Name: ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00
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Wir danken dem WIMM Flow Cytometry Core für den Zugang zur Durchflusszytometrie und dem WIMM Virus Screening Core für die Generierung lentiviraler Vektoren. Diese Arbeit wurde vom Kay Kendall Leukaemia Fund und dem UK Medical Research Council finanziert.

Alle Tierverfahren, einschließlich Zucht und Euthanasie, müssen innerhalb der institutionellen und nationalen Richtlinien durchgeführt werden. Die unten aufgeführten Experimente wurden vom britischen Innenministerium genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie eine Liste aller Materialien, Reagenzien und Geräte, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Vorbereiten von Bestandslösungen
<ol><li>PVA-Lagerlösung<ol><li>Nehmen Sie 50 ml Wasser in Gewe...

<ol>
	<li>Laurenti, E., G&#246;ttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells:+concepts,+definitions,+and+the+new+reality.">Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality.</a> Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).</li><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo.">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).</li><li>Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+haematopoietic+stem+cell+niches.">Adult haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Granot, N., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+hematopoietic+cell+transplantation:+challenges+and+progress.">History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress.</a> Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 1-5 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+haematopoietic-stem-cell+expansion+allows+nonconditioned+transplantation.">Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation.</a> Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+polyvinyl+alcohol+for+chimeric+antigen+receptor+T-cell+expansion.">Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion.</a> Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).</li><li>Becker, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+cell+cloning+platform+for+gene+edited+functional+murine+hematopoietic+stem+cells.">A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+optimization+enables+maintenance+of+quiescent+hematopoietic+stem+cells+ex+vivo.">Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo.</a> Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).</li><li>Kobayashi, H., Takubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+method+to+maintain+quiescent+human+hematopoietic+stem+cells.">A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).</li><li>Aal Wilson, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conditioned+bone+marrow+chimeric+mouse+generation+using+culture-based+enrichment+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice.">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).</li><li>Haney, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+in+vivo+CRISPR+screens+identify+SAGA+complex+members+as+a+key+regulators+of+HSC+lineage+commitment+and+aging.">Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Che, J. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+in+vitro+expanded+hematopoietic+stem+cells.">Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells.</a> EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).</li><li>Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+potential+of+murine+hematopoietic+stem+cells:+a+rare+property+only+partially+predicted+by+phenotype.">Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+guide+RNA+design+guidelines+for+efficient+genome+editing.">CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).</li><li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments.">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+expansion+of+mouse+hematopoietic+stem+cells.">Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells.</a> Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).</li><li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+all-recombinant+protein-based+culture+system+specifically+identifies+hematopoietic+stem+cell+maintenance+factors.">An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li></ol>

Wir hoffen, dass dieses Protokoll einen nützlichen Ansatz zur Untersuchung der HSZ-Biologie, Hämatopoese und Hämatologie im Allgemeinen bietet. Seit der Erstentwicklung der PVA-basierten Kulturmethode für FACS-gereinigte HSCs8 wurde die Methode erweitert. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass die Methode mit c-Kit, angereichert mit Knochenmark, und mit negativ oberflächengeladenen Platten14 funktioniert. Seine Kompatibilität mit Transduktion und Elektroporation wurde eb...

