Name: ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures at JoVE.com

Мы благодарим Центр проточной цитометрии WIMM за доступ к проточной цитометрии и Центр скрининга вирусов WIMM за генерацию лентивирусного вектора. Эта работа финансировалась Фондом лейкемии Кей Кендалл и Советом по медицинским исследованиям Великобритании.

Все процедуры на животных, включая разведение и эвтаназию, должны выполняться в соответствии с институциональными и национальными рекомендациями. Эксперименты, подробно описанные ниже, были одобрены Министерством внутренних дел Великобритании. Список всех материалов, реагентов и об?...

<ol>
	<li>Laurenti, E., G&#246;ttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells:+concepts,+definitions,+and+the+new+reality.">Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality.</a> Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).</li><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo.">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).</li><li>Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+haematopoietic+stem+cell+niches.">Adult haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Granot, N., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+hematopoietic+cell+transplantation:+challenges+and+progress.">History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress.</a> Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 1-5 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+haematopoietic-stem-cell+expansion+allows+nonconditioned+transplantation.">Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation.</a> Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+polyvinyl+alcohol+for+chimeric+antigen+receptor+T-cell+expansion.">Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion.</a> Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).</li><li>Becker, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+cell+cloning+platform+for+gene+edited+functional+murine+hematopoietic+stem+cells.">A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+optimization+enables+maintenance+of+quiescent+hematopoietic+stem+cells+ex+vivo.">Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo.</a> Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).</li><li>Kobayashi, H., Takubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+method+to+maintain+quiescent+human+hematopoietic+stem+cells.">A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).</li><li>Aal Wilson, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conditioned+bone+marrow+chimeric+mouse+generation+using+culture-based+enrichment+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice.">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).</li><li>Haney, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+in+vivo+CRISPR+screens+identify+SAGA+complex+members+as+a+key+regulators+of+HSC+lineage+commitment+and+aging.">Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Che, J. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+in+vitro+expanded+hematopoietic+stem+cells.">Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells.</a> EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).</li><li>Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+potential+of+murine+hematopoietic+stem+cells:+a+rare+property+only+partially+predicted+by+phenotype.">Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+guide+RNA+design+guidelines+for+efficient+genome+editing.">CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).</li><li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments.">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+expansion+of+mouse+hematopoietic+stem+cells.">Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells.</a> Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).</li><li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+all-recombinant+protein-based+culture+system+specifically+identifies+hematopoietic+stem+cell+maintenance+factors.">An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li></ol>

Мы надеемся, что этот протокол обеспечит полезный подход к изучению биологии ГСК, кроветворения и гематологии в целом. С момента первоначальной разработки метода культивирования на основе ПВА для FACS-очищенных ГСК8 этот метод был расширен. Например, было показано, что метод ...

