Name: ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures at JoVE.com

Vi tackar WIMM Flow Cytometry Core för åtkomst till flödescytometri och WIMM Virus Screening Core för lentiviral vektorgenerering. Detta arbete finansierades av Kay Kendall Leukaemia Fund och UK Medical Research Council.

Alla djurförsök, inklusive avel och avlivning, måste utföras inom institutionella och nationella riktlinjer. Experimenten som beskrivs nedan godkändes av det brittiska inrikesdepartementet. Se materialförteckningen för en lista över alla material, reagenser och utrustning som används i detta protokoll.
1. Förbereda stamlösningar
<ol><li>PVA-stamlösning<ol><li>Ta 50 ml vävnadsodlingskvalitetsvatten i en liten glasflaska (lämplig för autoklaveri...

<ol>
	<li>Laurenti, E., G&#246;ttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells:+concepts,+definitions,+and+the+new+reality.">Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality.</a> Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).</li><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo.">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).</li><li>Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+haematopoietic+stem+cell+niches.">Adult haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Granot, N., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+hematopoietic+cell+transplantation:+challenges+and+progress.">History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress.</a> Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 1-5 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+haematopoietic-stem-cell+expansion+allows+nonconditioned+transplantation.">Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation.</a> Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+polyvinyl+alcohol+for+chimeric+antigen+receptor+T-cell+expansion.">Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion.</a> Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).</li><li>Becker, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+cell+cloning+platform+for+gene+edited+functional+murine+hematopoietic+stem+cells.">A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+optimization+enables+maintenance+of+quiescent+hematopoietic+stem+cells+ex+vivo.">Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo.</a> Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).</li><li>Kobayashi, H., Takubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+method+to+maintain+quiescent+human+hematopoietic+stem+cells.">A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).</li><li>Aal Wilson, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conditioned+bone+marrow+chimeric+mouse+generation+using+culture-based+enrichment+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice.">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).</li><li>Haney, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+in+vivo+CRISPR+screens+identify+SAGA+complex+members+as+a+key+regulators+of+HSC+lineage+commitment+and+aging.">Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Che, J. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+in+vitro+expanded+hematopoietic+stem+cells.">Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells.</a> EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).</li><li>Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+potential+of+murine+hematopoietic+stem+cells:+a+rare+property+only+partially+predicted+by+phenotype.">Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+guide+RNA+design+guidelines+for+efficient+genome+editing.">CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).</li><li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments.">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+expansion+of+mouse+hematopoietic+stem+cells.">Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells.</a> Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).</li><li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+all-recombinant+protein-based+culture+system+specifically+identifies+hematopoietic+stem+cell+maintenance+factors.">An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li></ol>

Vi hoppas att detta protokoll ger ett användbart tillvägagångssätt för att undersöka HSC-biologi, hematopoes och hematologi mer allmänt. Sedan den initiala utvecklingen av den PVA-baserade odlingsmetoden för FACS-renade HSCs8 har metoden utvidgats. Till exempel har metoden visat sig fungera med c-Kit berikad med benmärg och med negativa ytladdade plattor14. Dess kompatibilitet med transduktion och elektroporering har också visats14,15<...

