Name: ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures at JoVE.com

Vi takker WIMM Flow Cytometry Core for tilgang til flowcytometri, og WIMM Virus Screening Core for lentiviral vektorgenerering. Dette arbeidet ble finansiert av Kay Kendall Leukemia Fund og UK Medical Research Council.

Alle dyreprosedyrer, inkludert avl og avlivning, skal utføres innenfor institusjonelle og nasjonale retningslinjer. Eksperimentene beskrevet nedenfor ble godkjent av det britiske innenriksdepartementet. Se materialfortegnelsen for en liste over alle materialer, reagenser og utstyr som brukes i denne protokollen.
1. Utarbeide lagerløsninger
<ol><li>PVA-lagerløsning<ol><li>Ta 50 ml vann av vevskulturkvalitet i en liten glassflaske (egnet for autoklavering)....

<ol>
	<li>Laurenti, E., G&#246;ttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells:+concepts,+definitions,+and+the+new+reality.">Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality.</a> Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).</li><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo.">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).</li><li>Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+haematopoietic+stem+cell+niches.">Adult haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Granot, N., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+hematopoietic+cell+transplantation:+challenges+and+progress.">History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress.</a> Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 1-5 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+haematopoietic-stem-cell+expansion+allows+nonconditioned+transplantation.">Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation.</a> Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+polyvinyl+alcohol+for+chimeric+antigen+receptor+T-cell+expansion.">Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion.</a> Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).</li><li>Becker, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+cell+cloning+platform+for+gene+edited+functional+murine+hematopoietic+stem+cells.">A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+optimization+enables+maintenance+of+quiescent+hematopoietic+stem+cells+ex+vivo.">Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo.</a> Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).</li><li>Kobayashi, H., Takubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+method+to+maintain+quiescent+human+hematopoietic+stem+cells.">A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).</li><li>Aal Wilson, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conditioned+bone+marrow+chimeric+mouse+generation+using+culture-based+enrichment+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice.">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).</li><li>Haney, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+in+vivo+CRISPR+screens+identify+SAGA+complex+members+as+a+key+regulators+of+HSC+lineage+commitment+and+aging.">Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Che, J. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+in+vitro+expanded+hematopoietic+stem+cells.">Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells.</a> EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).</li><li>Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+potential+of+murine+hematopoietic+stem+cells:+a+rare+property+only+partially+predicted+by+phenotype.">Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+guide+RNA+design+guidelines+for+efficient+genome+editing.">CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).</li><li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments.">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+expansion+of+mouse+hematopoietic+stem+cells.">Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells.</a> Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).</li><li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+all-recombinant+protein-based+culture+system+specifically+identifies+hematopoietic+stem+cell+maintenance+factors.">An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li></ol>

Vi håper at denne protokollen gir en nyttig tilnærming til å undersøke HSC-biologi, hematopoiesis og hematologi mer generelt. Siden den første utviklingen av den PVA-baserte dyrkningsmetoden for FACS-rensede HSCs8, har metoden blitt utvidet. For eksempel har metoden vist seg å fungere med c-Kit beriket med benmarg og med negative overflateladede plater14. Dens kompatibilitet med transduksjon og elektroporering har også blitt demonstrert14,15<s...