Das hämatopoetische System unterstützt eine Reihe essentieller Prozesse bei Säugetieren, von der Sauerstoffversorgung über die Bekämpfung von Krankheitserregern bis hin zu spezialisierten Blut- und Immunzelltypen. Eine kontinuierliche Blutproduktion (Hämatopoese) ist erforderlich, um die Homöostase des Blutsystems zu unterstützen, die von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) aufrechterhalten wird1. Die primitivste hämatopoetische Zelle ist die hämatopoetische Stammzelle (HSC), die über einzigartige Fähigkeiten zur Selbsterneuerung und Multilineage-Differenzierung verfügt 2,3. Dabei handelt es sich um eine seltene Zellpopulation, die vor allem im adulten Knochenmark4 vorkommt, wo sie mit einer Häufigkeit von nur etwa einer von 30.000 Zellen vorkommt. Es wird angenommen, dass HSZ die lebenslange Hämatopoese unterstützen und helfen, die Hämatopoese nach hämatologischem Stress wiederherzustellen. Diese Kapazitäten ermöglichen es HSZ auch, das gesamte hämatopoetische System nach der Transplantation in einen bestrahlten Empfänger stabil zu rekonstituieren5. Dies stellt die funktionelle Definition einer HSZ dar und bildet auch die wissenschaftliche Grundlage für die HSZ-Transplantationstherapie, eine kurative Behandlung einer Reihe von Blut- und Immunerkrankungen6. Aus diesen Gründen sind HSZ ein wichtiger Schwerpunkt der experimentellen Hämatologie.
Trotz eines großen Forschungsschwerpunkts ist es nach wie vor eine Herausforderung, HSCs ex vivo stabil zu erweitern 7. Vor kurzem haben wir das erste langfristige ex vivo Expansionskultursystem für Maus-HSCs8 entwickelt. Der Ansatz kann transplantierbare HSZ über eine 4-wöchige Kultur um das 234- bis 899-fache erweitern. Im Vergleich zu alternativen Ansätzen bestand die wesentliche Änderung des Protokolls darin, dass Serumalbumin entfernt und durch ein synthetisches Polymer ersetzt wurde. Polyvinylalkohol (PVA) wurde als optimales Polymer für die HSC-Kulturender Maus identifiziert 8, das nun auch zur Kultivierung anderer hämatopoetischer Zelltypen9 verwendet wurde. Kürzlich wurde jedoch auch ein anderes Polymer namens Soluplus (ein Polyvinylcaprolactam-acetat-Polyethylenglykol-Pfropfcopolymer) identifiziert, das die klonale HSC-Expansion zu verbessernscheint 10. Vor der Verwendung von Polymeren wurde Serumalbumin in Form von fötalem Kälberserum, Rinderserumalbuminfraktion V oder rekombinantem Serumalbumin verwendet, die jedoch nur eine begrenzte Unterstützung für die HSC-Expansion boten und nur eine kurzfristige (~1 Woche) ex vivo Kultur unterstützten7. Es sollte jedoch beachtet werden, dass HSC-Kulturprotokolle, die HSCs in einem Ruhezustand halten, eine längere ex vivo Kulturzeit unterstützen können11,12.
Im Vergleich zu anderen Kulturmethoden ist ein großer Vorteil von PVA-basierten Kulturen die Anzahl der Zellen, die erzeugt werden können, und die Zeitspanne, in der das Protokoll verwendet werden kann, um HSZ ex vivo zu verfolgen. Dies überwindet mehrere Barrieren auf dem Gebiet der experimentellen Hämatologie, wie z.B. die geringe Anzahl von HSCs, die pro Maus isoliert werden können (nur einige Tausend) und die Schwierigkeit, HSCs über die Zeit in vivo zu verfolgen. Es ist jedoch wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Kulturen die HSC-Proliferation stimulieren, während der In-vivo-HSC-Pool in einem stationären Zustand überwiegend ruht13. Obwohl die Kulturen selektiv für HSCs sind, reichern sich im Laufe der Zeit zusätzliche Zelltypen mit den Kulturen an, und transplantierbare HSCs machen nach 1 Monat nur etwa eine von 34 Zellen aus. Myeloische hämatopoetische Vorläuferzellen scheinen der wichtigste kontaminierende Zelltyp in diesen HSC-Kulturen zu sein8. Nichtsdestotrotz können wir diese Kulturen zur Anreicherung für HSCs aus heterogenen Zellpopulationen (z.B. c-Kit+ Knochenmark-HSPCs14) verwenden. Es unterstützt auch die Transduktion oder Elektroporation von HSCs für die genetische Manipulation14,15,16. Um die Identifizierung von HSCs aus der heterogen kultivierten HSPC-Population zu erleichtern, wurde CD201 (EPCR) kürzlich als nützlicher ex vivo HSC-Marker10,17,18 identifiziert, wobei transplantierbare HSCs auf die CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage- Fraktion beschränkt sind.
Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Initiierung, Aufrechterhaltung und Bewertung von PVA-basierten HSC-Expansionskulturen der Maus sowie Protokolle zur genetischen Manipulation innerhalb dieser Kulturen mittels Elektroporation oder lentiviraler Vektortransduktion. Es wird erwartet, dass diese Methoden für eine Reihe von experimentellen Hämatologen nützlich sein werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12764416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Appleton Woods Ltd</td>
			<td>HC002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle and mortar</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Limited</td>
			<td>X18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>720-2519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>613-5394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech wipes</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>115-2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS MACS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 &#956;g</td>
			<td>IDT&#160;</td>
			<td>1081058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse stem cell factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse thrombopoietin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-315-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127&#160;APC/Cy7 (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD201&#160;APC (clone: eBio1560)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-2012-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4&#160;APC/Cy7 (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R&#160;APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8a&#160;APC/Cy7 (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C&#160;APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119&#160;APC/Cy7 (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 24-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3337</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 96-well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3330</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>F7524-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Coated plates, 96-well</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500.056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61196.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Enzo Life Sciences (UK) Ltd</td>
			<td>EXB-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T&#252;rks&#8217; solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Mettler-Toledo Ltd</td>
			<td>95015662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures

Selbsterneuernde multipotente hämatopoetische Stammzellen (HSZ) sind aufgrund ihrer Fähigkeit, die Hämatopoese ein Leben lang zu unterstützen und das gesamte Blutsystem nach einer Transplantation zu rekonstituieren, ein wichtiger Zelltyp. HSZ werden klinisch in Stammzelltransplantationstherapien eingesetzt, die eine kurative Behandlung für eine Reihe von Blutkrankheiten darstellen. Es besteht ein großes Interesse sowohl am Verständnis der Mechanismen, die die HSZ-Aktivität und Hämatopoese regulieren, als auch an der Entwicklung neuer HSZ-basierter Therapien. Die stabile Kultivierung und Expansion von HSCs ex vivo war jedoch ein großes Hindernis bei der Untersuchung dieser Stammzellen in einem handhabbaren ex vivo System. Wir haben kürzlich ein auf Polyvinylalkohol basierendes Kultursystem entwickelt, das die langfristige und großflächige Expansion von transplantierbaren Maus-HSCs und Methoden zu deren genetischer Editierung unterstützen kann. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Kultivierung und genetischen Manipulation von Maus-HSCs durch Elektroporation und lentivirale Transduktion. Es wird erwartet, dass dieses Protokoll für ein breites Spektrum von experimentellen Hämatologen nützlich sein wird, die sich für HSZ-Biologie und Hämatopoese interessieren.

Für die FACS-Aufreinigung von HSCs erwarten wir, dass innerhalb des c-Kit-angereicherten Knochenmarks ~0,2% der Zellen die CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage-Population für junge (8-12 Wochen alte) C57BL/6-Mäuse sind (Abbildung 1). Es ist jedoch wahrscheinlich, dass transgene Mäuse oder Mäuse unterschiedlichen Alters unterschiedliche HSZ-Frequenzen aufweisen. Nach 4 Wochen Kultur erwarten wir, dass der CD201+CD150+c-Kit+Sca1<s...

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Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Hier wird ein Protokoll zur Initiierung, Aufrechterhaltung und Analyse hämatopoetischer Stammzellkulturen der Maus unter Verwendung von ex vivo Polyvinylalkohol-basierter Expansion sowie Methoden zur genetischen Manipulation dieser Zellen durch lentivirale Transduktion und Elektroporation vorgestellt.

