Name: isolation of nuclei from flash-frozen liver tissue for single-cell multiomics
Uploaded: 2022-12-09T14:40:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics at JoVE.com

تم دعم هذا البحث من قبل حرم هيلمهولتز بايونير (M.S. ، K.Y. ، C.P.M.-J.) ومعهد البيولوجيا الحاسوبية (C. T.-L.). تم دعم هذا البحث أيضا من قبل AMED تحت رقم المنحة JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). نشكر دعم الجينوم الأساسي في HMGU (I. de la Rosa) والمعلوماتية الحيوية (T. Walzthoeni) ، ولا سيما Xavier Pastor للتدريب والتوجيه. نشكر A. Feuchtinger و U. Buchholz و J. Bushe وجميع الموظفين الآخرين من مرفق HMGU Pathology and Tissue Analytic الأساسي على دعمهم الفني والعلمي ، بالإضافة إلى J. Zorn و R. Erdelen و D. Würzinger وموظفي E-Streifen ، بالإضافة إلى المرفق الأساسي لخدمات المختبر على دعمهم العلمي المستمر ومناقشاتهم. نحن ممتنون لتحليل خلايا المنشأة الأساسية في TranslaTUM (R. Mishra) ، و Luminex ، شركة DiaSorin (P. Rein). نشكر الدكتور I Deligiannis على دعمه الفني. كان الدكتور إم هارتمان والدكتور أ. شرودر والسيدة أ. باردن (حرم هيلمهولتز بايونير) أساسيين لدعمهم القانوني والإداري والإداري.

<ol>
	<li>Kamies, R., Martinez-Jimenez, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+of+single-cell+genomics+and+epigenomics+in+human+disease:+where+are+we+now.">Advances of single-cell genomics and epigenomics in human disease: where are we now.</a> Mamm Genome. 31 (5-6), 170-180 (2020).</li><li>Ramachandran, P., Matchett, K. P., Dobie, R., Wilson-Kanamori, J. R., Henderson, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+in+hepatology:+New+insights+into+liver+biology+and+disease+pathogenesis.">Single-cell technologies in hepatology: New insights into liver biology and disease pathogenesis.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 17 (8), 457-472 (2020).</li><li>Ramachandran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+fibrotic+niche+of+human+liver+cirrhosis+at+single-cell+level.">Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level.</a> Nature. 575 (7783), 512-518 (2019).</li><li>Andrews, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+single-nucleus,+and+spatial+RNA+sequencing+of+the+human+liver+identifies+cholangiocyte+and+mesenchymal+heterogeneity.">Single-cell, single-nucleus, and spatial RNA sequencing of the human liver identifies cholangiocyte and mesenchymal heterogeneity.</a> Hepatology Communications. 6 (4), 821-840 (2022).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+intercellular+crosstalk+in+healthy+and+NASH+liver+revealed+by+single-cell+secretome+gene+analysis.">Landscape of intercellular crosstalk in healthy and NASH liver revealed by single-cell secretome gene analysis.</a> Molecular Cell. 75 (3), 644-660 (2019).</li><li>Richter, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+RNA-seq2+reveals+functional+crosstalk+between+liver+zonation+and+ploidy.">Single-nucleus RNA-seq2 reveals functional crosstalk between liver zonation and ploidy.</a> Nature Communications. 12 (1), 4264 (2021).</li><li>Matsumoto, T., Wakefield, L., Tarlow, B. D., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+lineage+tracing+of+polyploid+hepatocytes+reveals+extensive+proliferation+during+liver+regeneration.">In vivo lineage tracing of polyploid hepatocytes reveals extensive proliferation during liver regeneration.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 34-47 (2020).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+distribution+of+hepatocyte+proliferation+in+liver+homeostasis+and+regeneration.">Broad distribution of hepatocyte proliferation in liver homeostasis and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 27-33 (2020).</li><li>Donne, R., Saroul-Ainama, M., Cordier, P., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+in+liver+development,+homeostasis+and+disease.">Polyploidy in liver development, homeostasis and disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 17 (7), 391-405 (2020).