Det hematopoietiske systemet støtter en rekke viktige prosesser hos pattedyr, fra oksygenforsyning til bekjempelse av patogener, gjennom spesialiserte blod- og immuncelletyper. Kontinuerlig blodproduksjon (hematopoiesis) er nødvendig for å støtte blodsystemets homeostase, som opprettholdes av hematopoietiske stam- og stamceller (HSPCs)1. Den mest primitive hematopoietiske cellen er den hematopoietiske stamcellen (HSC), som har unike kapasiteter for selvfornyelse og multilineær differensiering 2,3. Dette er en sjelden cellepopulasjon, hovedsakelig funnet i den voksne benmarg4, hvor de forekommer med en frekvens på bare omtrent en hver 30.000 celler. HSCs antas å støtte livslang hematopoiesis og bidra til å gjenopprette hematopoiesis etter hematologisk stress. Disse kapasitetene gjør det også mulig for HSC å stabilt rekonstituere hele det hematopoietiske systemet etter transplantasjon til en bestrålt mottaker5. Dette representerer den funksjonelle definisjonen av en HSC og danner også det vitenskapelige grunnlaget for HSC-transplantasjonsterapi, en kurativ behandling for en rekke blod- og immunsykdommer6. Av disse grunner er HSC et hovedfokus for eksperimentell hematologi.
Til tross for et stort fokus på forskning, har det vært utfordrende å stabilt utvide HSCs ex vivo7. Vi har nylig utviklet det første langsiktige ex vivo ekspansjonskultursystemet for mus HSCs8. Tilnærmingen kan utvide transplanterbare HSCs med 234-899 ganger over en 4 ukers kultur. Sammenlignet med alternative tilnærminger var den store endringen i protokollen fjerning av serumalbumin og erstatning med en syntetisk polymer. Polyvinylalkohol (PVA) ble identifisert som en optimal polymer for musens HSC-kulturer8, som nå også har blitt brukt til å dyrke andre hematopoietiske celletyper9. Imidlertid har en annen polymer kalt Soluplus (en polyvinyl kaprolaktam-acetat-polyetylenglykolgraft-kopolymer) også nylig blitt identifisert, noe som ser ut til å forbedre klonal HSC-ekspansjon10. Før bruk av polymerer ble serumalbumin i form av føtalt bovint serum, bovint serumalbumin fraksjon V eller rekombinant serumalbumin brukt, men disse hadde begrenset støtte for HSC-ekspansjon og støttet kun kortvarig (~1 uke) ex vivo dyrkning7. Det skal imidlertid bemerkes at HSC-kulturprotokoller som beholder HSC-er i hviletilstand, kan støtte en lengre ex vivo-kulturtid 11,12.
Sammenlignet med andre dyrkningsmetoder er en stor fordel med PVA-baserte kulturer antall celler som kan genereres og hvor lang tid protokollen kan brukes til å spore HSCs ex vivo. Dette overvinner flere barrierer innen eksperimentell hematologi, for eksempel det lave antallet HSC-er som kan isoleres per mus (bare noen få tusen) og vanskeligheten med å spore HSC-er over tid in vivo. Det er imidlertid viktig å huske at disse kulturene stimulerer HSC-spredning, mens in vivo HSC-bassenget hovedsakelig hviler ved en jevn tilstand13. I tillegg, selv om kulturene er selektive for HSC, akkumuleres ytterligere celletyper med kulturene over tid, og transplanterbare HSCer representerer bare omtrent en av 34 celler etter 1 måned. Myeloid hematopoietiske stamceller ser ut til å være den viktigste forurensende celletypen i disse HSC-kulturene8. Likevel kan vi bruke disse kulturene til å berike HSCs fra heterogene cellepopulasjoner (f.eks. c-Kit + benmarg HSPCs14). Den støtter også transduksjon eller elektroporering av HSC for genetisk manipulering14,15,16. For å bidra til å identifisere HSC fra den heterogene dyrkede HSPC-populasjonen, har CD201 (EPCR) nylig blitt identifisert som en nyttig ex vivo HSC-markør 10,17,18, med transplanterbare HSCer begrenset til CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage-fraksjonen.
Denne protokollen beskriver metoder for å initiere, vedlikeholde og vurdere PVA-baserte HSC-ekspansjonskulturer for mus, samt protokoller for genetisk manipulering innenfor disse kulturene ved bruk av elektroporering eller lentiviral vektortransduksjon. Disse metodene forventes å være nyttige for en rekke eksperimentelle hematologer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12764416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Appleton Woods Ltd</td>
			<td>HC002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle and mortar</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Limited</td>
			<td>X18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>720-2519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>613-5394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech wipes</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>115-2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS MACS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 &#956;g</td>
			<td>IDT&#160;</td>
			<td>1081058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse stem cell factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse thrombopoietin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-315-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127&#160;APC/Cy7 (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD201&#160;APC (clone: eBio1560)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-2012-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4&#160;APC/Cy7 (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R&#160;APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8a&#160;APC/Cy7 (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C&#160;APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119&#160;APC/Cy7 (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 24-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3337</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 96-well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3330</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>F7524-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Coated plates, 96-well</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500.056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61196.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Enzo Life Sciences (UK) Ltd</td>
			<td>EXB-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T&#252;rks&#8217; solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Mettler-Toledo Ltd</td>
			<td>95015662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures

Selvfornyende multipotente hematopoietiske stamceller (HSC) er en viktig celletype på grunn av deres evne til å støtte hematopoiesis gjennom livet og rekonstituere hele blodsystemet etter transplantasjon. HSC brukes klinisk i stamcelletransplantasjonsterapier, som representerer kurativ behandling for en rekke blodsykdommer. Det er stor interesse for både å forstå mekanismene som regulerer HSC-aktivitet og hematopoiesis, og å utvikle nye HSC-baserte terapier. Imidlertid har den stabile kulturen og utvidelsen av HSCs ex vivo vært en stor barriere for å studere disse stamcellene i et håndterbart ex vivo-system. Vi har nylig utviklet et polyvinylalkoholbasert kultursystem som kan støtte langsiktig og storskala utvidelse av transplanterbare muse-HSC-er og metoder for å genetisk redigere dem. Denne protokollen beskriver metoder for å dyrke og genetisk manipulere muse-HSC via elektroporering og lentiviral transduksjon. Denne protokollen forventes å være nyttig for et bredt spekter av eksperimentelle hematologer som er interessert i HSC-biologi og hematopoiesis.

For FACS-rensing av HSC-er forventer vi at i den c-Kit-berikede benmargen er ~0,2% av cellene CD150+CD34-c-Kit + Sca1+Lineage- populasjonen for unge (8-12 uker gamle) C57BL/6-mus (figur 1). Imidlertid er det sannsynlig at transgene mus eller mus i forskjellige aldre viser forskjellige HSC-frekvenser. Etter 4 ukers kultur forventer vi at CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-fraksjonen vil v...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures at JoVE.com

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Presentert her er en protokoll for å initiere, vedlikeholde og analysere mushematopoietiske stamcellekulturer ved hjelp av ex vivo polyvinylalkoholbasert ekspansjon, samt metoder for å genetisk manipulere dem ved lentiviral transduksjon og elektroporering.

Eks Vivo Ekspansjon og genetisk manipulering av hematopoietiske stamceller fra mus i polyvinylalkoholbaserte kulturer

