la investigación científica y la detección clínica relacionada con la resistencia a los antimicrobianos.

Siguiendo el protocolo del sistema inteligente AST de alto rendimiento, su aplicación se ilustró con la Salmonella de aves de corral en Shandong, China, como ejemplo.
En la Figura 3 se muestra el crecimiento de cepas de Salmonella en placas de agar con ampicilina (R de 32 μg/mL) a concentraciones de 2 a 256 μg/mL determinadas por el convertidor de adquisición de imágenes. El1er pozo horizontal A1 fue el testigo negativo y no most...

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Application of the Intelligent High-Throughput Antimicrobial Sensitivity Testing/Phage Screening System and Lar Index of Antimicrobial Resistance

Aquí presentamos el principio, la estructura y las instrucciones del sistema inteligente de detección de fagos / pruebas de sensibilidad antimicrobiana de alto rendimiento. Su aplicación se ilustra utilizando como ejemplo la Salmonella aislada de aves de corral en Shandong, China. Se calcula el índice Lar y se discute exhaustivamente su importancia en la evaluación de la resistencia a los antimicrobianos.

Aplicación del sistema inteligente de detección de fagos y pruebas de sensibilidad antimicrobiana de alto rendimiento y lar índice de resistencia a los antimicrobianos

To improve the efficiency of antimicrobial susceptibility testing (AST) and phage high-throughput screening for resistant bacteria and to reduce the ...

Este protocolo presenta un método multinivel, tanto para la detección de EST como para la figura de fagos. También introdujo un gran índice de guardado para comparar los niveles de EMR de diferentes tecnologías de control. Esta técnica rentable es inteligente, de alto rendimiento y multifuncional.Ha permitido la creación de VAMS, una red de vigilancia veterinaria que ha recogido 20.000 genes epidémicos y fagos analíticos. Este método también se puede utilizar para monitorear y controlar bacterias patógenas en medicina, agricultura, baterías cardíacas de animales y pesquerías. Este protocolo y este documento de la empresa deben proporcionar que sea un.Contamos con guía de capacitación técnica. Seguirlo ayudaría a cualquiera a dominar la técnica en un corto período de tiempo. Comience incubando el organismo de control de calidad E. coli y 93 cepas de salmonela de prueba en placas de agar Mueller-Hinton.A continuación, diluya el inóculo preparado de cada cepa 10 veces. Transfiera 200 microlitros de solución salina normal estéril al pocillo a-1 de una placa de 96 pocillos como control negativo. A continuación, pipetee dos suspensiones de E. coli en los pocillos a-2 y a-3 como controles positivos y de calidad, respectivamente.A los 93 pocillos restantes, agregue 200 microlitros de la cepa de prueba diluida. Para la preparación de las placas de agar antimicrobiano. En primer lugar, establezca los rangos de concentración para los diferentes agentes antibacterianos que se están probando, según el índice LAR.Realice un esquema de dilución de duplicación log-dos para la solución antibiótica siguiendo el método de dilución en agar estándar CLSI. Ahora agregue dos mililitros de la solución antimicrobiana a una botella de vidrio esterilizada que contenga 18 mililitros de medio de agar Mueller-Hinton fundido. Después de mezclar bien, vierta en platos dentro de un gabinete de bioseguridad.Deje que el agar se solidifique a temperatura ambiente. Asegúrese de dejar un espacio debajo de la tapa de las placas para permitir el secado de la superficie del agar. Etiquete los tipos de agentes antimicrobianos y sus respectivas concentraciones en la parte inferior de las placas incubadas.Coloque las múltiples placas incubadas para cada agente antimicrobiano en una pila dispuesta en el orden de dilución de duplicación logarítmica dos. Por último, prepare dos placas de agar sin fármacos para que actúen como controles de cada agente. Instale una placa de clavija de inoculación esterilizada sobre el soporte de un inoculador de matriz de 96 puntos dentro de un gabinete de bioseguridad.A continuación, coloque el bloque de semillas preparado con cepas probadas y una placa de incubación en agar en el portador móvil. Empuje el transportador móvil hasta que el bloque de semillas esté debajo de la placa de clavijas de inoculación. Ahora presione la manija de operación y baje la placa de clavijas de inoculación, guiando las 96 clavijas hacia el inóculo en los 96 pocillos del bloque de semillas.Suelte la manija de operación de manera controlada y reinicie automáticamente la placa del pasador de inoculación para agitar bien cada inóculo y sumergirlo, empuje la manija de operación dos o tres veces. Después, mueva y coloque la placa portadora de modo que la placa de incubación quede debajo de la placa del pasador de inoculación. Presione hacia abajo la manija de operación, bajando la placa del pasador de inoculación y dejándola durante uno o dos segundos para asegurar un contacto total con la superficie de la placa incubada.Suelte la manija de operación para completar una ronda de inoculación. Vuelva a colocar la placa incubada y repita el proceso hasta completar el lote de placas de agar antimicrobiano. Cambie a una nueva placa de clavijas de inoculación y bloque de semillas para inocular otro grupo de cepas probadas.Incubar las placas de agar antimicrobiano inoculadas a temperatura ambiente hasta que la humedad de las manchas de inóculo sea completamente absorbida por el agar. Después de la incubación, invierta las placas y continúe la incubación para permitir que las bacterias desinhibidas formen colonias. Para realizar la adquisición de imágenes y estadísticas de datos, comience haciendo clic en el sistema de adquisición de imágenes AST de matriz de 96 puntos para iniciar el programa.En la barra de tareas, seleccione información de prueba. Haga clic en nuevo para crear una nueva tarea de prueba y rellene los detalles necesarios. A continuación, pulse recopilación de datos seguido de fotografía y elemento de prueba para seleccionar la tarea recién creada.Elija antibióticos para seleccionar el nombre del antibiótico y el gradiente para seleccionar la concentración inicial del antibiótico. Por último, haga clic en conectar para establecer una conexión con el convertidor de adquisición de imágenes. A continuación, coloque las placas incubadas en la base de la placa de detección e insértelas en el convertidor de adquisición de imágenes.Haga clic en la colección para capturar imágenes de las placas. Presione antibióticos y seleccione el siguiente juego de placas. Elija degradado para identificar el degradado inicial y, a continuación, continúe con la siguiente ronda de recopilación de imágenes.Finalice el procedimiento haciendo clic en enviar para determinar la formación de colonias y convertir las imágenes en concentraciones inhibitorias mínimas, es decir, valores de MIC. Haga clic en la consulta para acceder a todos los resultados de MIC. Comience utilizando el método de agar de doble capa para producir diferentes fagos.Diluir los fagos a una concentración paralela adecuada y añadir 200 microlitros del inóculo de fagos en el bloque de semillas de 96 pocillos. A continuación, prepare una placa de incubación de doble capa para cada cepa que se vaya a examinar. Deje un espacio debajo de la tapa de la placa de doble capa para permitir el secado.Coloque el bloque de semillas de fagos preparado y la placa de doble capa en el soporte móvil del inoculador de matriz de 96 puntos. Transfiera todos los fagos inoculares a la superficie de semiagar. Deje que las placas permanezcan a temperatura ambiente hasta que toda la humedad ocular haya sido absorbida por el semiagar.A continuación, incube las placas a 37 grados centígrados para las cepas probadas durante cuatro a seis horas. Utilice el convertidor de adquisición de imágenes para obtener y guardar la imagen del resultado experimental de cada placa de doble capa. Registre el número y las morfologías de las diferentes formas de puntos en una hoja de cálculo basada en las imágenes obtenidas y calcule las proporciones respectivas de los diferentes tipos de fagos.El estudio morfológico del crecimiento de salmonella en placas con ampicilina mostró que el control negativo en a-1 no mostró crecimiento. La CMI de la cepa de salmonela en a-4 fue de 64 microgramos por mililitro, mientras que la de a-5 fue de 16 microgramos por mililitro. Los valores porcentuales de resistencia de ampicilina, ciprofloxacina y amoxicilina-ácido clavulánico fueron superiores al 50%, mientras que los de doxiciclina, florfenicol, cefotaxima y enrofloxacina fueron del 30% al 50%Gentamicina, amikacina y meropenem mostraron valores porcentuales de resistencia inferiores al 30%Los índices LAR de ciprofloxacina y amoxicilina-ácido clavulánico se difirieron significativamente.Los análisis morfológicos del crecimiento de salmonela en placas de doble capa mostraron que se observaron cuatro morfologías principales de los fagos. La mancha lítica clara redonda era de un fago que podía matar de manera confiable al huésped en la placa, pero que puede o no replicarse con éxito a expensas de ese huésped. La colección de placas estaba formada por placas verdaderas.La mancha lítica turbia fue el resultado de un fago que no mató de manera confiable al huésped en la placa, y que puede o no replicarse con éxito a expensas de ese huésped. La mancha no lítica indicaba naturaleza no lítica. Esta técnica transfiere fácilmente y de manera eficiente la lente de agar 96 a la vez y los instrumentos reconocen automáticamente las imágenes y luego calculan los dados de línea.Se espera que esta tecnología promueva la investigación y la industrialización de los fagos y la aplicación de fagos es una de las formas sorprendentes de reducir y resolver el problema de la resistencia a los antimicrobianos.