</li><li>Lengefeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+is+a+determinant+of+stem+cell+potential+during+aging.">Cell size is a determinant of stem cell potential during aging.</a> Science Advances. 7 (46), 0271 (2021).</li><li>Lanz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+size+remodels+the+proteome+and+promotes+senescence.">Increasing cell size remodels the proteome and promotes senescence.</a> Mol Cell. 82 (17), 3255-3269 (2022).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIDDosome-SCAP+crosstalk+controls+high-fructose-diet-dependent+transition+from+simple+steatosis+to+steatohepatitis.">PIDDosome-SCAP crosstalk controls high-fructose-diet-dependent transition from simple steatosis to steatohepatitis.</a> Cell Metabolism. 34 (10), 1548-1560 (2022).</li><li>Padovan-Merhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+mammalian+cells+compensate+for+differences+in+cellular+volume+and+DNA+copy+number+through+independent+global+transcriptional+mechanisms.">Single mammalian cells compensate for differences in cellular volume and DNA copy number through independent global transcriptional mechanisms.</a> Molecular Cell. 58 (2), 339-352 (2015).</li><li>Miettinen, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+transcriptional+and+metabolic+programs+related+to+mammalian+cell+size.">Identification of transcriptional and metabolic programs related to mammalian cell size.</a> Current Biology. 24 (6), 598-608 (2014).</li><li>Vargas-Garcia, C. A., Ghusinga, K. R., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+control+and+gene+expression+homeostasis+in+single-cells.">Cell size control and gene expression homeostasis in single-cells.</a> Current Opinion in Systems Biology. 8, 109-116 (2018).</li><li>Knoblaugh, S. E., Randolph-Habecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Necropsy and histology. In Comparative Anatomy and Histology: A Mouse, Rat, and Human Atlas (Second Edition). , (2018).</li><li>Chromium Next GEM Single Cell 3 Reagent Kits v3.1 User Guide. Document number CG000204 (Rev D). 10x Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2019)</li><li>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide. Document number CG000338 (Rev D). 10x Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide</a> (2021)</li><li>MacParland, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+of+human+liver+reveals+distinct+intrahepatic+macrophage+populations.">Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations.</a> Nature Communications. 9 (1), 4383 (2018).</li><li>Martinez-Jimenez, C. P., Kyrmizi, I., Cardot, P., Gonzalez, F. J., Talianidis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+4alpha+coordinates+a+transcription+factor+network+regulating+hepatic+fatty+acid+metabolism.">Hepatocyte nuclear factor 4alpha coordinates a transcription factor network regulating hepatic fatty acid metabolism.</a> Molecular and Cell Biology. 30 (3), 565-577 (2010).</li><li>Schmidt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-vertebrate+ChIP-seq+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+transcription+factor+binding.">Five-vertebrate ChIP-seq reveals the evolutionary dynamics of transcription factor binding.</a> Science. 328 (5981), 1036-1040 (2010).</li><li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data.">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Madad, S., Lareau, C. A., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+state+analysis+with+Signac.">Single-cell chromatin state analysis with Signac.</a> Nature Methods. 18 (11), 1333-1341 (2021).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+organoids+can+repair+bile+ducts+after+transplantation+in+the+human+liver.">Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver.</a> Science. 371 (6531), 839-846 (2021).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+as+a+tool+for+studying+toxicity+and+drug+metabolism.">Human hepatocytes as a tool for studying toxicity and drug metabolism.