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Denne protokollen tillater utvidelse og genetisk manipulering av funksjonelle mushematopoietiske stamceller, noe som gir en dypere forståelse av hematopoietisk stamcellebiologi og hematopoiesis. Fordelen med denne teknikken er at den kan støtte hematopoietiske stamceller i langsiktig ex vivo-kultur og tillate genetisk manipulasjon for å forhøre genetikken til hematopoiesis. Dette kultursystemet gir en plattformteknologi for ulike studier i hematopoietisk stamcellebiologi og hematopoiesis, inkludert genetiske, molekylære og biokjemiske studier.Feilsøkingstabellen viser årsakene og løsningene for de vanlige kampene som oppstår med denne teknikken. Det er mye enklere og mer effektivt å vise hvordan du korrekt trekker ut benmargceller og utfører komplette medieendringer i stedet for å lese om det. For å starte hematopoietisk stamcelle, eller HSC, ekstraksjon, bruk lofrie delikate oppgaveservietter for å rense beinene som er nylig isolert fra riktig avlivet mus.Fjern muskler og ryggmargen fra beinene før du legger dem til en mørtel som inneholder omtrent tre milliliter PBS. Bruk en pestle, knus beinene uten å slipe dem for å minimere skjærkrefter. Deretter, ved hjelp av en 19-gauge nål festet til en 5-milliliter sprøyte, bryte opp de store benmargsfragmentene som slippes ut i PBS og overføre suspensjonen gjennom et 70-mikron filter til et 50 milliliter konisk rør.Når suspensjonen er overført, gjenta prosessen med fersk PBS til beinene er bleket. Sikt etter et sluttvolum på omtrent 30 milliliter per mus og 50 milliliter for to mus å bleke beinene til ikke mer marg er synlig. Forbered deg på kolonneberikelse ved å plassere en magnetisk filtreringskolonne i magneten til en magnetisk kolonneseparator med et 50-mikronfilter på toppen og et 15 milliliter konisk rør under.Deretter, etter å ha behandlet cellene med allophycocyanin anti-c-Kit antistoff og allophycocyanin magnetiske mikroperler, kjør tre milliliter steril PBS gjennom 50-mikron filter og filtreringskolonnen. Når PBS har løpt gjennom, pass cellesuspensjonen gjennom kolonnen, etterfulgt av tre vasker på tre milliliter kald PBS hver gang. Etter hver vask, vent til kolonnen slutter å dryppe før du tilsetter PBS for neste vask.Fjern deretter kolonnen fra magneten og legg den på toppen av et nytt 15 milliliter rør og tilsett fem milliliter kald PBS i kolonnen før du monterer kolonnestempelet på det og eluerer cellene ved å skyve stempelet. Følg protokollen beskrevet i teksten for å forberede nok HSC-medium for ønsket antall celler eller brønner til frø 0,5 til 1 million celler per milliliter. Deretter spinner du ned den c-Kit-berikede hematopoietiske stammen og stamcellene, eller HSPCs, og resuspenderer pelleten i det tilberedte HSC-mediet ved ønsket celletetthet.Overfør cellene til fibronektinbelagte eller negative overflateladede plater, og oppretthold passende volum. Plasser cellene i en vevskulturinkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Etter forsiktig å ha fjernet platen fra vevskulturinkubatoren uten å forstyrre cellekulturene, bruk en pipette eller vakuumpumpe for sakte å aspirere ca. 90 til 95% av mediet fra den flytende menisken i hver brønn.Unngå å trekke opp medium fra bunnen av brønnen. Deretter tilsettes en milliliter friskt medium forvarmet til 37 grader Celsius i brønnen. Sett platen tilbake til vevskulturinkubatoren, og bytt media hver to til tre dager til forsøket krever.Etter resuspendering av cellene i nukleofeksjonsbuffer, overfør umiddelbart cellesuspensjonen til PCR-røret som inneholder det komplekse ribonukleoproteinet, og bland forsiktig ved å pipettere sakte opp og ned. Overfør nå blandingen til en elektroporeringskuvette med passende volum veldig sakte, og oppretthold en kontinuerlig væskebevegelse for å unngå å danne luftbobler inne i kyvetten. Deretter, på elektroporatoren, velg posisjonen til brønnene som blir elektroporert.Bruk berøringsskjermen til å velge celletypeprogrammet som CD34-positivt menneske eller skriv inn pulskoden EO100, og trykk deretter på OK-knappen. Overfør kyvetten til elektroporatoren og trykk på Start-knappen på berøringsskjermen for å starte elektroporering. Umiddelbart etter elektroporering, tilsett fem ganger reaksjonsvolumet til kulturmediet til kyvetten.Overfør forsiktig cellene til den forberedte platen, og legg platen tilbake i vevskulturinkubatoren. Etter å ha utført en middels endring som vist tidligere, samle 10 mikroliter av cellene og telle dem ved hjelp av Turks løsning ved en fortynning på 1: 2 med et hemocytometer. Replate den nødvendige dosen av celler i fibronektinbelagte plater for transduksjon, og separat, plate de ikke-transducerte negative kontrollcellene.Deretter tilsettes den lentivirale vektoren til hver brønninneholdende celle, og opprettholder en dose på 20 transduksjonsenheter per celle for å oppnå rundt 30% transduksjonseffektivitet. Bestem imidlertid den lentivirale vektordosen empirisk avhengig av eksperimentelle krav. Til slutt, returner cellene til vevskulturinkubatoren i seks timer.Utfør en middels endring som beskrevet tidligere. Den fluorescensaktiverte cellesorteringen av de c-Kit-berikede HSCene ga omtrent 0.2% av cellene som var CD150-positive, CD34-negative, c-Kit-positive, Sca1-positive og avstamningsnegative. Etter fire uker med HSPC-kultur ble CD201-positive, CD150-positive, c-Kit-positive, Sca1-positive og avstamningsnegative fraksjoner funnet å være ca. 10%Etter transduksjon med en GFP-uttrykkende lentiviralvektor var de GFP-positive cellene ca. 30%Når de var konfluente, var den forventede tettheten av kulturene rundt 2 millioner celler per milliliter.Omtrent 50 % celledød ble observert i løpet av de første 24 til 48 timene før den første middelendringen ble utført. Etter en uke returnerte imidlertid celletallene til 80 til 100% av det sådde cellenummeret. Nøyaktige medieendringer ved hjelp av ferske og forvarmede medier er avgjørende for den langsiktige stabiliteten til denne HSC-kulturmetoden.Siden den opprinnelige metoden ble publisert i 2019, har feltet begynt å bruke den på forskjellige måter for å studere HSC-biologi.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypeanalyser og Isolering av murine hematopoetiske stamceller og Lineage-engasjerte stamfedre

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternative Kulturer til human pluripotent Stem Cell produksjon, vedlikehold, og Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analyse av metabolsk profil i<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Tarm Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Måle Stivhet<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mus Aorta Bruke Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-indre cellen masse injeksjon av embryonale stamceller fører til høyere Chimerism priser

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...