Name: ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00
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Agradecemos ao WIMM Flow Cytometry Core pelo acesso à citometria de fluxo e ao WIMM Virus Screening Core pela geração do vetor lentiviral. Este trabalho foi financiado pelo Kay Kendall Leukaemia Fund e pelo UK Medical Research Council.

Todos os procedimentos com animais, incluindo a criação e a eutanásia, devem ser realizados dentro das diretrizes institucionais e nacionais. Os experimentos detalhados abaixo foram aprovados pelo Ministério do Interior do Reino Unido. Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista de todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo.
1. Preparação de soluções de estoque
<ol><li>Solução de estoque PVA<ol><li>Tomar 50 mL de á...

<ol>
	<li>Laurenti, E., G&#246;ttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells:+concepts,+definitions,+and+the+new+reality.">Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality.</a> Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).</li><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo.">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).</li><li>Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+haematopoietic+stem+cell+niches.">Adult haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Granot, N., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+hematopoietic+cell+transplantation:+challenges+and+progress.">History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress.</a> Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 1-5 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+haematopoietic-stem-cell+expansion+allows+nonconditioned+transplantation.">Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation.</a> Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+polyvinyl+alcohol+for+chimeric+antigen+receptor+T-cell+expansion.">Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion.</a> Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).</li><li>Becker, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+cell+cloning+platform+for+gene+edited+functional+murine+hematopoietic+stem+cells.">A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+optimization+enables+maintenance+of+quiescent+hematopoietic+stem+cells+ex+vivo.">Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo.</a> Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).</li><li>Kobayashi, H., Takubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+method+to+maintain+quiescent+human+hematopoietic+stem+cells.">A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).</li><li>Aal Wilson, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conditioned+bone+marrow+chimeric+mouse+generation+using+culture-based+enrichment+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice.">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).</li><li>Haney, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+in+vivo+CRISPR+screens+identify+SAGA+complex+members+as+a+key+regulators+of+HSC+lineage+commitment+and+aging.">Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Che, J. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+in+vitro+expanded+hematopoietic+stem+cells.">Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells.</a> EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).</li><li>Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+potential+of+murine+hematopoietic+stem+cells:+a+rare+property+only+partially+predicted+by+phenotype.">Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+guide+RNA+design+guidelines+for+efficient+genome+editing.">CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).</li><li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments.">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+expansion+of+mouse+hematopoietic+stem+cells.">Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells.</a> Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).</li><li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+all-recombinant+protein-based+culture+system+specifically+identifies+hematopoietic+stem+cell+maintenance+factors.">An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li></ol>

Esperamos que este protocolo forneça uma abordagem útil para investigar a biologia da THS, hematopoese e hematologia de forma mais geral. Desde o desenvolvimento inicial do método de cultura à base de PVA para HSCs purificadas porFACS8, o método tem sido ampliado. Por exemplo, foi demonstrado que o método funciona com c-Kit enriquecido com medula óssea e com placas carregadas superficialmentenegativas14. Sua compatibilidade com transdução e eletroporação também ...