Det hematopoietiska systemet stöder en rad viktiga processer hos däggdjur, från syretillförsel till bekämpning av patogener, genom specialiserade blod- och immuncelltyper. Kontinuerlig blodproduktion (hematopoies) krävs för att stödja blodsystemets homeostas, som upprätthålls av hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC)1. Den mest primitiva hematopoetiska cellen är den hematopoetiska stamcellen (HSC), som har unik kapacitet för självförnyelse och multilineagedifferentiering 2,3. Detta är en sällsynt cellpopulation, som främst finns i den vuxna benmärgen4, där de förekommer med en frekvens av bara ungefär en var 30 000 celler. HSC tros stödja livslång hematopoes och hjälpa till att återupprätta hematopoies efter hematologisk stress. Dessa kapaciteter gör det också möjligt för HSC att stabilt rekonstituera hela det hematopoetiska systemet efter transplantation till en bestrålad mottagare5. Detta representerar den funktionella definitionen av en HSC och utgör också den vetenskapliga grunden för HSC-transplantationsterapi, en botande behandling för en rad blod- och immunsjukdomar6. Av dessa skäl är HSC ett stort fokus för experimentell hematologi.
Trots ett stort forskningsfokus har det varit utmanande att stabilt utöka HSC ex vivo7. Vi utvecklade nyligen det första långsiktiga ex vivo-expansionsodlingssystemet för mus HSC8. Tillvägagångssättet kan expandera transplanterbara HSC med 234-899 gånger över en 4 veckors kultur. I jämförelse med alternativa tillvägagångssätt var den största förändringen i protokollet avlägsnandet av serumalbumin och dess ersättning med en syntetisk polymer. Polyvinylalkohol (PVA) identifierades som en optimal polymer för mössens HSC-kulturer8, som nu också har använts för att odla andra hematopoetiska celltyper9. Emellertid har en annan polymer som heter Soluplus (en polyvinylkaprolaktamacetat-polyetylenglykolgraftsampolymer) också nyligen identifierats, vilket verkar förbättra klonal HSC-expansion10. Före användning av polymerer användes serumalbumin i form av fetalt bovint serum, bovint serumalbuminfraktion V eller rekombinant serumalbumin, men dessa hade begränsat stöd för HSC-expansion och stödde endast kortvarig (~ 1 vecka) ex vivo-kultur 7. Det bör dock noteras att HSC-odlingsprotokoll som håller HSC i vilande tillstånd kan stödja en längre ex vivo-odlingstid 11,12.
I jämförelse med andra odlingsmetoder är en stor fördel med PVA-baserade kulturer antalet celler som kan genereras och hur lång tid protokollet kan användas för att spåra HSC ex vivo. Detta övervinner flera hinder inom experimentell hematologi, såsom det låga antalet HSC som kan isoleras per mus (bara några tusen) och svårigheten att spåra HSC över tid in vivo. Det är dock viktigt att komma ihåg att dessa kulturer stimulerar HSC-proliferation, medan in vivo HSC-poolen huvudsakligen är vilande vid ett stabilt tillstånd13. Dessutom, även om kulturerna är selektiva för HSC, ackumuleras ytterligare celltyper med kulturerna över tiden, och transplanterbara HSC representerar endast ungefär en av 34 celler efter 1 månad. Myeloida hematopoetiska stamceller verkar vara den huvudsakliga förorenande celltypen i dessa HSC-kulturer8. Ändå kan vi använda dessa kulturer för att berika HSC från heterogena cellpopulationer (t.ex. c-Kit + benmärgs HSPC14). Det stöder också transduktion eller elektroporering av HSC för genetisk manipulation14,15,16. För att hjälpa till att identifiera HSC från den heterogena odlade HSPC-populationen har CD201 (EPCR) nyligen identifierats som en användbar ex vivo HSC-markör 10,17,18, med transplanterbara HSC begränsade till CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage-fraktionen.
Detta protokoll beskriver metoder för att initiera, underhålla och utvärdera PVA-baserade mus HSC-expansionskulturer, samt protokoll för genetisk manipulation inom dessa kulturer med hjälp av elektroporering eller lentiviral vektortransduktion. Dessa metoder förväntas vara användbara för en rad experimentella hematologer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12764416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Appleton Woods Ltd</td>
			<td>HC002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle and mortar</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Limited</td>
			<td>X18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>720-2519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>613-5394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech wipes</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>115-2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS MACS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 &#956;g</td>
			<td>IDT&#160;</td>
			<td>1081058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse stem cell factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse thrombopoietin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-315-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127&#160;APC/Cy7 (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD201&#160;APC (clone: eBio1560)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-2012-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4&#160;APC/Cy7 (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R&#160;APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8a&#160;APC/Cy7 (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C&#160;APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119&#160;APC/Cy7 (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 24-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3337</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 96-well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3330</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>F7524-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Coated plates, 96-well</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500.056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61196.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Enzo Life Sciences (UK) Ltd</td>
			<td>EXB-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T&#252;rks&#8217; solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Mettler-Toledo Ltd</td>
			<td>95015662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures

Självförnyande multipotenta hematopoetiska stamceller (HSC) är en viktig celltyp på grund av deras förmåga att stödja hematopoes under hela livet och rekonstituera hela blodsystemet efter transplantation. HSC används kliniskt i stamcellstransplantationsterapier, som representerar botande behandling för en rad blodsjukdomar. Det finns ett stort intresse för att både förstå mekanismerna som reglerar HSC-aktivitet och hematopoes och utveckla nya HSC-baserade terapier. Den stabila odlingen och expansionen av HSCs ex vivo har dock varit ett stort hinder för att studera dessa stamceller i ett lätthanterligt ex vivo-system. Vi utvecklade nyligen ett polyvinylalkoholbaserat odlingssystem som kan stödja långsiktig och storskalig expansion av transplanterbara mus-HSC och metoder för att genetiskt redigera dem. Detta protokoll beskriver metoder för att odla och genetiskt manipulera HSC hos möss via elektroporering och lentiviral transduktion. Detta protokoll förväntas vara användbart för ett brett spektrum av experimentella hematologer intresserade av HSC-biologi och hematopoies.