Ex vivo Expansion und genetische Manipulation von hämatopoetischen Stammzellen der Maus in Kulturen auf Polyvinylalkoholbasis

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Expansion und genetische Manipulation von funktionellen hämatopoetischen Stammzellen der Maus und ermöglicht so ein tieferes Verständnis der Biologie und Hämatopoese hämatopoetischer Stammzellen. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hämatopoetische Stammzellen in einer langfristigen ex vivo Kultur unterstützen kann und eine genetische Manipulation ermöglicht, um die Genetik der Hämatopoese zu hinterfragen. Dieses Kultursystem bietet eine Plattformtechnologie für verschiedene Studien zur hämatopoetischen Stammzellbiologie und Hämatopoese, einschließlich genetischer, molekularer und biochemischer Studien.In der Tabelle zur Fehlerbehebung sind die Ursachen und Lösungen für die häufigsten Probleme aufgeführt, die bei dieser Technik auftreten. Es ist viel einfacher und effektiver zu zeigen, wie man Knochenmarkzellen richtig extrahiert und komplette Medienwechsel durchführt, als darüber zu lesen. Um mit der Extraktion hämatopoetischer Stammzellen (HSC) zu beginnen, verwenden Sie fusselfreie, empfindliche Tücher, um die Knochen zu reinigen, die frisch von ordnungsgemäß eingeschläferten Mäusen isoliert wurden.Entfernen Sie Muskeln und Rückenmark von den Knochen, bevor Sie sie in einen Mörser geben, der etwa drei Milliliter PBS enthält. Zerdrücken Sie die Knochen mit einem Stößel, ohne sie zu zerkleinern, um die Scherkräfte zu minimieren. Brechen Sie dann mit einer 19-Gauge-Nadel, die an einer 5-Milliliter-Spritze befestigt ist, die großen Knochenmarkfragmente auf, die in das PBS freigesetzt werden, und übertragen Sie die Suspension durch einen 70-Mikron-Filter in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.Sobald die Suspension übertragen wurde, wiederholen Sie den Vorgang mit frischem PBS, bis die Knochen gebleicht sind. Streben Sie ein Endvolumen von etwa 30 Millilitern pro Maus und 50 Milliliter für zwei Mäuse an, um die Knochen zu bleichen, bis kein Knochenmark mehr sichtbar ist. Bereiten Sie sich auf die Säulenanreicherung vor, indem Sie eine magnetische Filtrationssäule in den Magneten eines Magnetsäulenseparators mit einem 50-Mikron-Filter oben und einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen unten einsetzen.Nachdem Sie die Zellen mit Allophycocyanin-Anti-c-Kit-Antikörpern und magnetischen Allophycocyanin-Mikrokügelchen behandelt haben, lassen Sie als Nächstes drei Milliliter steriles PBS durch den 50-Mikron-Filter und die Filtrationssäule laufen. Sobald das PBS durchlaufen ist, führen Sie die Zellsuspension durch die Säule, gefolgt von drei Waschgängen mit jeweils drei Millilitern kaltem PBS. Warten Sie nach jedem Waschgang, bis die Säule aufgehört hat zu tropfen, bevor Sie PBS für den nächsten Waschgang hinzufügen.Entfernen Sie als Nächstes die Säule vom Magneten und legen Sie sie auf ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen und geben Sie fünf Milliliter kaltes PBS in die Säule, bevor Sie den Säulenkolben darauf montieren und die Zellen durch Drücken des Kolbens eluieren. Befolgen Sie das im Text beschriebene Protokoll, um genügend HSC-Medium für die gewünschte Anzahl von Zellen oder Vertiefungen vorzubereiten, um 0,5 bis 1 Million Zellen pro Milliliter zu besiedeln. Anschließend werden die c-Kit-angereicherten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) heruntergedreht und das Pellet im frisch präparierten HSC-Medium mit der gewünschten Zelldichte resuspendiert.