Name: ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures at JoVE.com

Ringraziamo il WIMM Flow Cytometry Core per l'accesso alla citometria a flusso e il WIMM Virus Screening Core per la generazione di vettori lentivirali. Questo lavoro è stato finanziato dal Kay Kendall Leukaemia Fund e dal Medical Research Council del Regno Unito.

Tutte le procedure sugli animali, compreso l'allevamento e l'eutanasia, devono essere eseguite all'interno di linee guida istituzionali e nazionali. Gli esperimenti descritti di seguito sono stati approvati dal Ministero degli Interni del Regno Unito. Vedere la tabella dei materiali per un elenco di tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzate in questo protocollo.
1. Preparazione delle soluzioni stock
<ol><li>Soluzione stock PVA<ol><li>Prel...

<ol>
	<li>Laurenti, E., G&#246;ttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells:+concepts,+definitions,+and+the+new+reality.">Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality.</a> Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).</li><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo.">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).</li><li>Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+haematopoietic+stem+cell+niches.">Adult haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Granot, N., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+hematopoietic+cell+transplantation:+challenges+and+progress.">History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress.</a> Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 1-5 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+haematopoietic-stem-cell+expansion+allows+nonconditioned+transplantation.">Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation.</a> Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+polyvinyl+alcohol+for+chimeric+antigen+receptor+T-cell+expansion.">Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion.</a> Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).</li><li>Becker, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+cell+cloning+platform+for+gene+edited+functional+murine+hematopoietic+stem+cells.">A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+optimization+enables+maintenance+of+quiescent+hematopoietic+stem+cells+ex+vivo.">Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo.</a> Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).</li><li>Kobayashi, H., Takubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+method+to+maintain+quiescent+human+hematopoietic+stem+cells.">A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).</li><li>Aal Wilson, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conditioned+bone+marrow+chimeric+mouse+generation+using+culture-based+enrichment+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice.">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).</li><li>Haney, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+in+vivo+CRISPR+screens+identify+SAGA+complex+members+as+a+key+regulators+of+HSC+lineage+commitment+and+aging.">Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Che, J. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+in+vitro+expanded+hematopoietic+stem+cells.">Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells.</a> EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).</li><li>Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+potential+of+murine+hematopoietic+stem+cells:+a+rare+property+only+partially+predicted+by+phenotype.">Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+guide+RNA+design+guidelines+for+efficient+genome+editing.">CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).</li><li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments.">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+expansion+of+mouse+hematopoietic+stem+cells.">Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells.</a> Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).</li><li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+all-recombinant+protein-based+culture+system+specifically+identifies+hematopoietic+stem+cell+maintenance+factors.">An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li></ol>

Speriamo che questo protocollo fornisca un approccio utile per indagare la biologia delle HSC, l'ematopoiesi e l'ematologia più in generale. Dopo lo sviluppo iniziale del metodo di coltura basato su PVA per le HSC purificate FACS8, il metodo è stato esteso. Ad esempio, il metodo ha dimostrato di funzionare con c-Kit arricchito con midollo osseo e con piastre caricate superficialmente negative14. La sua compatibilità con la trasduzione e l'elettroporazione è stata dimost...

