Name: ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures at JoVE.com

אנו מודים ל-WIMM Flow Cytometry Core על הגישה לציטומטריית זרימה, ול-WIMM Virus Screening Core על יצירת וקטורים לנטיויראליים. עבודה זו מומנה על ידי קרן קיי קנדל ללוקמיה והמועצה הבריטית למחקר רפואי.

כל ההליכים בבעלי חיים, כולל גידול והמתת חסד, חייבים להתבצע במסגרת הנחיות מוסדיות ולאומיות. הניסויים המפורטים להלן אושרו על ידי משרד הפנים הבריטי. עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה של כל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת פתרונות מלאי
<ol><l...

<ol>
	<li>Laurenti, E., G&#246;ttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells:+concepts,+definitions,+and+the+new+reality.">Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality.</a> Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).</li><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo.">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).</li><li>Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+haematopoietic+stem+cell+niches.">Adult haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Granot, N., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+hematopoietic+cell+transplantation:+challenges+and+progress.">History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress.</a> Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 1-5 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+haematopoietic-stem-cell+expansion+allows+nonconditioned+transplantation.">Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation.</a> Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+polyvinyl+alcohol+for+chimeric+antigen+receptor+T-cell+expansion.">Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion.</a> Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).</li><li>Becker, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+cell+cloning+platform+for+gene+edited+functional+murine+hematopoietic+stem+cells.">A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+optimization+enables+maintenance+of+quiescent+hematopoietic+stem+cells+ex+vivo.">Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo.</a> Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).</li><li>Kobayashi, H., Takubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+method+to+maintain+quiescent+human+hematopoietic+stem+cells.">A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).</li><li>Aal Wilson, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conditioned+bone+marrow+chimeric+mouse+generation+using+culture-based+enrichment+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice.">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).</li><li>Haney, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+in+vivo+CRISPR+screens+identify+SAGA+complex+members+as+a+key+regulators+of+HSC+lineage+commitment+and+aging.">Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Che, J. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+in+vitro+expanded+hematopoietic+stem+cells.">Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells.</a> EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).</li><li>Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+potential+of+murine+hematopoietic+stem+cells:+a+rare+property+only+partially+predicted+by+phenotype.">Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+guide+RNA+design+guidelines+for+efficient+genome+editing.">CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).</li><li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments.">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+expansion+of+mouse+hematopoietic+stem+cells.">Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells.</a> Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).</li><li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+all-recombinant+protein-based+culture+system+specifically+identifies+hematopoietic+stem+cell+maintenance+factors.">An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li></ol>

אנו מקווים כי פרוטוקול זה מספק גישה שימושית לחקור ביולוגיה HSC, hematopoiesis, והמטולוגיה באופן כללי יותר. מאז הפיתוח הראשוני של שיטת התרבית מבוססת PVA עבור HSCsמטוהרים FAC 8, השיטה הורחבה. לדוגמה, השיטה הוכחה כעובדת עם c-Kit מועשר במח עצם ועם לוחות טעונים במשטח שלילי14. תאימותו עם...