</a> Current Drug Metabolism. 4 (4), 292-312 (2003).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+in+primary+culture:+The+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man.">Human hepatocytes in primary culture: The choice to investigate drug metabolism in man.</a> Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).</li><li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows.">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).</li><li>Nault, R., Fader, K. A., Bhattacharya, S., Zacharewski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nuclei+RNA+sequencing+assessment+of+the+hepatic+effects+of+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.">Single-nuclei RNA sequencing assessment of the hepatic effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (1), 147-159 (2021).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+as+a+mechanism+for+stress-induced+liver+adaptation.">Aneuploidy as a mechanism for stress-induced liver adaptation.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (9), 3307-3315 (2012).</li><li>Kreutz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+ploidy+is+a+diversity+factor+for+liver+homeostasis.">Hepatocyte ploidy is a diversity factor for liver homeostasis.</a> Frontiers in Physiology. 8, 862 (2017).</li><li>Hunt, N. J., Kang, S. W. S., Lockwood, G. P., Le Couteur, D. G., Cogger, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+aging+in+the+liver.">Hallmarks of aging in the liver.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 1151-1161 (2019).</li><li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+spectrum:+a+new+marker+in+HCC+classification.">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. 69 (2), 355-364 (2019).</li><li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li><li>Schwartz-Arad, D., Zajicek, G., Bartfeld, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+streaming+liver+IV:+DNA+content+of+the+hepatocyte+increases+with+its+age.">The streaming liver IV: DNA content of the hepatocyte increases with its age.</a> Liver. 9 (2), 93-99 (1989).</li><li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (6), 387-393 (1993).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Granja, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArchR+is+a+scalable+software+package+for+integrative+single-cell+chromatin+accessibility+analysis.">ArchR is a scalable software package for integrative single-cell chromatin accessibility analysis.</a> Nature Genetics. 53 (3), 403-411 (2021).</li><li>Bredikhin, D., Kats, I., Stegle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUON:+Multimodal+omics+analysis+framework.">MUON: Multimodal omics analysis framework.</a> Genome Biology. 23 (1), 42 (2022).</li><li>Velten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+temporal+and+spatial+patterns+of+variation+from+multimodal+data+using+MEFISTO.">Identifying temporal and spatial patterns of variation from multimodal data using MEFISTO.</a> Nature Methods. 19 (2), 179-186 (2022).</li></ol>

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

يوفر تشريح التركيب الخلوي للكبد بواسطة خلية واحدة أو نواة واحدة RNA-seq فهما أعمق لتطور أمراض الكبد وتطورها3،4،5،24. يستغرق عزل الخلية الواحدة من الكبد وقتا طويلا ويتطلب بروتوكولات تنطوي على تفكك ميكانيكي أو إنزيمي قاسي25،26،27. من المقبول على نطاق واسع أن كل نسيج يتطلب تقييما منهجيا لتحديد بروتوكول تفكك الأنسجة الأمثل ، بالإضافة إلى طريقة تخزين مناسبة لالتقاط أنواع الخلايا الهشة أو النوى28. اعتمادا على توافر الأنسجة أو المرض محل الاهتمام أو مرحلة النمو أو الكائن الحي النموذجي ، قد يكون إعداد معلق أحادي النواة للمعالجة النهائية منهجية أكثر ملاءمة من استخدام معلقات أحادية الخلية. الأهم من ذلك ، في الكبد ، أظهر scRNA-seq و snRNA-seq ارتباطا عاليا بين mRNA النووي والسيتوبلازمي ، مما يشير إلى أن كلا النهجين يقدمان معلومات تكميلية2،3،4،6،29.