O sistema hematopoiético suporta uma série de processos essenciais em mamíferos, desde o fornecimento de oxigênio até o combate a patógenos, passando por tipos especializados de células sanguíneas e imunológicas. A produção contínua de sangue (hematopoiese) é necessária para dar suporte à homeostase do sistema sanguíneo, que é sustentada por células-tronco hematopoéticas e células progenitoras (HSPCs)1. A célula hematopoética mais primitiva é a célula-tronco hematopoética (CTH), que possui capacidades únicas de auto-renovação e diferenciação de multilinhagens2,3. Esta é uma população celular rara, encontrada principalmente na medula óssea adulta4, onde ocorrem com uma frequência de apenas aproximadamente uma a cada 30.000 células. Acredita-se que as CTHs apoiem a hematopoiese ao longo da vida e ajudem a restabelecer a hematopoiese após o estresse hematológico. Essas capacidades também permitem que as HSCs reconstituam de forma estável todo o sistema hematopoiético após o transplante em um receptor irradiado5. Isso representa a definição funcional de uma CAR e também forma a base científica para a terapia de transplante de THC, um tratamento curativo para uma série de doenças hematológicas e imunológicas6. Por essas razões, as HSCs são um dos principais focos da hematologia experimental.
Apesar de um grande foco de pesquisa, tem permanecido desafiador expandir de forma estável HSCs ex vivo7. Recentemente, desenvolvemos o primeiro sistema de cultura de expansão ex vivo de longo prazo para HSCs de camundongos8. A abordagem pode expandir HSCs transplantáveis em 234-899 vezes ao longo de uma cultura de 4 semanas. Em comparação com abordagens alternativas, a principal mudança no protocolo foi a remoção da albumina sérica e sua substituição por um polímero sintético. O álcool polivinílico (PVA) foi identificado como um polímero ótimo para culturas de HSC em camundongos8, que agora também tem sido usado para culturas de outros tipos de células hematopoéticas9. No entanto, outro polímero chamado Soluplus (um copolímero de enxerto de polivinil caprolactama-acetato-polietilenoglicol) também foi identificado recentemente, o que parece melhorar a expansão clonal de CTE10. Antes do uso de polímeros, albumina sérica na forma de soro fetal bovino, albumina sérica V de soro bovino ou albumina sérica recombinante eram usadas, mas estas tinham suporte limitado para expansão de CTE e suportavam apenas cultura ex vivo de curto prazo (~1 semana)7. No entanto, deve-se ressaltar que protocolos de cultura de CAR que retêm as HSC em estado quiescente podem suportar um tempo de cultura ex vivo maior11,12.
Em comparação com outros métodos de cultura, uma grande vantagem das culturas baseadas em PVA é o número de células que podem ser geradas e o tempo que o protocolo pode ser usado para rastrear HSCs ex vivo. Isso supera várias barreiras no campo da hematologia experimental, como o baixo número de HSCs isoláveis por camundongo (apenas alguns milhares) e a dificuldade de rastrear HSCs ao longo do tempo in vivo. No entanto, é importante lembrar que essas culturas estimulam a proliferação de HSC, enquanto o pool de HSC in vivo é predominantemente quiescente em estado estacionário13. Além disso, embora as culturas sejam seletivas para CTHs, tipos celulares adicionais se acumulam com as culturas ao longo do tempo, e as CTHs transplantáveis representam apenas aproximadamente uma em cada 34 células após 1 mês. As células progenitoras hematopoéticas mieloides parecem ser o principal tipo celular contaminante nessas culturas deCTH8. No entanto, podemos usar essas culturas para enriquecer para HSCs de populações celulares heterogêneas (por exemplo, c-Kit+ HSPCs de medula óssea14). Também suporta a transdução ou eletroporação de CTHs para manipulação genética14,15,16. Para ajudar a identificar HSCs da população heterogênea de HSPC cultivadas, CD201 (EPCR) foi recentemente identificado como um marcador útil ex vivo de HSC10,17,18, com HSCs transplantáveis restritas à fração CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-.
Este protocolo descreve métodos para iniciar, manter e avaliar culturas de expansão de HSC de camundongos baseadas em PVA, bem como protocolos para manipulação genética dentro dessas culturas usando eletroporação ou transdução de vetor lentiviral. Espera-se que esses métodos sejam úteis para uma variedade de hematologistas experimentais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12764416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Appleton Woods Ltd</td>
			<td>HC002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle and mortar</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Limited</td>
			<td>X18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>720-2519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>613-5394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech wipes</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>115-2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS MACS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 &#956;g</td>
			<td>IDT&#160;</td>
			<td>1081058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse stem cell factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse thrombopoietin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-315-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127&#160;APC/Cy7 (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD201&#160;APC (clone: eBio1560)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-2012-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4&#160;APC/Cy7 (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R&#160;APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8a&#160;APC/Cy7 (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C&#160;APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119&#160;APC/Cy7 (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 24-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3337</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 96-well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3330</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>F7524-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Coated plates, 96-well</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500.056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61196.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Enzo Life Sciences (UK) Ltd</td>
			<td>EXB-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T&#252;rks&#8217; solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Mettler-Toledo Ltd</td>
			<td>95015662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures

As células-tronco hematopoéticas (CTHs) multipotentes auto-renovadoras são um tipo celular importante devido à sua capacidade de suportar a hematopoiese ao longo da vida e reconstituir todo o sistema sanguíneo após o transplante. As CTHs são usadas clinicamente em terapias de transplante de células-tronco, que representam tratamento curativo para uma série de doenças do sangue. Há um interesse substancial tanto na compreensão dos mecanismos que regulam a atividade da TH e da hematopoiese, quanto no desenvolvimento de novas terapias baseadas em HSC. No entanto, o cultivo estável e a expansão de CTHs ex vivo têm sido uma grande barreira no estudo dessas células-tronco em um sistema ex vivo tratável. Recentemente, desenvolvemos um sistema de cultura à base de álcool polivinílico que pode apoiar a expansão a longo prazo e em larga escala de HSCs transplantáveis de camundongos e métodos para editá-los geneticamente. Este protocolo descreve métodos para cultura e manipulação genética de HSCs de camundongos via eletroporação e transdução lentiviral. Espera-se que este protocolo seja útil para uma ampla gama de hematologistas experimentais interessados em biologia da CAR e hematopoese.

Para a purificação FACS de HSCs, esperamos que, dentro da medula óssea enriquecida com c-Kit, ~0,2% das células sejam a população CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- para camundongos jovens (8-12 semanas de idade) C57BL/6 (Figura 1). No entanto, é provável que camundongos transgênicos ou de diferentes idades apresentem diferentes frequências de HSC. Após 4 semanas de cultura, esperamos que a fração CD201+CD150+</s...

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Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Apresentamos aqui um protocolo para iniciar, manter e analisar culturas de células-tronco hematopoéticas de camundongos usando expansão ex vivo à base de álcool polivinílico, bem como métodos para manipulá-las geneticamente por transdução lentiviral e eletroporação.

Ex Vivo Expansão e Manipulação Genética de Células-Tronco Hematopoéticas de Camundongos em Culturas à Base de Álcool Polivinílico