המערכת ההמטופויטית תומכת במגוון תהליכים חיוניים ביונקים, החל מאספקת חמצן ועד לחימה בפתוגנים, דרך סוגי דם מיוחדים ותאי חיסון. ייצור דם רציף (hematopoiesis) נדרש לתמיכה בהומאוסטזיס של מערכת הדם, אשר נתמך על ידי תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs)1. התא ההמטופויטי הפרימיטיבי ביותר הוא תא גזע המטופויטי (HSC), בעל יכולות ייחודיות להתחדשות עצמית והתמיינות רב-שושלות 2,3. זוהי אוכלוסיית תאים נדירה, המצויה בעיקר במח עצם4 הבוגר, שם הם מופיעים בתדירות של אחד בלבד לכל 30,000 תאים. מאמינים כי HSCs תומכים בהמטופויזה לכל החיים ועוזרים לבסס מחדש את ההמטופויזה לאחר לחץ המטולוגי. יכולות אלה גם מאפשרות ל-HSCs לבנות מחדש ביציבות את כל המערכת ההמטופויטית לאחר השתלה במושתל מוקרן5. זה מייצג את ההגדרה הפונקציונלית של HSC וגם מהווה את הבסיס המדעי לטיפול השתלת HSC, טיפול מרפא למגוון מחלות דם וחיסון6. מסיבות אלה, HSCs הם מוקד עיקרי של המטולוגיה ניסיונית.
למרות מיקוד גדול של מחקר, זה נשאר מאתגר להרחיב ביציבות HSCs ex vivo7. לאחרונה פיתחנו את מערכת תרבית ההרחבה הראשונה לטווח ארוך ex vivo עבור HSCsעכבר 8. הגישה יכולה להרחיב את HSCs להשתלה פי 234-899 על פני תרבית של 4 שבועות. בהשוואה לגישות חלופיות, השינוי העיקרי בפרוטוקול היה הסרת אלבומין בסרום והחלפתו בפולימר סינתטי. אלכוהול פוליוויניל (PVA) זוהה כפולימר אופטימלי עבור תרביות HSC8 של עכבר, אשר שימש כעת גם לתרבית סוגי תאים המטופויטיים אחרים9. עם זאת, פולימר נוסף בשם Soluplus (פוליוויניל caprolactam-אצטט-פוליאתילן גליקול שתל קופולימר) זוהה גם הוא לאחרונה, אשר נראה כי הוא משפר את הרחבת HSC השבט10. לפני השימוש בפולימרים, אלבומין בסרום בצורה של סרום בקר עוברי, אלבומין בסרום בקר V, או אלבומין בסרום רקומביננטי, אך אלה תמכו באופן מוגבל בהרחבת HSC ותמכו רק בתרבית ex vivo לטווח קצר (~ 1 שבוע)7. עם זאת, יש לציין כי פרוטוקולי תרבות HSC השומרים על HSC במצב שקט יכולים לתמוך בזמן תרבות ex vivo ארוך יותר11,12.
בהשוואה לשיטות תרבית אחרות, יתרון מרכזי של תרביות מבוססות PVA הוא מספר התאים שניתן לייצר ומשך הזמן שניתן להשתמש בפרוטוקול כדי לעקוב אחר HSCs ex vivo. זה מתגבר על כמה חסמים בתחום ההמטולוגיה הניסויית, כגון המספר הנמוך של HSCs לבודד לכל עכבר (רק כמה אלפים) ואת הקושי לעקוב אחר HSCs לאורך זמן in vivo. עם זאת, חשוב לזכור כי תרבויות אלה מעוררות את התפשטות HSC, בעוד שמאגר ה- HSC in vivo הוא בעיקר שקט במצב יציב13. בנוסף, למרות שהתרביות סלקטיביות עבור HSCs, סוגי תאים נוספים מצטברים עם התרביות לאורך זמן, ותאי HSC להשתלה מייצגים רק אחד מכל 34 תאים לאחר חודש אחד. תאי אב מיאלואידים המטופויטיים נראים כסוג התא המזהם העיקרי בתרביות HSC אלה8. אף על פי כן, אנו יכולים להשתמש בתרביות אלה כדי להעשיר עבור HSCs מאוכלוסיות תאים הטרוגניות (למשל, c-Kit+ מח עצם HSPCs14). הוא תומך גם בהתמרה או אלקטרופורציה של HSCs למניפולציה גנטית14,15,16. כדי לסייע בזיהוי HSCs מאוכלוסיית HSPC בתרבית הטרוגנית, CD201 (EPCR) זוהה לאחרונה כסמן HSC שימושי ex vivo 10,17,18, כאשר HSCs הניתנים להשתלה מוגבלים לשבר CD201+CD150+c-Kit+Sca1+שושלת.
פרוטוקול זה מתאר שיטות ליזום, לתחזק ולהעריך תרביות הרחבת HSC עכבר מבוססות PVA, כמו גם פרוטוקולים למניפולציה גנטית בתוך תרבויות אלה באמצעות אלקטרופורציה או התמרה וקטורית לנטיויראלית. שיטות אלה צפויות להיות שימושיות עבור מגוון של המטולוגים ניסיוניים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12764416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Appleton Woods Ltd</td>
			<td>HC002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle and mortar</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Limited</td>
			<td>X18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>720-2519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>613-5394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech wipes</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>115-2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS MACS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 &#956;g</td>
			<td>IDT&#160;</td>
			<td>1081058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse stem cell factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse thrombopoietin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-315-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127&#160;APC/Cy7 (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD201&#160;APC (clone: eBio1560)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-2012-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4&#160;APC/Cy7 (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R&#160;APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8a&#160;APC/Cy7 (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C&#160;APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119&#160;APC/Cy7 (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 24-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3337</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 96-well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3330</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>F7524-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Coated plates, 96-well</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500.056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61196.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Enzo Life Sciences (UK) Ltd</td>
			<td>EXB-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T&#252;rks&#8217; solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Mettler-Toledo Ltd</td>
			<td>95015662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures

תאי גזע המטופויטיים רב-פוטנטיים המתחדשים מעצמם (HSC) הם סוג תא חשוב בשל יכולותיהם לתמוך בהמטופוייזה לאורך כל החיים ולבנות מחדש את מערכת הדם כולה לאחר ההשתלה. HSCs משמשים קלינית בטיפולי השתלת תאי גזע, המייצגים טיפול מרפא למגוון מחלות דם. יש עניין רב הן בהבנת המנגנונים המווסתים את פעילות HSC והמטופויזיס, והן בפיתוח טיפולים חדשים מבוססי HSC. עם זאת, התרבית היציבה וההתרחבות של HSCs ex vivo היוו מחסום מרכזי בחקר תאי גזע אלה במערכת אקס ויוו טרקטיבית. לאחרונה פיתחנו מערכת תרבית מבוססת אלכוהול פוליוויניל שיכולה לתמוך בהרחבה ארוכת טווח ובקנה מידה גדול של HSCs עכברים מושתלים ושיטות לערוך אותם גנטית. פרוטוקול זה מתאר שיטות לתרבית ומניפולציה גנטית של HSCs עכברים באמצעות אלקטרופורציה והתמרה לנטיוויראלית. פרוטוקול זה צפוי להיות שימושי למגוון רחב של המטולוגים ניסיוניים המעוניינים בביולוגיה של HSC והמטופואזיס.

עבור טיהור FACS של HSCs, אנו מצפים שבתוך מח העצם המועשר ב-c-Kit, ~0.2% מהתאים הם אוכלוסיית CD150+CD34-c-Kit+Sca1+שושלת עבור עכברי C57BL/6 צעירים (בני 8-12 שבועות) (איור 1). עם זאת, סביר להניח כי עכברים טרנסגניים או עכברים בגילאים שונים מציגים תדרי HSC שונים. לאחר 4 שבועות של ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures at JoVE.com

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

מוצג כאן פרוטוקול לייזום, תחזוקה וניתוח של תרביות תאי גזע המטופויטיים של עכברים באמצעות הרחבה מבוססת אלכוהול פוליוויניל ex vivo , כמו גם שיטות למניפולציה גנטית שלהם על ידי התמרה לנטיווירלית ואלקטרופורציה.