För FACS-rening av HSC förväntar vi oss att inom den c-Kit-anrikade benmärgen är ~ 0,2% av cellerna CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage- population för unga (8-12 veckor gamla) C57BL / 6-möss (figur 1). Det är dock troligt att transgena möss eller möss i olika åldrar uppvisar olika HSC-frekvenser. Efter 4 veckors kultur förväntar vi oss att CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage- f...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures at JoVE.com

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Här presenteras ett protokoll för att initiera, underhålla och analysera hematopoetiska stamcellskulturer hos möss med användning av ex vivo polyvinylalkoholbaserad expansion, samt metoder för att genetiskt manipulera dem genom lentiviral transduktion och elektroporering.

Ex Vivo Expansion och genetisk manipulation av mushematopoetiska stamceller i polyvinylalkoholbaserade kulturer

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Detta protokoll tillåter expansion och genetisk manipulation av funktionella mushematopoetiska stamceller, vilket möjliggör en djupare förståelse av hematopoetisk stamcellsbiologi och hematopoies. Fördelen med denna teknik är att den kan stödja hematopoetiska stamceller i långsiktig ex vivo-odling och tillåta genetisk manipulation för att förhöra genetiken hos hematopoies. Detta odlingssystem tillhandahåller en plattformsteknik för olika studier av hematopoetisk stamcellsbiologi och hematopoies, inklusive genetiska, molekylära och biokemiska studier.Felsökningstabellen listar orsakerna och lösningarna för de vanliga kamperna som uppstår med den här tekniken. Det är mycket lättare och effektivare att visa hur man korrekt extraherar benmärgsceller och utför fullständiga medieförändringar snarare än att läsa om det. För att påbörja hematopoetisk stamcell, eller HSC, extraktion, använd luddfria känsliga arbetsdukar för att rengöra benen som nyligen isolerats från ordentligt avlivade möss.Ta bort muskler och ryggmärg från benen innan du lägger dem till en murbruk som innehåller cirka tre milliliter PBS. Krossa benen med en stöt utan att slipa dem för att minimera skjuvkrafterna. Sedan, med hjälp av en 19-gauge nål fäst vid en 5-milliliter spruta, bryta upp de stora benmärgsfragmenten som släpps ut i PBS och överför suspensionen genom ett 70-mikron filter till ett 50-milliliter koniskt rör.När suspensionen har överförts, upprepa processen med ny PBS tills benen blekts. Sikta på en ändvolym på cirka 30 milliliter per mus och 50 ml för två möss för att bleka benen tills ingen mer märg är synlig. Förbered dig för kolonnanrikning genom att placera en magnetisk filtreringskolonn i magneten på en magnetisk kolonnseparator med ett 50 mikron filter ovanpå och ett 15 ml koniskt rör nedanför.Därefter, efter behandling av cellerna med allophycocyanin anti-c-Kit-antikropp och allophycocyanin magnetiska mikrokulor, kör tre milliliter steril PBS genom 50-mikronfiltret och filtreringskolonnen. När PBS har gått igenom, passera cellsuspensionen genom kolonnen, följt av tre tvättar av tre milliliter kall PBS varje gång. Efter varje tvätt, vänta tills kolonnen slutar droppa innan du lägger till PBS för nästa tvätt.Ta sedan bort kolonnen från magneten och placera den ovanpå ett nytt 15-milliliter rör och tillsätt fem milliliter kall PBS i kolonnen innan du monterar kolonnkolven på den och eluerar cellerna genom att trycka på kolven. Följ protokollet som beskrivs i texten för att förbereda tillräckligt med HSC-medium för önskat antal celler eller brunnar för att fröa 0,5 till 1 miljon celler per milliliter. Snurra sedan ner de c-Kit-berikade hematopoetiska stam- och stamcellerna, eller HSPC, och resuspendera pelleten i det nyberedda HSC-mediet vid önskad celldensitet.