Name: ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures at JoVE.com

نشكر نواة قياس التدفق الخلوي WIMM للوصول إلى قياس التدفق الخلوي ، ونواة فحص الفيروسات WIMM لتوليد ناقلات الفيروسات العدسية. تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق كاي كيندال لسرطان الدم ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة.

يجب تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية ، بما في ذلك التربية والقتل الرحيم ، ضمن المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية. تمت الموافقة على التجارب المفصلة أدناه من قبل وزارة الداخلية البريطانية. انظر جدول المواد للحصول على قائمة بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوك?...

<ol>
	<li>Laurenti, E., G&#246;ttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells:+concepts,+definitions,+and+the+new+reality.">Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality.</a> Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).</li><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo.">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).</li><li>Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+haematopoietic+stem+cell+niches.">Adult haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Granot, N., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+hematopoietic+cell+transplantation:+challenges+and+progress.">History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress.</a> Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 1-5 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+haematopoietic-stem-cell+expansion+allows+nonconditioned+transplantation.">Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation.</a> Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+polyvinyl+alcohol+for+chimeric+antigen+receptor+T-cell+expansion.">Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion.</a> Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).</li><li>Becker, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+cell+cloning+platform+for+gene+edited+functional+murine+hematopoietic+stem+cells.">A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+optimization+enables+maintenance+of+quiescent+hematopoietic+stem+cells+ex+vivo.">Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo.</a> Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).</li><li>Kobayashi, H., Takubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+method+to+maintain+quiescent+human+hematopoietic+stem+cells.">A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).</li><li>Aal Wilson, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conditioned+bone+marrow+chimeric+mouse+generation+using+culture-based+enrichment+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice.">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).</li><li>Haney, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+in+vivo+CRISPR+screens+identify+SAGA+complex+members+as+a+key+regulators+of+HSC+lineage+commitment+and+aging.">Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Che, J. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+in+vitro+expanded+hematopoietic+stem+cells.">Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells.</a> EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).</li><li>Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+potential+of+murine+hematopoietic+stem+cells:+a+rare+property+only+partially+predicted+by+phenotype.">Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+guide+RNA+design+guidelines+for+efficient+genome+editing.">CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).</li><li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments.">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+expansion+of+mouse+hematopoietic+stem+cells.">Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells.</a> Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).</li><li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+all-recombinant+protein-based+culture+system+specifically+identifies+hematopoietic+stem+cell+maintenance+factors.">An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li></ol>

نأمل أن يوفر هذا البروتوكول نهجا مفيدا للتحقيق في بيولوجيا HSC وتكون الدم وأمراض الدم بشكل عام. منذ التطوير الأولي لطريقة الاستزراع القائمة على PVA لHSCs 8 المنقاة من FACS ، تم توسيع الطريقة. على سبيل المثال ، ثبت أن الطريقة تعمل مع c-Kit المخصب بنخاع العظام ومع الألواح المشحونة بالسطح<s...