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Este protocolo permite a expansão e manipulação genética de células-tronco hematopoéticas funcionais de camundongos, permitindo um entendimento mais aprofundado da biologia das células-tronco hematopoéticas e da hematopoese. A vantagem desta técnica é que ela pode apoiar células-tronco hematopoéticas em cultura ex vivo de longo prazo e permitir a manipulação genética para interrogar a genética da hematopoiese. Este sistema de cultura fornece uma tecnologia de plataforma para vários estudos em biologia de células-tronco hematopoéticas e hematopoiese, incluindo estudos genéticos, moleculares e bioquímicos.A tabela de solução de problemas lista as causas e soluções para as dificuldades comuns encontradas com essa técnica. É muito mais fácil e eficaz mostrar como extrair corretamente as células da medula óssea e realizar mudanças completas na mídia em vez de ler sobre isso. Para iniciar a extração de células-tronco hematopoéticas, ou HSC, use lenços de tarefa delicados sem fiapos para limpar os ossos recém-isolados de camundongos devidamente eutanasiados.Remova os músculos e a medula espinhal dos ossos antes de adicioná-los a uma argamassa contendo aproximadamente três mililitros de PBS. Usando um pilão, esmague os ossos sem triturá-los para minimizar as forças de cisalhamento. Em seguida, usando uma agulha de calibre 19 acoplada a uma seringa de 5 mililitros, quebre os grandes fragmentos de medula óssea liberados no PBS e transfira a suspensão através de um filtro de 70 mícrons para um tubo cônico de 50 mililitros.Uma vez transferida a suspensão, repita o processo com PBS fresco até que os ossos estejam clareados. Procure um volume final de aproximadamente 30 mililitros por camundongo e 50 mililitros para dois camundongos para branquear os ossos até que nenhuma medula seja mais visível. Prepare-se para o enriquecimento da coluna colocando uma coluna de filtração magnética no ímã de um separador de coluna magnética com um filtro de 50 mícrons na parte superior e um tubo cônico de 15 mililitros abaixo.Em seguida, depois de tratar as células com o anticorpo anti-c-Kit aloficocianina e microesferas magnéticas de aloficocianina, passe três mililitros de PBS estéril através do filtro de 50 mícrons e da coluna de filtração. Uma vez que o PBS tenha passado, passe a suspensão da célula através da coluna, seguido por três lavagens de três mililitros de PBS frio de cada vez. Após cada lavagem, espere que a coluna pare de pingar antes de adicionar PBS para a próxima lavagem.Em seguida, remova a coluna do ímã e coloque-a em cima de um tubo fresco de 15 mililitros e adicione cinco mililitros de PBS frio na coluna antes de encaixar o êmbolo da coluna nela e eluir as células empurrando o êmbolo. Siga o protocolo descrito no texto para preparar meio HSC suficiente para o número desejado de células ou poços para semear de 0,5 a 1 milhão de células por mililitro. Em seguida, gire as células-tronco hematopoéticas e progenitoras enriquecidas com c-Kit, ou HSPCs, e ressuspenda o pellet no meio HSC recém-preparado na densidade celular desejada.Transferir as células para placas revestidas com fibronectina ou com carga superficial negativa, mantendo o volume adequado. Coloque as células em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Depois de remover suavemente a placa da incubadora de cultura de tecidos sem perturbar as culturas celulares, use uma pipeta ou bomba de vácuo para aspirar lentamente cerca de 90 a 95% do meio do menisco líquido de cada poço.Evite tirar o meio da base do poço. Em seguida, adicione um mililitro de meio fresco pré-aquecido a 37 graus Celsius no poço. Retorne a placa à incubadora de cultura de tecidos e troque o meio a cada dois ou três dias até que o experimento necessite.Depois de ressuspender as células em tampão de nucleofeção, transfira imediatamente a suspensão celular para o tubo de PCR contendo a ribonucleoproteína complexada e misture suavemente pipetando para cima e para baixo lentamente. Agora transfira a mistura para uma cubeta de eletroporação de volume adequado muito lentamente, mantendo um movimento contínuo de fluido para evitar a formação de bolhas de ar dentro da cubeta. Em seguida, no eletroporador, selecione a posição dos poços que estão sendo eletroporados.Usando a tela sensível ao toque, selecione o programa de tipo de célula como CD34-positivo humano ou digite o código de pulso EO100 e, em seguida, pressione o botão OK. Transfira a cubeta para o eletroporator e pressione o botão Iniciar na tela sensível ao toque para iniciar a eletroporação. Imediatamente após a eletroporação, adicionar cinco vezes o volume de reação do meio de cultura à cubeta.Agora, transfira suavemente as células para a placa preparada e coloque a placa de volta na incubadora de cultura de tecidos. Depois de realizar uma troca de meio como demonstrado anteriormente, coletar 10 microlitros das células e contá-las usando solução de Turk em uma diluição de 1:2 com um hemocitômetro. Replaquear a dose necessária de células em placas revestidas com fibronectina para transdução e, separadamente, plaquear as células de controle negativo não transduzidas.Em seguida, adicione o vetor lentiviral a cada poço contendo células, mantendo uma dose de 20 unidades de transdução por célula para atingir cerca de 30% de eficiência de transdução. No entanto, determinar a dose do vetor lentiviral empiricamente dependendo das exigências experimentais. Finalmente, retornar as células à incubadora de cultura de tecidos por seis horas.Execute uma alteração de meio conforme descrito anteriormente. A classificação celular ativada por fluorescência das HSCs enriquecidas com c-Kit produziu aproximadamente 0,2% das células CD150-positivas, CD34-negativas, c-Kit-positivas, Sca1-positivas e linhagens-negativas. Após quatro semanas de cultura de HSPC, as frações CD201-positivas, CD150-positivas, c-Kit-positivas, Sca1-positivas e linhagens-negativas foram encontradas para ser cerca de 10% Após a transdução com um vetor lentiviral que expressa GFP, as células positivas para GFP foram aproximadamente 30%Quando confluentes, a densidade esperada das culturas era de cerca de 2 milhões de células por mililitro.Aproximadamente 50% de morte celular foi observada nas primeiras 24 a 48 horas antes da primeira troca de meio. Após uma semana, no entanto, o número de células retornou a 80 a 100% do número de células semeadas. Mudanças precisas de mídia usando meios frescos e pré-aquecidos são críticas para a estabilidade a longo prazo deste método de cultura HSC.Desde que o método original foi publicado em 2019, a área começou a usá-lo de diferentes maneiras para estudar a biologia do HSC.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolamento e Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (HSCs)

Biologia

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Culturas alternativas para produção, manutenção e análise genética de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Tempo real Análise do Perfil metabólico em<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas mouse Intestinal Crypt organóide

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-interno pilha injeção maciça de células-tronco embrionárias leva a taxas mais elevadas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...