אקס ויוו הרחבה ומניפולציה גנטית של תאי גזע המטופויטיים של עכברים בתרביות מבוססות אלכוהול פוליוויניל

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

פרוטוקול זה מאפשר הרחבה ומניפולציה גנטית של תאי גזע המטופויטיים פונקציונליים של עכברים, ומאפשר הבנה עמוקה יותר של ביולוגיה של תאי גזע המטופויטיים והמטופויזיס. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לתמוך בתאי גזע המטופויטיים בתרבית אקס ויו ארוכת טווח ולאפשר מניפולציה גנטית כדי לחקור את הגנטיקה של המטופויזה. מערכת תרבית זו מספקת טכנולוגיית פלטפורמה למחקרים שונים בביולוגיה של תאי גזע המטופויטיים והמטופויזיס, כולל מחקרים גנטיים, מולקולריים וביוכימיים.טבלת פתרון הבעיות מפרטת את הסיבות והפתרונות למאבקים הנפוצים שבהם נתקלת טכניקה זו. הרבה יותר קל ויעיל להראות איך לחלץ נכון תאי מח עצם ולבצע שינויי מדיה מלאים במקום לקרוא על זה. כדי להתחיל במיצוי תאי גזע המטופויטיים, או HSC, השתמשו במגבוני משימה עדינים ללא סיבים כדי לנקות את העצמות שבודדו זה עתה מעכברים שעברו המתת חסד נכונה.הסר את השרירים ואת חוט השדרה מהעצמות לפני הוספתם למכתש המכיל כשלושה מיליליטר PBS. באמצעות מזיק, למחוץ את העצמות מבלי לטחון אותם כדי למזער את כוחות הגזירה. לאחר מכן, באמצעות מחט 19 מד המחוברת למזרק 5 מיליליטר, לפרק את שברי מח העצם הגדולים ששוחררו לתוך PBS ולהעביר את המתלה דרך מסנן 70 מיקרון לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר.לאחר העברת המתלים, חזור על התהליך עם PBS טרי עד שהעצמות מולבנים. יש לשאוף לנפח סופי של כ-30 מיליליטר לעכבר ו-50 מיליליטר לשני עכברים שילבינו את העצמות עד שלא ייראה מח מוח נוסף. התכוננו להעשרת עמודים על ידי הצבת עמוד סינון מגנטי לתוך מגנט של מפריד עמודים מגנטי עם מסנן 50 מיקרון למעלה וצינור חרוטי 15 מיליליטר מתחת.לאחר מכן, לאחר טיפול בתאים עם נוגדן אנטי-c-Kit אלופיקוציאנין ומיקרו-חרוזים מגנטיים אלופיקוציאנין, הפעל שלושה מיליליטר של PBS סטרילי דרך מסנן 50 מיקרון ועמודת הסינון. לאחר שה-PBS עבר, העבירו את תרחיף התא דרך העמודה, ואחריו שלוש שטיפות של שלושה מיליליטר של PBS קר בכל פעם. לאחר כל כביסה, המתינו עד שהעמוד יפסיק לטפטף לפני הוספת PBS לשטיפה הבאה.לאחר מכן, הסר את העמוד מהמגנט והנח אותו על גבי צינור טרי של 15 מיליליטר והוסף חמישה מיליליטר של PBS קר לתוך העמוד לפני התאמת בוכנה העמוד אליו ופליטת התאים על ידי דחיפת הבוכנה. עקוב אחר הפרוטוקול המתואר בטקסט כדי להכין מספיק מדיום HSC למספר הרצוי של תאים או בארות לזרוע 0.5 עד 1 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן סובבו מטה את תאי הגזע ותאי האב ההמטופויטיים המועשרים ב-c-Kit, או HSPCs, והשהו מחדש את הגלולה בתווך HSC שזה עתה הוכן בצפיפות התא הרצויה.העבר את התאים ללוחות מצופים פיברונקטין או טעוני משטח שליליים, תוך שמירה על נפח מתאים. מקמים את התאים באינקובטור תרבית רקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר הסרה עדינה של הצלחת מאינקובטור תרביות הרקמה מבלי להפריע לתרביות התא, השתמשו בפיפטה או במשאבת ואקום כדי לשאוף באיטיות כ-90% עד 95% מהתווך מהמניסקוס הנוזלי של כל באר.