يدعم نظام المكونة للدم مجموعة من العمليات الأساسية في الثدييات ، من إمدادات الأكسجين إلى مكافحة مسببات الأمراض ، من خلال أنواع الدم والخلايا المناعية المتخصصة. يلزم إنتاج الدم المستمر (تكون الدم) لدعم توازن نظام الدم ، والذي تدعمه الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs)1. الخلية المكونة للدم الأكثر بدائية هي الخلية الجذعية المكونة للدم (HSC) ، والتي تتمتع بقدرات فريدة على التجديد الذاتي والتمايز متعدد السلالات 2,3. هذه مجموعة خلايا نادرة ، توجد بشكل رئيسي في نخاع العظمالبالغ 4 ، حيث تحدث بتردد واحد فقط لكل 30000 خلية. يعتقد أن HSCs تدعم تكون الدم مدى الحياة وتساعد على إعادة تكوين الدم بعد الإجهاد الدموي. تسمح هذه القدرات أيضا ل HSCs بإعادة تكوين نظام المكونة للدم بالكامل بثبات بعد الزرع في متلقي مشع5. يمثل هذا التعريف الوظيفي ل HSC ويشكل أيضا الأساس العلمي لعلاج زرع HSC ، وهو علاج علاجي لمجموعة من أمراض الدم والمناعة6. لهذه الأسباب ، HSCs هي محور رئيسي لأمراض الدم التجريبية.
على الرغم من التركيز الكبير للبحث ، فقد ظل من الصعب توسيع HSCs خارج الجسمالحي 7 بثبات. لقد طورنا مؤخرا أول نظام استزراع توسع خارج الجسم الحي طويل الأجل للفأر HSCs8. يمكن أن يؤدي هذا النهج إلى توسيع HSCs القابلة للزرع بمقدار 234-899 ضعفا على مدار 4 أسابيع. بالمقارنة مع النهج البديلة ، كان التغيير الرئيسي في البروتوكول هو إزالة ألبومين المصل واستبداله ببوليمر صناعي. تم تحديد كحول البولي فينيل (PVA) كبوليمر مثالي لمزارع HSC للفأر8 ، والذي تم استخدامه الآن أيضا لاستزراع أنواع الخلايا المكونة للدمالأخرى 9. ومع ذلك ، تم مؤخرا تحديد بوليمر آخر يسمى Soluplus (بوليمر مشترك من البولي فينيل كابرولاكتام - أسيتات - بولي إيثيلين جلايكول) ، والذي يبدو أنه يحسن توسع HSC النسيلي10. قبل استخدام البوليمرات ، تم استخدام ألبومين المصل في شكل مصل بقري جنيني ، أو جزء ألبومين مصل الأبقار V ، أو ألبومين مصل المؤتلف ، ولكن كان لها دعم محدود لتوسيع HSC ودعمت فقط على المدى القصير (~ 1 أسبوع) ثقافة خارج الجسم الحي 7. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن بروتوكولات ثقافة HSC التي تحتفظ ب HSCs في حالة هادئة يمكن أن تدعم وقتا أطول للثقافة خارج الجسم الحي 11,12.
بالمقارنة مع طرق الاستزراع الأخرى ، فإن الميزة الرئيسية للثقافات القائمة على PVA هي عدد الخلايا التي يمكن إنشاؤها وطول الوقت الذي يمكن فيه استخدام البروتوكول لتتبع HSCs خارج الجسم الحي. هذا يتغلب على العديد من الحواجز في مجال أمراض الدم التجريبية ، مثل انخفاض أعداد HSCs المعزولة لكل فأر (بضعة آلاف فقط) وصعوبة تتبع HSCs بمرور الوقت في الجسم الحي. ومع ذلك ، من المهم أن نتذكر أن هذه الثقافات تحفز انتشار HSC ، في حين أن تجمع HSC في الجسم الحي هو في الغالب هادئ في حالة مستقرة13. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن الثقافات انتقائية ل HSCs ، إلا أن أنواع الخلايا الإضافية تتراكم مع الثقافات بمرور الوقت ، ولا تمثل HSCs القابلة للزرع سوى خلية واحدة فقط من كل 34 خلية بعد شهر 1. يبدو أن الخلايا السلفية المكونة للدم النخاعية هي نوع الخلايا الملوثة الرئيسية في ثقافات HSCهذه 8. ومع ذلك ، يمكننا استخدام هذه الثقافات لإثراء HSCs من مجموعات الخلايا غير المتجانسة (على سبيل المثال ، c-Kit + نخاع العظم HSPCs14). كما أنه يدعم النقل أو التثقيب الكهربائي ل HSCs للتلاعب الجيني14،15،16. للمساعدة في تحديد HSCs من مجموعات HSPC المستزرعة غير المتجانسة ، تم تحديد CD201 (EPCR) مؤخرا كعلامة HSC مفيدة خارج الجسم الحي 10،17،18 ، مع HSCs القابلة للزرع تقتصر على CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage- جزء.
يصف هذا البروتوكول طرقا لبدء وصيانة وتقييم ثقافات توسع HSC للفأر القائم على PVA ، بالإضافة إلى بروتوكولات التلاعب الجيني داخل هذه الثقافات باستخدام التثقيب الكهربائي أو نقل ناقل الفيروسات العدسية. من المتوقع أن تكون هذه الطرق مفيدة لمجموعة من أخصائيي أمراض الدم التجريبيين.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12764416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Appleton Woods Ltd</td>
			<td>HC002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle and mortar</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Limited</td>
			<td>X18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>720-2519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>613-5394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech wipes</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>115-2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS MACS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 &#956;g</td>
			<td>IDT&#160;</td>
			<td>1081058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse stem cell factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse thrombopoietin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-315-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127&#160;APC/Cy7 (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD201&#160;APC (clone: eBio1560)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-2012-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4&#160;APC/Cy7 (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R&#160;APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8a&#160;APC/Cy7 (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C&#160;APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119&#160;APC/Cy7 (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 24-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3337</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 96-well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3330</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>F7524-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Coated plates, 96-well</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500.056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61196.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Enzo Life Sciences (UK) Ltd</td>
			<td>EXB-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T&#252;rks&#8217; solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Mettler-Toledo Ltd</td>
			<td>95015662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures

تعد الخلايا الجذعية المكونة للدم متعددة القدرات ذاتية التجديد (HSCs) نوعا مهما من الخلايا نظرا لقدراتها على دعم تكون الدم طوال الحياة وإعادة تكوين نظام الدم بأكمله بعد الزرع. تستخدم HSCs سريريا في علاجات زرع الخلايا الجذعية ، والتي تمثل علاجا شافيا لمجموعة من أمراض الدم. هناك اهتمام كبير بكل من فهم الآليات التي تنظم نشاط HSC وتكون الدم ، وتطوير علاجات جديدة قائمة على HSC. ومع ذلك ، فإن الثقافة المستقرة والتوسع في HSCs خارج الجسم الحي كان عائقا رئيسيا في دراسة هذه الخلايا الجذعية في نظام خارج الجسم الحي القابل للتتبع. لقد طورنا مؤخرا نظام استزراع قائم على كحول البولي فينيل يمكنه دعم التوسع طويل الأجل وواسع النطاق في HSCs للفأر القابلة للزرع وطرق تحريرها وراثيا. يصف هذا البروتوكول طرق زراعة ومعالجة HSCs للفأر وراثيا عن طريق التثقيب الكهربائي ونقل الفيروسات العدسية. من المتوقع أن يكون هذا البروتوكول مفيدا لمجموعة واسعة من أخصائيي أمراض الدم التجريبية المهتمين ببيولوجيا HSC وتكون الدم.

بالنسبة لتنقية FACS ل HSCs ، نتوقع أنه داخل نخاع العظم المخصب ب c-Kit ، ~ 0.2٪ من الخلايا هي CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage- السكان للشباب (8-12 أسبوعا) C57BL / 6 الفئران (الشكل 1). ومع ذلك ، فمن المحتمل أن الفئران المعدلة وراثيا أو الفئران من مختلف الأعمار تظهر ترددات HSC مخ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures at JoVE.com

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

يظهر هنا بروتوكول لبدء وصيانة وتحليل مزارع الخلايا الجذعية المكونة للدم في الفئران باستخدام التوسع القائم على كحول البولي فينيل خارج الجسم الحي ، بالإضافة إلى طرق معالجتها وراثيا عن طريق نقل الفيروسات العدسية والتثقيب الكهربائي.