Il sistema ematopoietico supporta una serie di processi essenziali nei mammiferi, dall'apporto di ossigeno alla lotta contro gli agenti patogeni, attraverso tipi specializzati di cellule del sangue e immunitarie. La produzione continua di sangue (emopoiesi) è necessaria per sostenere l'omeostasi del sistema sanguigno, che è sostenuta dalle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC)1. La cellula ematopoietica più primitiva è la cellula staminale ematopoietica (HSC), che ha capacità uniche di auto-rinnovamento e differenziazione multilineare 2,3. Questa è una popolazione di cellule rare, che si trova principalmente nel midollo osseo adulto4, dove si verificano ad una frequenza di circa una ogni 30.000 cellule. Si ritiene che le HSC supportino l'ematopoiesi per tutta la vita e contribuiscano a ristabilire l'ematopoiesi dopo stress ematologico. Queste capacità consentono inoltre alle HSC di ricostituire stabilmente l'intero sistema ematopoietico dopo il trapianto in un ricevente irradiato5. Questo rappresenta la definizione funzionale di una HSC e costituisce anche la base scientifica per la terapia di trapianto di HSC, un trattamento curativo per una serie di malattie del sangue e immunitarie6. Per questi motivi, le HSC sono un obiettivo importante dell'ematologia sperimentale.
Nonostante un grande focus di ricerca, è rimasto difficile espandere stabilmente le HSC ex vivo7. Recentemente abbiamo sviluppato il primo sistema di coltura di espansione ex vivo a lungo termine per HSC di topo8. L'approccio può espandere le HSC trapiantabili di 234-899 volte in una coltura di 4 settimane. Rispetto agli approcci alternativi, il principale cambiamento nel protocollo è stata la rimozione dell'albumina sierica e la sua sostituzione con un polimero sintetico. L'alcol polivinilico (PVA) è stato identificato come un polimero ottimale per le colture HSC di topo8, che ora è stato utilizzato anche per la coltura di altri tipi di cellule ematopoietiche9. Tuttavia, è stato recentemente identificato anche un altro polimero chiamato Soluplus (un copolimero di innesto di polivinil-caprolattame-acetato-polietilenglicole), che sembra migliorare l'espansione clonale HSC10. Prima dell'uso dei polimeri, venivano utilizzate albumina sierica sotto forma di siero bovino fetale, frazione di albumina sierica bovina V o albumina sierica ricombinante, ma questi avevano un supporto limitato per l'espansione HSC e supportavano solo colture ex vivo a breve termine (~ 1 settimana)7. Tuttavia, va notato che i protocolli di coltura HSC che mantengono le HSC in uno stato quiescente possono supportare un tempo di coltura ex vivo più lungo11,12.
Rispetto ad altri metodi di coltura, uno dei principali vantaggi delle colture basate su PVA è il numero di cellule che possono essere generate e il periodo di tempo in cui il protocollo può essere utilizzato per tracciare le HSC ex vivo. Questo supera diverse barriere nel campo dell'ematologia sperimentale, come il basso numero di HSC isolabili per topo (solo poche migliaia) e la difficoltà di tracciare le HSC nel tempo in vivo. Tuttavia, è importante ricordare che queste colture stimolano la proliferazione delle HSC, mentre il pool di HSC in vivo è prevalentemente quiescente allo stato stazionario13. Inoltre, sebbene le colture siano selettive per le HSC, ulteriori tipi di cellule si accumulano con le colture nel tempo e le HSC trapiantabili rappresentano solo circa una su 34 cellule dopo 1 mese. Le cellule progenitrici ematopoietiche mieloidi sembrano essere il principale tipo di cellula contaminante in queste colture di HSC8. Tuttavia, possiamo usare queste colture per arricchire per HSC da popolazioni cellulari eterogenee (ad esempio, c-Kit+ midollo osseo HSPCs14). Supporta anche la trasduzione o l'elettroporazione delle HSC per la manipolazione genetica14,15,16. Per aiutare a identificare le HSC dalla popolazione eterogenea di HSPC, CD201 (EPCR) è stato recentemente identificato come un utile marcatore HSC ex vivo 10,17,18, con HSC trapiantabili limitate alla frazione CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-.
Questo protocollo descrive i metodi per avviare, mantenere e valutare colture di espansione HSC di topo basate su PVA, nonché protocolli per la manipolazione genetica all'interno di queste colture utilizzando l'elettroporazione o la trasduzione del vettore lentivirale. Questi metodi dovrebbero essere utili per una serie di ematologi sperimentali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12764416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Appleton Woods Ltd</td>
			<td>HC002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle and mortar</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Limited</td>
			<td>X18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>720-2519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>613-5394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech wipes</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>115-2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS MACS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 &#956;g</td>
			<td>IDT&#160;</td>
			<td>1081058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse stem cell factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse thrombopoietin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-315-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127&#160;APC/Cy7 (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD201&#160;APC (clone: eBio1560)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-2012-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4&#160;APC/Cy7 (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R&#160;APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8a&#160;APC/Cy7 (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C&#160;APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119&#160;APC/Cy7 (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 24-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3337</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 96-well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3330</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>F7524-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Coated plates, 96-well</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500.056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61196.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Enzo Life Sciences (UK) Ltd</td>
			<td>EXB-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T&#252;rks&#8217; solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Mettler-Toledo Ltd</td>
			<td>95015662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures

Le cellule staminali ematopoietiche multipotenti (HSC) autorinnovanti sono un tipo di cellula importante grazie alla loro capacità di sostenere l'ematopoiesi per tutta la vita e ricostituire l'intero sistema sanguigno dopo il trapianto. Le HSC sono utilizzate clinicamente nelle terapie di trapianto di cellule staminali, che rappresentano un trattamento curativo per una serie di malattie del sangue. C'è un notevole interesse sia nella comprensione dei meccanismi che regolano l'attività delle HSC e l'emopoiesi, sia nello sviluppo di nuove terapie basate sulle HSC. Tuttavia, la coltura stabile e l'espansione delle HSC ex vivo è stata una barriera importante nello studio di queste cellule staminali in un sistema ex vivo trattabile. Recentemente abbiamo sviluppato un sistema di coltura a base di alcol polivinilico in grado di supportare l'espansione a lungo termine e su larga scala delle HSC di topo trapiantabili e dei metodi per modificarle geneticamente. Questo protocollo descrive i metodi per coltivare e manipolare geneticamente le HSC del topo tramite elettroporazione e trasduzione lentivirale. Questo protocollo dovrebbe essere utile a una vasta gamma di ematologi sperimentali interessati alla biologia delle HSC e all'emopoiesi.

Per la purificazione FACS delle HSC, ci aspettiamo che all'interno del midollo osseo arricchito con c-Kit, ~ 0,2% delle cellule siano la popolazione CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage- per topi C57BL / 6 giovani (8-12 settimane) (Figura 1). Tuttavia, è probabile che topi transgenici o topi di età diverse mostrino frequenze HSC diverse. Dopo 4 settimane di coltura, ci aspettiamo che la frazione CD201+CD150+c-Kit+S...

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Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Presentato qui è un protocollo per avviare, mantenere e analizzare colture di cellule staminali ematopoietiche di topo utilizzando l'espansione ex vivo a base di alcol polivinilico, nonché metodi per manipolarle geneticamente mediante trasduzione lentivirale ed elettroporazione.

Ex Vivo Espansione e manipolazione genetica di cellule staminali ematopoietiche di topo in colture a base di alcol polivinilico

