Name: ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00
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フローサイトメトリーへのアクセスを提供してくれたWIMMフローサイトメトリーコアと、レンチウイルスベクターの生成にWIMMウイルススクリーニングコアに感謝します。この研究は、Kay Kendall Leukaemia FundとUK Medical Research Councilによって資金提供されました。

繁殖や安楽死を含むすべての動物の手順は、制度的および国のガイドラインの範囲内で実行されなければなりません。以下に詳述する実験は、英国内務省によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器のリストについては、 材料の表 を参照してください。
1.ストックソリューションの準備
<ol><li>PVAス?...

<ol>
	<li>Laurenti, E., G&#246;ttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells:+concepts,+definitions,+and+the+new+reality.">Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality.</a> Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).</li><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo.">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).</li><li>Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+haematopoietic+stem+cell+niches.">Adult haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Granot, N., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+hematopoietic+cell+transplantation:+challenges+and+progress.">History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress.</a> Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 1-5 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+haematopoietic-stem-cell+expansion+allows+nonconditioned+transplantation.">Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation.</a> Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+polyvinyl+alcohol+for+chimeric+antigen+receptor+T-cell+expansion.">Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion.</a> Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).</li><li>Becker, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+cell+cloning+platform+for+gene+edited+functional+murine+hematopoietic+stem+cells.">A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+optimization+enables+maintenance+of+quiescent+hematopoietic+stem+cells+ex+vivo.">Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo.</a> Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).</li><li>Kobayashi, H., Takubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+method+to+maintain+quiescent+human+hematopoietic+stem+cells.">A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).</li><li>Aal Wilson, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conditioned+bone+marrow+chimeric+mouse+generation+using+culture-based+enrichment+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice.">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).</li><li>Haney, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+in+vivo+CRISPR+screens+identify+SAGA+complex+members+as+a+key+regulators+of+HSC+lineage+commitment+and+aging.">Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Che, J. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+in+vitro+expanded+hematopoietic+stem+cells.">Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells.</a> EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).</li><li>Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+potential+of+murine+hematopoietic+stem+cells:+a+rare+property+only+partially+predicted+by+phenotype.">Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+guide+RNA+design+guidelines+for+efficient+genome+editing.">CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).</li><li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments.">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+expansion+of+mouse+hematopoietic+stem+cells.">Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells.</a> Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).</li><li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+all-recombinant+protein-based+culture+system+specifically+identifies+hematopoietic+stem+cell+maintenance+factors.">An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li></ol>

このプロトコルが、HSC生物学、造血、および血液学をより一般的に調査するための有用なアプローチを提供することを願っています。FACS精製HSCs8のPVAベースの培養法の最初の開発以来、この方法は拡張されてきた。例えば、この方法は、骨髄および負の表面荷電プレート14で富化されたc−Kitで機能することが示されている。形質導入およびエレクトロポレ?...