إكس فيفو التوسع والتلاعب الجيني للخلايا الجذعية المكونة للدم في الفئران في الثقافات القائمة على كحول البولي فينيل

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

يسمح هذا البروتوكول بالتوسع والتلاعب الجيني للخلايا الجذعية المكونة للدم الوظيفية للفأر ، مما يسمح بفهم أعمق لبيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم وتكون الدم. ميزة هذه التقنية هي أنها يمكن أن تدعم الخلايا الجذعية المكونة للدم في الثقافة خارج الجسم الحي على المدى الطويل وتسمح بالتلاعب الجيني لاستجواب علم الوراثة لتكوين الدم. يوفر نظام الاستزراع هذا تقنية منصة للدراسات المختلفة في بيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم وتكون الدم ، بما في ذلك الدراسات الجينية والجزيئية والكيميائية الحيوية.يسرد جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها أسباب وحلول الصراعات الشائعة التي تمت مواجهتها مع هذه التقنية. من الأسهل والأكثر فعالية إظهار كيفية استخراج خلايا نخاع العظم بشكل صحيح وإجراء تغييرات كاملة في الوسائط بدلا من القراءة عنها. لبدء استخراج الخلايا الجذعية المكونة للدم ، أو HSC ، استخدم مناديل المهام الدقيقة الخالية من النسالة لتنظيف العظام المعزولة حديثا من الفئران التي تم قتلها رحيما بشكل صحيح.قم بإزالة العضلات والحبل الشوكي من العظام قبل إضافتها إلى ملاط يحتوي على ما يقرب من ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. باستخدام مدقة ، سحق العظام دون طحنها لتقليل قوى القص. بعد ذلك ، باستخدام إبرة قياس 19 متصلة بحقنة سعة 5 ملليلتر ، قم بتفتيت شظايا نخاع العظم الكبيرة التي تم إطلاقها في PBS ونقل التعليق من خلال مرشح 70 ميكرون إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر.بمجرد نقل التعليق ، كرر العملية باستخدام برنامج تلفزيوني جديد حتى يتم تبييض العظام. استهدف حجما نهائيا يبلغ حوالي 30 ملليلترا لكل فأر و 50 ملليلترا لفأرين لتبييض العظام حتى لا يظهر المزيد من النخاع. استعد لتخصيب العمود عن طريق وضع عمود ترشيح مغناطيسي في مغناطيس فاصل عمود مغناطيسي مع مرشح 50 ميكرون في الأعلى وأنبوب مخروطي 15 ملليلتر أدناه.بعد ذلك ، بعد معالجة الخلايا بالأجسام المضادة allophycocyanin anti-c-Kit والميكروبيدات المغناطيسية allophycocyanin ، قم بتشغيل ثلاثة ملليلتر من PBS المعقم من خلال مرشح 50 ميكرون وعمود الترشيح. بمجرد تشغيل PBS ، مرر تعليق الخلية عبر العمود ، متبوعا بثلاث غسلات من ثلاثة ملليلتر من PBS البارد في كل مرة. بعد كل غسلة ، انتظر حتى يتوقف العمود عن التنقيط قبل إضافة PBS للغسيل التالي.بعد ذلك ، قم بإزالة العمود من المغناطيس وضعه فوق أنبوب جديد سعة 15 ملليلتر وأضف خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني بارد إلى العمود قبل تركيب مكبس العمود عليه وسحب الخلايا عن طريق دفع المكبس. اتبع البروتوكول الموضح في النص لإعداد ما يكفي من وسط HSC للعدد المطلوب من الخلايا أو الآبار لزرع 0.5 إلى 1 مليون خلية لكل ملليلتر. ثم قم بتدوير الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم المخصبة ب c-Kit ، أو HSPCs ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط HSC المحضر حديثا بكثافة الخلية المطلوبة.انقل الخلايا إلى ألواح مشحونة بالسطح مغلفة بالفبرونيكتين أو سالبة ، مع الحفاظ على الحجم المناسب. ضع الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد إزالة اللوحة برفق من حاضنة زراعة الأنسجة دون إزعاج مزارع الخلايا ، استخدم ماصة أو مضخة تفريغ لشفط ما يقرب من 90 إلى 95٪ ببطء من الوسط من الغضروف المفصلي السائل لكل بئر.