توفر هذه الورقة عزلة أحادية النواة موحدة وقوية وقابلة للتكرار من عينات الكبد المجمدة والمؤرشفة من الفئران والأنواع الأخرى ، بما في ذلك البشر المكاك. يمكن استخدام هذه الطريقة للفئران البرية التي تتغذى على الطعام والنظام الغذائي عالي الدهون (HFD) ولنماذج الفئران من تليف الكبد باستخدام كل من النهج الجينومية أحادية النواة القائمة على الصفائح والقطيرات6. تعتمد هذه الطريقة على البروتوكول الموصوف أصلا لأنسجة المخ بواسطة Krishnaswami et al.30 مع تعديلات إضافية مصممة خصيصا للكبد المجمد. التجانس الأمثل يحرر معظم النوى من الأنسجة دون التأثير سلبا على سلامة الغشاء النووي. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي الإفراط في الإغراق إلى إتلاف النوى الهشة وتقليل جودتها الإجمالية. عادة ما تتطلب الكبد الصغير و / أو الدهني 5 ضربات فقط مع المدقة A و 10 ضربات مع المدقة B ، بينما قد تتطلب الكبد القديم و / أو الليفي 15 ضربة مع المدقة B ولكن ليس أكثر. لذلك ، لا يوصى بإجراء المزيد من السكتات الدماغية بما يتجاوز الأرقام المشار إليها هنا. قد يؤثر الإفراط في تناول الطعام سلبا على جودة التعليق أحادي النواة ويزيد من كمية الحمض النووي الريبي المحيط. بعد ذلك ، قد يؤدي ذلك إلى الحاجة إلى تنفيذ خطوات تصفية حسابية إضافية أثناء تحليلات البيانات النهائية.
البروتوكول المقدم هنا متعدد الاستخدامات ويمكن تعديله وفقا لظروف الكبد المختلفة في الفئران الصغيرة (3 أشهر) والكبيرة (24 شهرا). نظرا لأننا وجدنا أن قسما أكبر من الكبد ضروري للأنسجة القديمة و HFD والأنسجة الليفية ، فإن حجم الأنسجة المتاحة للمعالجة يمكن أن يشكل قيدا لبعض المستخدمين الذين لديهم كميات أقل من المواد البيولوجية الأولية. ومع ذلك ، يوصى بشدة بتنقية التدرج للمعالجة الفورية للعينات باستخدام المقايسات الجينومية القائمة على القطيرات. إذا كانت النوى بحاجة إلى فرز FACS إلى 96-/384 لوحة بئر للمقايسات القائمة على الآبار ، فيمكن حذف تنقية التدرج. نحن نشجع المستخدمين على الاستمرار في إجراء تنقية التدرج إذا كان هناك عينة أنسجة كافية للحصول على تركيز النوى الموصى به لفرز FACS (أي ~ 1 × 105 نوى / مل).
يتميز الكبد بالطبيعة متعددة الصبغيات لخلايا الكبد9 ، لكن دور الصبغيات الكبدية في علم وظائف الأعضاء الطبيعي والمرض لم يتضح بعد. هناك مجموعة متزايدة من الأدلة التي تشير إلى أن الصيغة الصبغية توفر التباين الجيني31 ، ومن المعروف أن الصيغة الصبغية تزداد مع سن32,33. ومع ذلك ، فإن إثراء الخلايا الكبدية رباعية النواة يرتبط أيضا سريريا بسوء التشخيص في سرطان الخلايا الكبدية البشرية (HCC)34. وبالمثل ، ترتبط التغيرات في مستويات الصيغة الصبغية لخلايا الكبد بأمراض الكبد المزمنة المرتبطة بالشيخوخة مثل مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD)35،36،37. الصيغة الصبغية هي حالة امتلاك أكثر من نسختين من الجينوم ، والتي يمكن استكشافها عن طريق تلطيخ محتوى الجينوم بصبغة الحمض النووي مثل Hoechst38. صبغة Hoechst ، التي تضاف إلى HB قبل الاستخراج ، تسمي جميع النوى أثناء بروتوكول العزل. يسمح هذا بالتمييز بين النوى ثنائية الصيغة الصبغية ومتعددة الصبغيات بناء على محتوى الحمض النووي الخاص بها عند إثارتها بواسطة ليزر UV (350 نانومتر) أو ليزر بنفسجي (450 نانومتر) على أداة قياس التدفق الخلوي. باستخدام استراتيجية البوابات المعروضة ، يمكن التحقيق في مستويات 2n و 4n و 8n ومستويات أعلى من الصيغة الصبغية لخلايا الكبد في الكبد المجمد والمؤرشف لفهم دور عدم التجانس الخلوي في وظيفة الأنسجة1 بشكل أفضل (الشكل 3 أ). علاوة على ذلك ، يمكن قياس التشكل النووي ، بما في ذلك الحجم والحجم ، باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير لربط التغيرات في حجم النواة بالتغيرات في العدد الإجمالي للأعداد أو عدد الجينات اعتمادا على مستوى الصيغة الصبغية (الشكل 3B ، C).