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Questo protocollo consente l'espansione e la manipolazione genetica delle cellule staminali ematopoietiche funzionali del topo, consentendo una comprensione più profonda della biologia delle cellule staminali ematopoietiche e dell'emopoiesi. Il vantaggio di questa tecnica è che può supportare le cellule staminali ematopoietiche in colture ex vivo a lungo termine e consentire la manipolazione genetica per interrogare la genetica dell'emopoiesi. Questo sistema di coltura fornisce una piattaforma tecnologica per vari studi sulla biologia delle cellule staminali ematopoietiche e sull'emopoiesi, compresi studi genetici, molecolari e biochimici.Nella tabella di risoluzione dei problemi sono elencate le cause e le soluzioni per le difficoltà comuni incontrate con questa tecnica. È molto più facile ed efficace mostrare come estrarre correttamente le cellule del midollo osseo ed eseguire modifiche complete ai media piuttosto che leggerle. Per iniziare l'estrazione con cellule staminali ematopoietiche, o HSC, utilizzare salviette delicate prive di lanugine per pulire le ossa appena isolate dai topi correttamente eutanasiati.Rimuovere i muscoli e il midollo spinale dalle ossa prima di aggiungerli a un mortaio contenente circa tre millilitri di PBS. Usando un pestello, schiacciare le ossa senza macinarle per ridurre al minimo le forze di taglio. Quindi, utilizzando un ago calibro 19 collegato a una siringa da 5 millilitri, rompere i grandi frammenti di midollo osseo rilasciati nel PBS e trasferire la sospensione attraverso un filtro da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri.Una volta trasferita la sospensione, ripetere il processo con PBS fresco fino a quando le ossa sono sbiancate. Punta a un volume finale di circa 30 millilitri per topo e 50 millilitri per due topi per sbiancare le ossa fino a quando non è più visibile il midollo. Preparare l'arricchimento della colonna posizionando una colonna di filtrazione magnetica nel magnete di un separatore di colonne magnetiche con un filtro da 50 micron sulla parte superiore e un tubo conico da 15 millilitri sotto.Successivamente, dopo aver trattato le cellule con l'anticorpo anti-c-Kit alloficocianina e le microsfere magnetiche alloficocianina, eseguire tre millilitri di PBS sterile attraverso il filtro da 50 micron e la colonna di filtrazione. Una volta che il PBS è passato, passare la sospensione cellulare attraverso la colonna, seguita da tre lavaggi di tre millilitri di PBS freddo ogni volta. Dopo ogni lavaggio, attendere che la colonna smetta di gocciolare prima di aggiungere PBS per il lavaggio successivo.Quindi, rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla sopra un tubo fresco da 15 millilitri e aggiungere cinque millilitri di PBS freddo nella colonna prima di montare lo stantuffo della colonna su di esso e eluire le celle spingendo lo stantuffo. Seguire il protocollo descritto nel testo per preparare abbastanza terreno HSC per il numero desiderato di cellule o pozzetti per seminare da 0,5 a 1 milione di cellule per millilitro. Quindi ruotare verso il basso le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche arricchite con c-Kit, o HSPC, e risospendere il pellet nel mezzo HSC appena preparato alla densità cellulare desiderata.Trasferire le cellule su piastre rivestite di fibronectina o caricate superficialmente negativa, mantenendo un volume appropriato. Posizionare le cellule in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo aver rimosso delicatamente la piastra dall'incubatore di coltura tissutale senza disturbare le colture cellulari, utilizzare una pipetta o una pompa per vuoto per aspirare lentamente circa il 90-95% del mezzo dal menisco liquido di ciascun pozzetto.Evitare di prelevare il mezzo dalla base del pozzo. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo fresco preriscaldato a 37 gradi Celsius nel pozzo. Restituire la piastra all'incubatore di coltura tissutale e cambiare i terreni ogni due o tre giorni fino a quando l'esperimento non lo richiede.Dopo aver risospeso le cellule nel tampone di nucleofezione, trasferire immediatamente la sospensione cellulare nel tubo PCR contenente la ribonucleoproteina complessata e mescolare delicatamente pipettando su e giù lentamente. Ora trasferite la miscela in una cuvetta elettroporazione di volume appropriato molto lentamente, mantenendo un movimento fluido continuo per evitare di formare bolle d'aria all'interno della cuvetta. Quindi, sull'elettroporatore, selezionare la posizione dei pozzetti da elettroporare.Utilizzando il touchscreen, selezionare il tipo di cella programma come umano CD34-positivo o digitare il codice di impulso EO100, quindi premere il pulsante OK. Trasferire la cuvetta all'elettroporatore e premere il pulsante Start sul touchscreen per avviare l'elettroporazione. Immediatamente dopo l'elettroporazione, aggiungere cinque volte il volume di reazione del terreno di coltura alla cuvetta.Ora trasferisci delicatamente le cellule sulla piastra preparata e rimetti la piastra nell'incubatore di coltura tissutale. Dopo aver eseguito un cambiamento medio come dimostrato in precedenza, raccogliere 10 microlitri di cellule e contarle usando la soluzione di Turk ad una diluizione di 1: 2 con un emocitometro. Riplaccare la dose richiesta di cellule in piastre rivestite di fibronectina per la trasduzione e, separatamente, placcare le cellule di controllo negative non trasdotte.Quindi aggiungere il vettore lentivirale a ciascun pozzetto contenente cellule, mantenendo una dose di 20 unità di trasduzione per cellula per ottenere circa il 30% di efficienza di trasduzione. Tuttavia, determinare empiricamente la dose del vettore lentivirale a seconda dei requisiti sperimentali. Infine, riportare le cellule nell'incubatore di coltura tissutale per sei ore.Eseguire una modifica media come descritto in precedenza. La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza delle HSC arricchite con c-Kit ha prodotto circa lo 0,2% delle cellule CD150-positive, CD34-negative, c-Kit-positive, Sca1-positive e ligname-negative. Dopo quattro settimane di coltura HSPC, le frazioni CD201-positive, CD150-positive, c-Kit-positive, Sca1-positive e ligname-negative sono risultate essere circa il 10%Dopo la trasduzione con un vettore lentivirale che esprime GFP, le cellule GFP-positive erano circa il 30% Quando confluenti, la densità attesa delle colture era di circa 2 milioni di cellule per millilitro.Circa il 50% della morte cellulare è stata osservata entro le prime 24-48 ore prima che fosse eseguito il primo cambiamento del mezzo. Dopo una settimana, tuttavia, il numero di cellule è tornato all'80-100% del numero di cellule seminate. Cambi accurati dei supporti utilizzando supporti freschi e preriscaldati sono fondamentali per la stabilità a lungo termine di questo metodo di coltura HSC.Da quando il metodo originale è stato pubblicato nel 2019, il campo ha iniziato a usarlo in modi diversi per studiare la biologia HSC.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolamento e trapianto di cellule staminali emopoietiche (CSE)

Ricerca

Biologia

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