تجنب سحب وسيط من قاعدة البئر. ثم أضف ملليلتر واحد من الوسط الطازج المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية في البئر. أعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الأنسجة ، وقم بتغيير الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تتطلب التجربة.بعد إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت nucleofection ، انقل تعليق الخلية على الفور إلى أنبوب PCR الذي يحتوي على البروتين النووي الريبي المعقد ، واخلطه برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ببطء. الآن انقل الخليط إلى كوفيت كهربائي بحجم مناسب ببطء شديد ، مع الحفاظ على حركة السوائل المستمرة لتجنب تكوين فقاعات هواء داخل الكوفيت. ثم ، على جهاز الحفر الكهربائي ، حدد موضع الآبار التي يتم تقويضها بالكهرباء.باستخدام شاشة اللمس، حدد برنامج نوع الخلية كإنسان إيجابي CD34 أو اكتب الرمز النبضي EO100، ثم اضغط على الزر موافق ( OK) . انقل الكوفيت إلى جهاز التثقيب الكهربائي واضغط على زر البدء على شاشة اللمس لبدء التثقيب الكهربائي. مباشرة بعد التثقيب الكهربائي ، أضف خمسة أضعاف حجم تفاعل وسط الاستزراع إلى الكوفيت.الآن قم بنقل الخلايا برفق إلى اللوحة المعدة ، ثم ضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة زراعة الأنسجة. بعد إجراء تغيير متوسط كما هو موضح سابقا ، اجمع 10 ميكرولتر من الخلايا وعدها باستخدام محلول Turk بتخفيف 1: 2 باستخدام مقياس الدم. أعد طلاء الجرعة المطلوبة من الخلايا في الألواح المطلية بالفبرونيكتين للتنبيغ ، وبشكل منفصل ، قم بطلاء خلايا التحكم السلبية غير المحولة.ثم أضف ناقل الفيروس العدسي إلى كل خلية تحتوي على بئر ، مع الحفاظ على جرعة 20 وحدة نقل لكل خلية لتحقيق حوالي 30٪ من كفاءة النقل. ومع ذلك ، حدد جرعة الناقل الفيروسي العدسي تجريبيا اعتمادا على المتطلبات التجريبية. أخيرا ، أعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الأنسجة لمدة ست ساعات.قم بإجراء تغيير متوسط كما هو موضح سابقا. أسفر فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ل HSCs المخصبة ب c-Kit عن حوالي 0.2٪ من الخلايا التي كانت إيجابية CD150 ، وسلبية CD34 ، وإيجابية c-Kit ، وإيجابية Sca1 ، وسلبية النسب. بعد أربعة أسابيع من زراعة HSPC ، تم العثور على الكسور الإيجابية CD201 ، وإيجابية CD150 ، وإيجابية c-Kit ، وإيجابية Sca1 ، وسالبة النسب لتكون حوالي 10٪ بعد التحويل باستخدام ناقل فيروسي عدسي يعبر عن GFP ، كانت الخلايا الإيجابية ل GFP حوالي 30٪ عند الالتقاء ، كانت الكثافة المتوقعة للمزارع حوالي 2 مليون خلية لكل ملليلتر.لوحظ ما يقرب من 50٪ من موت الخلايا خلال ال 24 إلى 48 ساعة الأولى قبل إجراء أول تغيير متوسط. ومع ذلك ، بعد أسبوع واحد ، عادت أعداد الخلايا إلى 80 إلى 100٪ من عدد الخلايا المصنفة. تعد التغييرات الدقيقة في الوسائط باستخدام وسائط جديدة ودافئة أمرا بالغ الأهمية لاستقرار طريقة ثقافة HSC هذه على المدى الطويل.منذ نشر الطريقة الأصلية في عام 2019 ، بدأ المجال في استخدامها بطرق مختلفة لدراسة بيولوجيا HSC.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

العزلة وزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

طريقة لثقافة الفرخ المبكر فيفو السابقين الأجنة (الثقافة الجديدة)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral بوساطة خلال ضربة قاضية السابقين فيفو تكون الكريات الحمر في الإنسان خلايا الجذعية المكونة للدم

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

الثقافات البديلة لافرة القوة البشرية الجذعية إنتاج الخلية، الصيانة، والتحليل الوراثي

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

تحليل الوقت الحقيقي ايض الملف في<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافات ماوس المعوية سرداب عضي

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...