Übertragen Sie die Zellen unter Beibehaltung des entsprechenden Volumens auf Fibronektin-beschichtete oder negativ oberflächengeladene Platten. Legen Sie die Zellen in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nachdem Sie die Platte vorsichtig aus dem Gewebekultur-Inkubator entfernt haben, ohne die Zellkulturen zu stören, verwenden Sie eine Pipette oder Vakuumpumpe, um langsam etwa 90 bis 95 % des Mediums aus dem flüssigen Meniskus jeder Vertiefung anzusaugen.Vermeiden Sie es, Medium vom Boden der Vertiefung aufzuziehen. Dann einen Milliliter frisches, auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes Medium in die Mulde geben. Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator für Gewebekulturen zurück und wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, bis das Experiment dies erfordert.Nachdem Sie die Zellen in Nukleofektionspuffer resuspendiert haben, übertragen Sie die Zellsuspension sofort in das PCR-Röhrchen, das das komplexierte Ribonukleoprotein enthält, und mischen Sie sie vorsichtig durch langsames Auf- und Abpipettieren. Übertragen Sie nun das Gemisch sehr langsam in eine Elektroporationsküvette mit entsprechendem Volumen und halten Sie eine kontinuierliche Flüssigkeitsbewegung aufrecht, um die Bildung von Luftblasen in der Küvette zu vermeiden. Wählen Sie dann auf dem Elektroporator die Position der zu elektroporierenden Wells aus.Wählen Sie über den Touchscreen das Zelltypprogramm als CD34-positiver Mensch aus oder geben Sie den Impulscode EO100 ein und drücken Sie dann die OK-Taste. Übertragen Sie die Küvette in den Elektroporator und drücken Sie die Starttaste auf dem Touchscreen, um die Elektroporation zu starten. Unmittelbar nach der Elektroporation wird das fünffache Reaktionsvolumen des Nährmediums in die Küvette gegeben.Übertragen Sie nun die Zellen vorsichtig auf die vorbereitete Platte und legen Sie die Platte wieder in den Gewebekultur-Inkubator. Nachdem Sie einen Mediumwechsel durchgeführt haben, wie zuvor gezeigt, sammeln Sie 10 Mikroliter der Zellen und zählen Sie sie mit Turk-Lösung in einer Verdünnung von 1:2 mit einem Hämozytometer. Die erforderliche Dosis der Zellen wird für die Transduktion in mit Fibronektin beschichteten Platten neu plattiert und die nicht transduzierten Negativkontrollzellen separat plattiert.Fügen Sie dann den lentiviralen Vektor zu jeder Vertiefung hinzu, die Zellen enthält, wobei eine Dosis von 20 Transduktionseinheiten pro Zelle beibehalten wird, um eine Transduktionseffizienz von etwa 30 % zu erreichen. Die lentivirale Vektordosis ist jedoch empirisch in Abhängigkeit von den experimentellen Anforderungen zu bestimmen. Zum Schluss werden die Zellen für sechs Stunden in den Gewebekultur-Inkubator zurückgeführt.Führen Sie einen Medienwechsel wie zuvor beschrieben durch. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung der c-Kit-angereicherten HSCs ergab etwa 0,2% der Zellen, die CD150-positiv, CD34-negativ, c-Kit-positiv, Sca1-positiv und liniennegativ waren. Nach vierwöchiger HSPC-Kultur betrug die CD201-positive, CD150-positive, c-Kit-positive, Sca1-positive und lineage-negative Fraktion etwa 10 %Nach der Transduktion mit einem GFP-exprimierenden lentiviralen Vektor betrugen die GFP-positiven Zellen etwa 30 %Bei der Konfluation betrug die erwartete Dichte der Kulturen etwa 2 Millionen Zellen pro Milliliter.Innerhalb der ersten 24 bis 48 Stunden vor dem ersten Mediumwechsel wurde ein Zelltod von etwa 50 % beobachtet. Nach einer Woche kehrte die Zellzahl jedoch auf 80 bis 100 % der ausgesäten Zellzahl zurück. Genaue Medienwechsel mit frischen und vorgewärmten Medien sind entscheidend für die Langzeitstabilität dieser HSC-Kulturmethode.Seit der Veröffentlichung der ursprünglichen Methode im Jahr 2019 hat das Fachgebiet begonnen, sie auf unterschiedliche Weise zur Untersuchung der HSZ-Biologie einzusetzen.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Forschung

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Echtzeit-Analyse von Stoffwechselprofil in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Intestinale Crypt Organoide Kulturen

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...