Кроветворная система поддерживает ряд важных процессов у млекопитающих, от снабжения кислородом до борьбы с патогенами, с помощью специализированных типов клеток крови и иммунных клеток. Непрерывная выработка крови (кроветворение) необходима для поддержания гомеостаза системы крови, который поддерживается гемопоэтическими стволовыми клетками и клетками-предшественниками (HSPC)1. Самой примитивной кроветворной клеткой является гемопоэтическая стволовая клетка (ГСК), обладающая уникальными способностями к самообновлению и многолинейной дифференцировке 2,3. Это редкая клеточная популяция, в основном обнаруженная во взрослом костном мозге4, где они встречаются с частотой примерно одна на каждые 30 000 клеток. Считается, что ГСК поддерживают кроветворение на протяжении всей жизни и помогают восстановить кроветворение после гематологического стресса. Эти возможности также позволяют ГСК стабильно восстанавливать всю кроветворную систему после трансплантации облученному реципиенту5. Это представляет собой функциональное определение ГСК, а также формирует научную основу для трансплантационной терапии ГСК, лечебного лечения ряда заболеваний крови и иммунитета6. По этим причинам ГСК являются основным направлением экспериментальной гематологии.
Несмотря на большое внимание к исследованиям, по-прежнему сложно стабильно расширять HSC ex vivo7. Недавно мы разработали первую долгосрочную систему культивирования ex vivo для мышей HSC8. Этот подход может расширить трансплантируемые ГСК в 234-899 раз за 4-недельную культуру. По сравнению с альтернативными подходами, основным изменением в протоколе стало удаление сывороточного альбумина и замена его синтетическим полимером. Поливиниловый спирт (ПВС) был идентифицирован как оптимальный полимер для культурГСК мышей 8, который в настоящее время также используется для культивирования других типов гемопоэтических клеток9. Однако недавно был идентифицирован другой полимер под названием Soluplus (сополимер трансплантата поливинилкапролактамацетата и полиэтиленгликоля), который, по-видимому, улучшает клональное расширениеГСК 10. До использования полимеров использовали сывороточный альбумин в форме эмбриональной бычьей сыворотки, бычьего сывороточного альбумина фракции V или рекомбинантного сывороточного альбумина, но они имели ограниченную поддержку экспансии ГСК и поддерживали только краткосрочную (~ 1 неделю) культуру ex vivo 7. Однако следует отметить, что протоколы культивирования ГСК, которые сохраняют ГСК в состоянии покоя, могут поддерживать более длительное время культивирования ex vivo 11,12.
По сравнению с другими методами культивирования, основным преимуществом культур на основе ПВА является количество клеток, которые могут быть сгенерированы, и продолжительность времени, в течение которого протокол может использоваться для отслеживания ГСК ex vivo. Это преодолевает несколько барьеров в области экспериментальной гематологии, таких как низкое количество ГСК, выделяемых на мышь (всего несколько тысяч), и сложность отслеживания ГСК с течением времени in vivo. Однако важно помнить, что эти культуры стимулируют пролиферацию ГСК, в то время как пул ГСК in vivo преимущественно находится в состоянии покоя в устойчивом состоянии13. Кроме того, хотя культуры являются селективными в отношении ГСК, дополнительные типы клеток накапливаются вместе с культурами с течением времени, и трансплантируемые ГСК представляют собой примерно одну из 34 клеток через 1 месяц. Миелоидные гемопоэтические клетки-предшественники, по-видимому, являются основным контаминирующим типом клеток в этих культурах ГСК8. Тем не менее, мы можем использовать эти культуры для обогащения ГСК из гетерогенных клеточных популяций (например, c-Kit+ HSPCs14 костного мозга). Он также поддерживает трансдукцию или электропорацию ГСК для генетических манипуляций14,15,16. Чтобы помочь идентифицировать ГСК из гетерогенной культивируемой популяции HSPC, CD201 (EPCR) недавно был идентифицирован как полезный маркер ex vivo HSC 10,17,18, при этом трансплантируемые ГСК ограничены фракцией CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage-.
В этом протоколе описываются методы инициирования, поддержания и оценки культур экспансии ГСК мышей на основе ПВА, а также протоколы генетических манипуляций в этих культурах с использованием электропорации или трансдукции лентивирусного вектора. Ожидается, что эти методы будут полезны для целого ряда экспериментальных гематологов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12764416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Appleton Woods Ltd</td>
			<td>HC002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle and mortar</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Limited</td>
			<td>X18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>720-2519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>613-5394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech wipes</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>115-2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS MACS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 &#956;g</td>
			<td>IDT&#160;</td>
			<td>1081058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse stem cell factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse thrombopoietin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-315-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127&#160;APC/Cy7 (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD201&#160;APC (clone: eBio1560)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-2012-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4&#160;APC/Cy7 (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R&#160;APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8a&#160;APC/Cy7 (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C&#160;APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119&#160;APC/Cy7 (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 24-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3337</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 96-well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3330</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>F7524-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Coated plates, 96-well</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500.056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61196.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Enzo Life Sciences (UK) Ltd</td>
			<td>EXB-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T&#252;rks&#8217; solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Mettler-Toledo Ltd</td>
			<td>95015662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures

Самообновляющиеся мультипотентные гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) являются важным типом клеток из-за их способности поддерживать кроветворение на протяжении всей жизни и восстанавливать всю систему крови после трансплантации. ГСК клинически используются в терапии трансплантации стволовых клеток, которая представляет собой лечебное лечение целого ряда заболеваний крови. Существует значительный интерес как к пониманию механизмов, регулирующих активность ГСК и кроветворение, так и к разработке новых методов лечения на основе ГСК. Тем не менее, стабильная культура и экспансия ГСК ex vivo были основным препятствием при изучении этих стволовых клеток в управляемой системе ex vivo . Недавно мы разработали культуральную систему на основе поливинилового спирта, которая может поддерживать долгосрочное и крупномасштабное распространение трансплантируемых ГСК мыши и методов их генетического редактирования. Этот протокол описывает методы культивирования и генетического манипулирования ГСК мыши с помощью электропорации и лентивирусной трансдукции. Ожидается, что этот протокол будет полезен широкому кругу экспериментальных гематологов, интересующихся биологией ГСК и кроветворением.