يوفر قياس الأوميكس متعدد الوسائط الفرصة للتحقيق في عدة طبقات من التنظيم الجينومي في وقت واحد. يسمح نهج multiomics المشترك RNA + ATAC بالتحقيق في منظمات المنبع والجينات الأيضية النهائية ، مما يوفر نهجا شاملا لدراسة شبكات النسخ وبنية الكروماتين المرتبطة بوظائف الكبد بدقة الخلية الواحدة. علاوة على ذلك ، مع التقدم في الأساليب الحسابية التي يمكن أن تفسر تناثر البيانات وانخفاض تكاليف التسلسل ، فإن multiomics أحادية الخلية رائدة في تقييم طرائق متعددة من نفس الخلية. يتوافق بروتوكول عزل النواة الواحدة هذا مع التقييم الفردي والمشترك لمجموعات بيانات التعبير والكروماتين. لقد استخدمنا خطوط الأنابيب القياسية التي أنشأها Stuart et al.23 (حزمة Signac) لتوضيح جودة البيانات ، في حين يمكن بسهولة اعتماد العديد من الطرق الحسابية المتاحة والبديلة لتحليلات المصب 23،39،40،41.
بشكل عام ، تسمح multiomics أحادية النواة بالتحقيق في أنسجة الكبد الرئيسية المؤرشفة بيولوجيا ، وفأر FF ، والإنسان ، وغير البشري باستخدام كمية صغيرة جدا من مواد عينة البدء من خلال تنفيذ بروتوكول استخراج النواة المقدم هنا. ستمكن هذه الأداة التي لا تقدر بثمن علماء بيولوجيا الكبد من استجواب كل من التعبير الجيني وإمكانية الوصول إلى الكروماتين في سياق أمراض الكبد المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكشف مستويات مختلفة من الصيغة الصبغية للخلايا الكبدية والتعديل الناتج عن التعبير الجيني الذي يعتمد على موقعها في فصيص الكبد عن دورها في أمراض الكبد. لذلك ، نتوقع أن يوفر التحقيق في عدم التجانس الخلوي فرصا جديدة لتطوير الطب الدقيق والتدخلات المستهدفة ضد أمراض مثل HCC و NAFLD.

أصبح علم جينوم الخلية الواحدة بسرعة منهجية أساسية لدراسة وظائف الكبد وتقييم تأثير عدم التجانس الخلوي في الصحة والظروف المرضية1. إن التطور السريع ل "multiomics" للقياس المتزامن لطبقات مختلفة من المعلومات والتوسع المتوازي لخطوط الأنابيب الحسابية القوية يمهد الطريق لاكتشاف أنواع الخلايا والأنواع الفرعية غير المعروفة سابقا في الكبد الطبيعي والمريض2.
زادت إمكانية استكشاف البنوك الحيوية والعينات المجمدة المؤرشفة بشكل كبير من فرص إعادة النظر واكتشاف دور الخلايا غير المتنية3،4،5 والتحقيق في دور خلايا الكبد متعددة الصبغيات أثناء الشيخوخة وفي الأمراض المزمنة6،7،8،9 . لذلك ، تصف هذه الورقة بروتوكول عزل أحادي النواة قوي وقابل للتكرار للكبد المؤرشف المجمد (FF) المتوافق مع تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة في نهاية المصب وتسلسل ATAC ، وكذلك مع omics متعدد الوسائط (RNA-seq المشترك و ATAC-seq) (الشكل 1).