造血系は、酸素供給から病原体との戦いまで、特殊な血液および免疫細胞タイプを通じて、哺乳類のさまざまな重要なプロセスをサポートします。造血幹および前駆細胞(HSPC)1によって維持される血液系の恒常性をサポートするためには、継続的な血液産生(造血)が必要です1。最も原始的な造血細胞は造血幹細胞(HSC)であり、これは自己複製および多系統分化のためのユニークな能力を有する2,3。これはまれな細胞集団であり、主に成体の骨髄4に見られ、約30,000細胞に1個の頻度で発生します。造血幹細胞は、生涯にわたる造血をサポートし、血液学的ストレス後の造血を再確立するのに役立つと考えられています。これらの能力はまた、HSCが照射されたレシピエントへの移植後に造血系全体を安定して再構成することを可能にする5。これは、HSCの機能的定義を表しており、さまざまな血液および免疫疾患の治癒的治療法であるHSC移植療法の科学的根拠も形成します6。これらの理由から、造血幹細胞は実験血液学の主要な焦点です。
研究の大きな焦点にもかかわらず、HSCをex vivo7で安定的に増殖させることは依然として困難でした。私たちは最近、マウス造血幹細胞8用の最初の長期生体外増殖培養システムを開発しました。このアプローチは、移植可能なHSCを4週間の培養で234〜899倍拡大することができます。他のアプローチと比較して、プロトコルの主な変更は、血清アルブミンの除去と合成ポリマーへの置き換えでした。ポリビニルアルコール(PVA)は、マウスHSC培養8に最適なポリマーとして同定され、現在では他の造血細胞タイプ9の培養にも使用されています。しかし、Soluplus(ポリビニルカプロラクタム-アセテート - ポリエチレングリコールグラフトコポリマー)と呼ばれる別のポリマーも最近同定されており、クローンHSCの膨張を改善するようです10。ポリマーを使用する前は、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン画分V、または組換え血清アルブミンの形態の血清アルブミンが使用されていましたが、これらはHSC増殖のサポートが限られており、短期間(~1週間)のex vivo培養のみをサポートしていました7。しかしながら、HSCを静止状態で保持するHSC培養プロトコルは、より長いエクスビボ培養時間をサポートできることに留意すべきである11、12。
他の培養方法と比較して、PVAベースの培養の主な利点は、生成できる細胞の数と、プロトコルを使用して幹細胞をex vivoで追跡できる時間の長さです。これは、マウスあたりの単離可能なHSCの数が少ない(数千人のみ)ことや、in vivoでHSCを経時的に追跡することの難しさなど、実験血液学の分野におけるいくつかの障壁を克服します。ただし、これらの培養物はHSC増殖を刺激しますが、in vivo HSCプールは主に定常状態で静止していることを覚えておくことが重要です13。さらに、培養物は造血幹細胞に選択的ですが、時間の経過とともに追加の細胞型が培養物とともに蓄積し、移植可能な造血幹細胞は1か月後に34細胞に約1個しか表しません。骨髄系造血前駆細胞は、これらのHSC培養において主要な夾雑細胞型であると思われる8。それにもかかわらず、これらの培養物を使用して、不均一な細胞集団からの造血幹細胞を濃縮することができます(例:c-Kit+骨髄HSPC14)。また、遺伝子操作のためのHSCの形質導入またはエレクトロポレーションもサポートしています14,15,16。不均一な培養HSPC集団からの造血幹細胞の同定を支援するために、CD201(EPCR)は最近、有用なex vivo HSCマーカー10,17,18として同定され、移植可能な造血幹細胞はCD201+CD150+c-Kit+Sca1+系統画分に限定されています。
このプロトコルでは、PVAベースのマウスHSC増殖培養を開始、維持、および評価する方法、およびエレクトロポレーションまたはレンチウイルスベクター形質導入を使用したこれらの培養内での遺伝子操作のプロトコルについて説明します。これらの手法は、様々な実験的血液学者にとって有用であることが期待されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12764416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Appleton Woods Ltd</td>
			<td>HC002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle and mortar</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Limited</td>
			<td>X18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>720-2519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>613-5394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech wipes</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>115-2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS MACS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 &#956;g</td>
			<td>IDT&#160;</td>
			<td>1081058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse stem cell factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse thrombopoietin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-315-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127&#160;APC/Cy7 (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD201&#160;APC (clone: eBio1560)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-2012-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4&#160;APC/Cy7 (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R&#160;APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8a&#160;APC/Cy7 (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C&#160;APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119&#160;APC/Cy7 (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 24-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3337</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 96-well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3330</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>F7524-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Coated plates, 96-well</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500.056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61196.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Enzo Life Sciences (UK) Ltd</td>
			<td>EXB-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T&#252;rks&#8217; solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Mettler-Toledo Ltd</td>
			<td>95015662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures

自己複製型多能性造血幹細胞(HSC)は、生涯を通じて造血をサポートし、移植後に血液系全体を再構成する能力があるため、重要な細胞型です。造血幹細胞は、さまざまな血液疾患の治癒的治療を表す幹細胞移植療法で臨床的に使用されています。造血幹細胞活性と造血を調節するメカニズムの理解と、新しいHSCベースの治療法の開発の両方に大きな関心が寄せられています。しかしながら、幹細胞幹細胞の ex vivoでの安定した培養および増殖は、取り扱い可能な ex vivo システムでこれらの幹細胞を研究する上で大きな障壁となってきた。我々は最近、移植可能なマウス造血幹細胞の長期的・大規模拡大を支援できるポリビニルアルコールベースの培養系と、それらを遺伝子編集する方法を開発しました。このプロトコルは、エレクトロポレーションおよびレンチウイルス形質導入 を介して マウスHSCを培養および遺伝子操作する方法について説明しています。このプロトコルは、HSC生物学と造血に関心のある幅広い実験血液学者に役立つことが期待されます。

造血幹細胞のFACS精製では、c-Kitが豊富な骨髄内で、細胞の~0.2%が若い(8-12週齢)C57BL/6マウスのCD150+CD34-c-Kit+Sca1+系統集団であると予想しています(図1)。ただし、トランスジェニックマウスまたは異なる年齢のマウスは、異なるHSC頻度を示す可能性があります。4週間の培養後、CD201+CD150+c-Kit+Sca1+系統<su...

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Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

ここでは、 ex vivo ポリビニルアルコールベースの増殖を使用してマウス造血幹細胞培養を開始、維持、および分析するためのプロトコルと、レンチウイルス形質導入およびエレクトロポレーションによってそれらを遺伝子操作する方法を紹介します。