Для очистки FACS ГСК мы ожидаем, что в костном мозге, обогащенном c-Kit, ~ 0,2% клеток составляют популяцию CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage для молодых (8-12-недельных) мышей C57BL / 6 (рис. 1). Однако вполне вероятно, что трансгенные мыши или мыши разного возраста демон...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures at JoVE.com

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Здесь представлен протокол инициирования, поддержания и анализа культур гемопоэтических стволовых клеток мыши с использованием экспансии на основе поливинилового спирта ex vivo , а также методы генетического манипулирования ими с помощью лентивирусной трансдукции и электропорации.

Ex Vivo Экспансия и генетические манипуляции с гемопоэтическими стволовыми клетками мыши в культурах на основе поливинилового спирта

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Этот протокол позволяет расширять и генетически манипулировать функциональными гемопоэтическими стволовыми клетками мыши, что позволяет глубже понять биологию гемопоэтических стволовых клеток и кроветворение. Преимущество этого метода заключается в том, что он может поддерживать гемопоэтические стволовые клетки в длительной культуре ex vivo и позволяет генетическим манипуляциям исследовать генетику кроветворения. Эта культуральная система представляет собой платформенную технологию для различных исследований биологии гемопоэтических стволовых клеток и кроветворения, включая генетические, молекулярные и биохимические исследования.В таблице устранения неполадок перечислены причины и решения распространенных проблем, возникающих при использовании этого метода. Гораздо проще и эффективнее показать, как правильно извлекать клетки костного мозга и выполнять полную смену среды, чем читать об этом. Чтобы начать экстракцию гемопоэтических стволовых клеток или ГСК, используйте безворсовые деликатные рабочие салфетки для очистки костей, только что выделенных от должным образом усыпленных мышей.Удалите мышцы и спинной мозг из костей, прежде чем добавлять их в ступку, содержащую примерно три миллилитра PBS. С помощью пестика раздавите кости, не измельчая их, чтобы свести к минимуму усилия сдвига. Затем, используя иглу 19-го калибра, прикрепленную к 5-миллилитровому шприцу, разбейте крупные фрагменты костного мозга, выпущенные в PBS, и перенесите суспензию через 70-микронный фильтр в 50-миллилитровую коническую трубку.После того, как суспензия будет перенесена, повторите процесс со свежим PBS, пока кости не отбелятся. Стремитесь к конечному объему примерно 30 миллилитров на мышь и 50 миллилитров на двух мышей, чтобы отбелить кости до тех пор, пока костный мозг не станет виден. Подготовьтесь к обогащению колонны, поместив магнитную фильтрационную колонну в магнит магнитного сепаратора с 50-микронным фильтром сверху и конической трубкой объемом 15 миллилитров внизу.Затем, после обработки клеток аллофикоцианиновым антителом анти-c-Kit и аллофикоцианиновыми магнитными микрошариками, пропустите три миллилитра стерильного PBS через 50-микронный фильтр и фильтрационную колонну. После того, как PBS пройдет, пропустите суспензию ячейки через колонку, а затем каждый раз три промывки по три миллилитра холодного PBS. После каждой стирки подождите, пока колонка перестанет капать, прежде чем добавлять PBS для следующей стирки.Затем снимите колонку с магнита и поместите ее поверх свежей 15-миллилитровой трубки и добавьте в колонку пять миллилитров холодного PBS, прежде чем установить на нее поршень колонки и элюировать ячейки, нажав на поршень. Следуйте протоколу, описанному в тексте, чтобы подготовить достаточное количество среды HSC для желаемого количества клеток или лунок, чтобы засеять от 0,5 до 1 миллиона клеток на миллилитр. Затем отжимают обогащенные c-Kit гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники, или HSPC, и ресуспендируют гранулы в свежеприготовленной среде HSC с желаемой плотностью клеток.Переносите клетки на пластины, покрытые фибронектином, или на заряженные пластины с отрицательной поверхностью, сохраняя соответствующий объем. Поместите клетки в инкубатор для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Аккуратно извлекая пластину из инкубатора для тканевых культур, не нарушая клеточные культуры, используйте пипетку или вакуумный насос для медленной аспирации примерно 90-95% среды из жидкого мениска каждой лунки.