Research

JoVE Journal

Environment

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Investigación

Medio ambiente

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Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimizado tinción negativa: un protocolo de alto rendimiento para el examen de Estructura Pequeña y asimétrica de proteínas por Microscopía Electrónica

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Aplicación de descubierto en dos de Spider Mite<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; Estudios interacción planta-plaga

The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae, is a ubiquitous polyphagous arthropod herbivore that feeds on a remarkably broad array of species, with ...

Modifying the Bank Erosion Hazard Index (BEHI) Protocol for Rapid Assessment of Streambank Erosion in Northeastern Ohio

Modifying the Bank Erosion Hazard Index BEHI Protocol for Rapid Assessment of Streambank Erosion in Northeastern Ohio

Modificación del índice (BEHI) Protocolo de riesgo de erosión Banco de Evaluación Rápida de Streambank Erosión en el noreste de Ohio

Understanding the source of pollution in a stream is vital to preserving, restoring, and maintaining the stream&#8217;s function and habitat it provides. ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

Semi-Alto rendimiento para Screening Potencial Sequía-tolerancia en lechuga (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) colecciones de germoplasma

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Selección de alto rendimiento de las Variaciones obstinación en lignocelulósica Biomasa: Total lignina, lignina Monómeros y enzimática Azúcar de lanzamiento

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

The Effect of the Application of Thyme Essential Oil on Microbial Load During Meat Drying

El efecto de la aplicación de aceite esencial de tomillo en la carga microbiana durante el secado de la carne

Meat is a high protein meal that is used in the preparation of jerky, a popular food snack, where preservation and safety are important. To assure food ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

La prueba de infección de planta: Spray y mediada por la herida la inoculación con el patógeno de planta Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Alto rendimiento, microescala protocolo para el análisis de los parámetros de procesamiento y cualidades nutritivas en maíz (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...