Överför cellerna till fibronektinbelagda eller negativa ytladdade plattor, bibehåll lämplig volym. Placera cellerna i en vävnadsodlingsinkubator vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Efter att försiktigt ha tagit bort plattan från vävnadsodlingsinkubatorn utan att störa cellkulturerna, använd en pipett eller vakuumpump för att långsamt aspirera cirka 90 till 95% av mediet från den flytande menisken i varje brunn.Undvik att dra upp medium från brunnens botten. Tillsätt sedan en milliliter färskt medium förvärmt till 37 grader Celsius i brunnen. Sätt tillbaka plattan till vävnadsodlingsinkubatorn och byt media varannan tre till tre dagar tills experimentet kräver.Efter resuspendering av cellerna i nukleofektionsbuffert, överför omedelbart cellsuspensionen till PCR-röret som innehåller det komplexbildade ribonukleoproteinet och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner långsamt. Överför nu blandningen till en elektroporeringskyvett med lämplig volym mycket långsamt, upprätthåll en kontinuerlig vätskerörelse för att undvika att bilda luftbubblor inuti kyvetten. Välj sedan positionen för brunnarna som elektroporeras på elektroporatorn.Använd pekskärmen, välj celltypsprogrammet som CD34-positiv människa eller skriv in pulskoden EO100 och tryck sedan på OK. Överför kyvetten till elektroporatorn och tryck på Start-knappen på pekskärmen för att starta elektroporering. Omedelbart efter elektroporering, tillsätt fem gånger reaktionsvolymen för odlingsmediet till kyvetten.Överför nu försiktigt cellerna till den förberedda plattan och placera plattan tillbaka i vävnadsodlingsinkubatorn. Efter att ha utfört en medieförändring som visats tidigare, samla 10 mikroliter av cellerna och räkna dem med Turks lösning vid en utspädning av 1: 2 med en hemocytometer. Replate den erforderliga dosen av celler i fibronektinbelagda plattor för transduktion, och separat, platta de icke-transducerade negativa kontrollcellerna.Tillsätt sedan den lentivirala vektorn till varje brunnsinnehållande celler, upprätthåll en dos på 20 transduktionsenheter per cell för att uppnå cirka 30% transduktionseffektivitet. Bestäm emellertid lentiviral vektordos empiriskt beroende på experimentkraven. Slutligen återför cellerna till vävnadsodlingsinkubatorn i sex timmar.Utför en medeländring enligt beskrivningen ovan. Den fluorescensaktiverade cellsorteringen av de c-Kit-berikade HSC: erna gav cirka 0,2% av cellerna som var CD150-positiva, CD34-negativa, c-Kit-positiva, Sca1-positiva och härstamningsnegativa. Efter fyra veckors HSPC-odling befanns de CD201-positiva, CD150-positiva, c-Kit-positiva, Sca1-positiva och härstamningsnegativa fraktionerna vara cirka 10%Efter transduktion med en GFP-uttryckande lentiviral vektor var de GFP-positiva cellerna cirka 30%När de sammanflyter var den förväntade densiteten hos kulturerna cirka 2 miljoner celler per milliliter.Cirka 50 % celldöd observerades inom de första 24 till 48 timmarna innan den första medieförändringen utfördes. Efter en vecka återvände dock cellantalet till 80 till 100% av det sådda cellantalet. Noggranna medieförändringar med hjälp av färska och förvärmda medier är avgörande för den långsiktiga stabiliteten för denna HSC-odlingsmetod.Sedan den ursprungliga metoden publicerades 2019 har fältet börjat använda den på olika sätt för att studera HSC-biologi.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolering och transplantation av hematopoetiska stamceller (HSCs)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Härledning av hematopoetiska stamceller från Murine embryonala stamceller

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Metod för kultur av tidig kycklingembryon ex vivo (New Kultur)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-medierad Knockdown Under Ex vivo Erytropoes av mänskliga hematopoetiska stamceller

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypisk analys och isoleringen av murina hematopoietiska stamceller och Linjen-bundna stamfäder

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternativa kulturer för Human pluripotenta stamceller Produktion, underhåll, samt genetisk analys

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analys av Metabolic profil i<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mouse Intestinal Crypt organoid kulturer

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Mätning av styvheten hos<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aorta Använda atomkraftsmikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-inner Cell Mass injektion av embryonala stamceller leder till högre chimärism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...