エクスビボ ポリビニルアルコール培養におけるマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

このプロトコルは、機能的なマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作を可能にし、造血幹細胞の生物学と造血のより深い理解を可能にします。この技術の利点は、造血幹細胞を長期間のex vivo培養でサポートでき、造血の遺伝学を調べるための遺伝子操作を可能にすることです。この培養システムは、造血幹細胞生物学および造血に関する遺伝子研究、分子研究、生化学的研究を含むさまざまな研究のためのプラットフォーム技術を提供します。トラブルシューティングの表には、この手法で遭遇する一般的な問題の原因と解決策がリストされています。骨髄細胞について読むよりも、骨髄細胞を正しく抽出し、完全な培地変更を実行する方法を示す方がはるかに簡単で効果的です。造血幹細胞(HSC)の抽出を開始するには、糸くずの出ない繊細なタスクワイプを使用して、適切に安楽死させたマウスから新たに分離された骨をきれいにします。約3ミリリットルのPBSを含む乳鉢に追加する前に、骨から筋肉と脊髄を取り除きます。乳棒を使用して、せん断力を最小限に抑えるために骨を粉砕せずに粉砕します。次に、5ミリリットルのシリンジに取り付けられた19ゲージの針を使用して、PBSに放出された大きな骨髄片を分解し、懸濁液を70ミクロンのフィルターを通して50ミリリットルの円錐管に移します。懸濁液が移されたら、骨が漂白されるまで新鮮なPBSでこのプロセスを繰り返します。マウスあたり約30ミリリットルのエンドボリュームを目指し、2匹のマウスが骨髄が見えなくなるまで骨を漂白するために50ミリリットルを目指します。上部に50ミクロンのフィルター、下に15ミリリットルの円錐管を備えた磁気カラムセパレーターの磁石に磁気ろ過カラムを配置して、カラム濃縮の準備をします。次に、細胞をアロフィコシアニン抗c-Kit抗体およびアロフィコシアニン磁気マイクロビーズで処理した後、3ミリリットルの滅菌PBSを50ミクロンフィルターおよび濾過カラムに通す。PBSが通過したら、細胞懸濁液をカラムに通し、その後、毎回3ミリリットルの冷たいPBSを3回洗浄します。各洗浄の後、カラムの滴下が止まるのを待ってから、次の洗浄のためにPBSを追加します。次に、カラムを磁石から取り外し、新しい15ミリリットルのチューブの上に置き、5ミリリットルの冷たいPBSをカラムに追加してから、カラムプランジャーを取り付け、プランジャーを押して細胞を溶出します。本文に記載されているプロトコルに従って、ミリリットルあたり0.5〜100万個の細胞を播種するために必要な数の細胞またはウェルに十分なHSC培地を準備します。次に、c-Kitが豊富な造血幹および前駆細胞(HSPC)をスピンダウンし、ペレットを新たに調製したHSC培地に目的の細胞密度で再懸濁します。細胞をフィブロネクチンコーティングまたは負の表面帯電プレートに移し、適切な容量を維持します。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%の組織培養インキュベーターに入れます。細胞培養を乱すことなくプレートを組織培養インキュベーターから静かに取り外した後、ピペットまたは真空ポンプを使用して、各ウェルの液体メニスカスから培地の約90〜95%をゆっくりと吸引します。井戸の底から培地を引き上げることは避けてください。次に、摂氏37度に予熱した1ミリリットルの新鮮な培地をウェルに加えます。プレートを組織培養インキュベーターに戻し、実験が必要になるまで2〜3日ごとに培地を交換します。細胞をヌクレオフェクションバッファーに再懸濁した後、直ちに複合体化したリボ核タンパク質を含むPCRチューブに細胞懸濁液を移し、ゆっくりと上下にピペッティングして穏やかに混合する。次に、混合物を適切な容量のエレクトロポレーションキュベットに非常にゆっくりと移し、キュベット内に気泡が形成されないように連続的な流体運動を維持します。次に、エレクトロポレーター上で、エレクトロポレーションされるウェルの位置を選択します。タッチスクリーンを使用して、細胞タイププログラムをCD34陽性ヒトとして選択するか、パルスコードEO100を入力し、OKボタンを押します。キュベットをエレクトロポレーターに移し、タッチスクリーンのスタートボタンを押してエレクトロポレーションを開始します。エレクトロポレーションの直後に、培養液の反応量の5倍をキュベットに加える。次に、細胞を準備したプレートにそっと移し、プレートを組織培養インキュベーターに戻します。前に示したように培地交換を行った後、10マイクロリットルの細胞を収集し、血球計算盤で1:2の希釈でTurkの溶液を使用してそれらをカウントします。形質導入のためにフィブロネクチンコーティングプレートに必要な用量の細胞を再プレートし、形質導入されていないネガティブコントロール細胞を別々にプレートします。次に、レンチウイルスベクターを細胞を含む各ウェルに追加し、細胞あたり20形質導入単位の用量を維持して、約30%の形質導入効率を達成します。ただし、実験要件に応じてレンチウイルスベクターの用量を経験的に決定します。最後に、細胞を組織培養インキュベーターに6時間戻す。前述のようにメディアの変更を実行します。c-Kit富化HSCの蛍光活性化細胞ソーティングでは、CD150陽性、CD34陰性、c-Kit陽性、Sca1陽性、および系統陰性の細胞の約0.2%が得られました。HSPC培養の4週間後、CD201陽性、CD150陽性、c-Kit陽性、Sca1陽性、および系統陰性の画分は、GFP発現レンチウイルスベクターによる形質導入後、GFP陽性細胞が約30%コンフルエントになると、培養物の予想密度はミリリットルあたり約200万細胞であることが判明しました。最初の培地交換が行われる前の最初の24〜48時間以内に約50%の細胞死が観察された。しかし、1週間後、細胞数は播種された細胞数の80〜100%に戻りました。新鮮で予熱した培地を使用した正確な培地交換は、このHSC培養法の長期安定性にとって重要です。元の方法が2019年に発表されて以来、この分野ではHSC生物学を研究するためにさまざまな方法でそれを使用し始めています。

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

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In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

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Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

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Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

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の剛性を測定します<em&gt; ex vivoで</em原子間力顕微鏡を使用&gt;マウス大動脈

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Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

トランス内部細胞のキメリズム率が高いため、胚性幹細胞の大量注入

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

エクスビボ ポリビニルアルコール培養におけるマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作

エクスビボポリビニルアルコール培養におけるマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作