הימנעו מציור מדיום מבסיס הבאר. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום טרי שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס לתוך הבאר. מחזירים את הצלחת לאינקובטור תרביות הרקמה, ומחליפים מדיה כל יומיים-שלושה עד שהניסוי דורש.לאחר השעיה מחדש של התאים במאגר נוקלאופקציה, העבירו מיד את תרחיף התא לצינור ה-PCR המכיל את הריבונוקלאו פרוטאין המורכב, וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג מעלה ומטה באיטיות. כעת מעבירים את התערובת לקובט אלקטרופורציה בנפח מתאים לאט מאוד, תוך שמירה על תנועת נוזל רציפה כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בתוך הקובט. לאחר מכן, על electroporator, לבחור את המיקום של הבארות להיות electroporated.באמצעות מסך המגע, בחר את תוכנית סוג התא כאדם חיובי CD34 או הקלד את קוד הדופק EO100 ולאחר מכן לחץ על הלחצן אישור. העבר את הקובט לאלקטרופורטור ולחץ על לחצן התחל במסך המגע כדי להתחיל אלקטרופורציה. מיד לאחר ההתחשמלות, מוסיפים לקובט פי חמישה מנפח התגובה של מדיום התרבית.כעת מעבירים בעדינות את התאים לצלחת המוכנה, ומחזירים את הצלחת לאינקובטור תרבית הרקמות. לאחר ביצוע שינוי בינוני כפי שהודגם קודם לכן, לאסוף 10 מיקרוליטר של התאים ולספור אותם באמצעות הפתרון של טורק בדילול של 1: 2 עם המוציטומטר. להחזיר את המינון הנדרש של תאים בלוחות מצופים פיברונקטין להתמרה, ובנפרד, צלחת את תאי הבקרה השליליים untransduced.לאחר מכן הוסף את הווקטור הלנטיויראלי לכל באר המכילה תאים, תוך שמירה על מינון של 20 יחידות התמרה לכל תא כדי להשיג יעילות התמרה של כ -30%. עם זאת, לקבוע את מינון וקטור lentiviral באופן אמפירי בהתאם לדרישות הניסוי. לבסוף, להחזיר את התאים לאינקובטור תרבית הרקמה למשך שש שעות.בצע שינוי בינוני כפי שתואר קודם לכן. מיון התאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות של HSCs מועשרים ב-c-Kit הניב כ-0.2% מהתאים שהיו חיוביים ל-CD150, CD34-שליליים, c-Kit-חיוביים, Sca1-חיוביים ושושלת שלילית. לאחר ארבעה שבועות של תרבית HSPC, נמצא כי השברים החיוביים ל-CD201, CD150-חיוביים, c-Kit-חיוביים, Sca1-חיוביים ושושלות שליליים הם כ-10%לאחר התמרה עם וקטור לנטי-ויראלי המבטא GFP, התאים החיוביים ל-GFP היו כ-30% כאשר הם נפגשים, הצפיפות הצפויה של התרביות הייתה סביב 2 מיליון תאים למיליליטר.כ-50% מוות תאי נצפה במהלך 24 עד 48 השעות הראשונות לפני ביצוע השינוי הבינוני הראשון. עם זאת, לאחר שבוע, מספרי התאים חזרו ל-80% עד 100% ממספר התאים שנזרעו. שינויי מדיה מדויקים באמצעות מדיה רעננה ומחוממת מראש הם קריטיים ליציבות ארוכת הטווח של שיטת תרבות HSC זו.מאז פורסמה השיטה המקורית בשנת 2019, החל התחום להשתמש בה בדרכים שונות לחקר ביולוגיה של HSC.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

אמיתי ניתוח זמן של פרופיל המטבולי ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות עכבר המעיים קריפטה Organoid

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...