يسمح سير العمل هذا بالتحقيق في إمكانية الوصول إلى النسخ والكروماتين لجميع أنواع الخلايا في الكبد ، بغض النظر عن حجم الخلية أو هشاشتها ، في بروتوكولات التفكك الأنزيمي. يمكن إجراؤه باستخدام أقسام الأنسجة الصغيرة (15-30 مجم أو 5-10 مم3) من عينات بشرية ثمينة أو فئران معدلة وراثيا. يتضمن تحديد درجة النقاء العالية لعزل النوى القياس الكمي وقياس الحجم النووي ، والذي قد يرتبط بزيادة حجم الخلية والشيخوخة 10,11 ، وهذا النقاء مناسب لتحليل كل من الصيغة الصبغية للخلايا الكبدية 12 وآليات النسخ المعتمدة على حجم الخلية11,13,14,15 . بالإضافة إلى ذلك ، تحتفظ النوى المعزولة من الكبد المجمد بمعلومات قيمة حول تقسيم الكبد. يسمح سير العمل وجمع الأنسجة بالتحقق من صحة بيانات الجينوم أحادية الخلية أو المزيد من التحليلات التكميلية ، مثل الكيمياء المناعية أو النسخ المكاني من نفس النسيج ونفس الفرد. لذلك ، يمكن تطبيق هذا النهج على حالات أمراض الكبد المتعددة والكائنات الحية النموذجية بشكل منهجي وموثوق.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20 - 5 mL</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive PCR film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Sorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000619</td>
			<td>Use chilled at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Kit v3.1, 4 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) 1 M solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td>Make 1 mM stock solution and use at 1 &#181;M final concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA AWAY Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10223471</td>
			<td>Wipe surfaces and pipettes before start of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16628742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16638742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (EB) - 250 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13527550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13518470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade - 100 mL&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10517694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters 50 &#181;m, sterile&#160;&#160;</td>
			<td>SYSMEX PARTEC - CELLTRICS</td>
			<td>04-004-2327</td>
			<td>Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) - 1 L</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP3905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herenz Heinz ABS Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen TE Buffer - 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11568846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2 M), RNase-free, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M), 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10209104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10733087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#246;rser 2 mL DOUNCE</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH</td>
			<td>9651632</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td>Or any other strip and tube mini centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Hemocytometer</td>
			<td>OMNILAB&#160; LABORZENTRUM</td>
			<td>5435293</td>
			<td>Visualize and count nuclei under microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips RT LTS 1000 &#181;L, Wide-O</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30389218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pistill &#34;A&#34; 2 mL</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH&#160;</td>
			<td>9651621</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pistill &#34;B&#34; 2 mL</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH</td>
			<td>9651627</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10579691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10634141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10100151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector RNase inhibitor - 2,000 U</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3335399001</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-based RNase Inhibitor SUPERase&#8226;In (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Clontech Takara</td>
			<td>2313B</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free microfuge tubes - 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Wipe surfaces and pipettes before start of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIselect - 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318</td>
			<td>Aliquot and store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, 500 g</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td>Make a 1 M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11798343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI (1M), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10671652</td>
			<td>Make 10% stock solution. Keep at 4 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11538886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex- Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-1372</td>
			<td>Or any other type of vortex</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of nuclei from flash-frozen liver tissue for single-cell multiomics

الكبد هو نسيج معقد وغير متجانس مسؤول عن تنفيذ العديد من الوظائف الفسيولوجية الحرجة ، مثل الحفاظ على توازن الطاقة واستقلاب xenobiotics ، من بين أمور أخرى. يتم تنفيذ هذه المهام من خلال التنسيق الوثيق بين الخلايا المتنية الكبدية وغير المتنية. بالإضافة إلى ذلك ، تقتصر الأنشطة الأيضية المختلفة على مناطق محددة من الفصيص الكبدي - وهي ظاهرة تسمى تقسيم الكبد. مكنت التطورات الحديثة في تقنيات تسلسل الخلية الواحدة الباحثين من التحقيق في عدم تجانس الأنسجة بدقة خلية واحدة. في العديد من الأنسجة المعقدة ، بما في ذلك الكبد ، يمكن أن تؤثر بروتوكولات التفكك الأنزيمية و / أو الميكانيكية القاسية سلبا على صلاحية أو جودة المعلقات أحادية الخلية اللازمة لتوصيف هذا العضو بشكل شامل في الصحة والمرض.