Избегайте вытягивания среды из основания колодца. Затем добавьте в лунку один миллилитр свежей среды, предварительно подогретой до 37 градусов по Цельсию. Верните планшет в инкубатор для тканевых культур и меняйте среду каждые два-три дня, пока этого не потребует эксперимент.После ресуспендирования клеток в нуклеофекционном буфере немедленно перенесите клеточную суспензию в ПЦР-пробирку, содержащую комплексный рибонуклеопротеин, и осторожно перемешайте, медленно пипетируя вверх и вниз. Теперь очень медленно перелейте смесь в электропорационную кювету соответствующего объема, поддерживая непрерывное движение жидкости, чтобы избежать образования пузырьков воздуха внутри кюветы. Затем на электропораторе выберите положение электропорируемых скважин.С помощью сенсорного экрана выберите программу типа ячейки как CD34-положительный человек или введите импульсный код EO100, а затем нажмите кнопку OK. Перенесите кювету в электропоратор и нажмите кнопку «Пуск» на сенсорном экране, чтобы начать электропорацию. Сразу после электропорации добавьте в кювету в пять раз больше реакционного объема питательной среды.Теперь аккуратно перенесите клетки на подготовленную пластину, и поместите пластину обратно в инкубатор для культивирования тканей. После выполнения изменения среды, как показано ранее, соберите 10 микролитров клеток и подсчитайте их с помощью раствора Турка в разведении 1:2 с помощью гемоцитометра. Переложите необходимую дозу клеток в пластины, покрытые фибронектином, для трансдукции и отдельно поместите нетрансдуцированные отрицательные контрольные клетки.Затем добавьте лентивирусный вектор в каждую лунку, содержащую клетки, поддерживая дозу 20 единиц трансдукции на клетку для достижения эффективности трансдукции около 30%. Однако определяют дозу лентивирусного вектора эмпирически в зависимости от экспериментальных требований. Наконец, верните клетки в инкубатор для тканевых культур на шесть часов.Выполните изменение среды, как описано ранее. Активированная флуоресценцией сортировка клеток ГСК, обогащенных c-Kit, дала примерно 0,2% клеток, которые были CD150-положительными, CD34-отрицательными, c-Kit-положительными, Sca1-положительными и лайн-отрицательными. После четырех недель культивирования HSPC было обнаружено, что CD201-положительная, CD150-положительная, c-Kit-положительная, Sca1-положительная и линейно-отрицательная фракции составляют около 10%После трансдукции лентивирусным вектором, экспрессирующим GFP, GFP-положительные клетки составляли примерно 30%При слиянии ожидаемая плотность культур составляла около 2 миллионов клеток на миллилитр.Приблизительно 50% гибели клеток наблюдалось в течение первых 24-48 часов до того, как была выполнена первая смена среды. Однако через неделю количество ячеек вернулось к 80-100% от числа посеянных ячеек. Точная смена сред с использованием свежих и предварительно подогретых сред имеет решающее значение для долгосрочной стабильности этого метода культивирования HSC.С тех пор, как оригинальный метод был опубликован в 2019 году, область начала использовать его по-разному для изучения биологии ГСК.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Выделение и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Вывод гемопоэтических стволовых клеток мышей эмбриональных стволовых клеток

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Лентивирусов-опосредованной Нокдаун В Ex Vivo Эритропоэз прав гемопоэтических стволовых клеток

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Фенотипический анализ и выделение мышей гемопоэтических стволовых клеток и Lineage, совершенных прародителей

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Альтернативные Культуры для человека плюрипотентных стволовых клеток производство, техобслуживание, и генетический анализ

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

В режиме реального времени Анализ метаболического профиля в<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Мышь Кишечная Crypt Органоид Культуры

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Измерение Жесткость<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Аорте при помощи мыши атомно-силовой микроскопии

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Транс внутренняя ячейка массы впрыска эмбриональных стволовых клеток приводит к более высоким ставкам химеризма

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...