تصف هذه الورقة بروتوكولا قويا وقابلا للتكرار لعزل النوى عن أنسجة الكبد المجمدة والمؤرشفة. تنتج هذه الطريقة نوى عالية الجودة متوافقة مع مناهج أوميكس أحادية الخلية ، بما في ذلك RNA-seq أحادي النواة ، مقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية (ATAC-seq) ، بالإضافة إلى omics متعدد الوسائط (RNA-seq المشترك و ATAC-seq). تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لعزل النوى من عينات الكبد المجمدة السليمة والمريضة من البشر والفئران والرئيسيات غير البشرية. يسمح هذا النهج بالعزل غير المتحيز لجميع أنواع الخلايا الرئيسية في الكبد ، وبالتالي ، يقدم منهجية قوية لدراسة الكبد بدقة خلية واحدة.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics at JoVE.com

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل النوى من أنسجة الكبد المجمدة والمؤرشفة ل RNA-seq أحادي النواة و ATAC-seq و multiomics المشتركة (RNA-seq و ATAC-seq).

عزل النوى من أنسجة الكبد المجمدة بالفلاش من أجل Multiomics أحادية الخلية

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

تم استخدام هذا البروتوكول السهل والقابل للتكرار بنجاح لعزل النوى عالية الجودة من كبد نموذج الفئران السليم والمريض ، وكذلك الكبد من الرئيسيات البشرية وغير البشرية. لا تتطلب هذه الطريقة سوى كمية صغيرة من مواد الأنسجة المجمدة. أيضا ، يعطي تحفيز درجة الكثافة تعليقا نوويا نظيفا للغاية مع الحفاظ على جميع أنواع الخلايا الرئيسية في الكبد في الإعداد النووي النهائي.يمكن استخدام طريقة استخراج النوى هذه في عينات الكبد البشري المؤرشفة بيولوجيا المخزنة في البنوك الحيوية. ابدأ تجانس الأنسجة عن طريق قطع قطعة مكعب 2230 ملليغرام أو خمسة ملليمترات من أنسجة الكبد الموضوعة في طبق بتري على الثلج الجاف باستخدام مشرط مبرد مسبقا. انقل طبق بتري على الفور إلى الثلج الرطب وأضف ملليلتر واحد من محلول التجانس.باستخدام المشرط البارد ، فرم الأنسجة قدر الإمكان ، مما يسمح لها بالشفط بطرف فتحة عريض ملليلتر. اجمع تعليق الأنسجة وانقله إلى خالط زجاجي مبرد مسبقا سعة 2 ملليلتر. اغسل طبق بتري ب 0.521 ملليلتر إضافي من محلول التجانس واجمع كل قطع الأنسجة المتبقية مع الحفاظ على كل شيء على الجليد.ببطء وبعناية أداء خمس ضربات مع مدقة فضفاضة A على الجليد دون خلق فقاعات. تأكد من أن المدقة تتحرك بعناية من أعلى إلى أسفل الخالط مع كل ضربة. بعد ذلك ، قم بإجراء 10 إلى 15 ضربة بطيئة مع مدقة ضيقة B على الجليد دون إنشاء فقاعات.بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتصفية التجانس من خلال مصفاة خلية 50 ميكرومتر أثناء نقلها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر مبرد مسبقا. استخدم أكثر من مرشح أو أنبوب للتجانس الذي يحتوي على كمية عالية من كتل النسيج الضام. اشطف الخالط والمرشحات ب 0.521 ملليلتر إضافي من مخزن التجانس المؤقت لجمع جميع تجانسات الأنسجة تماما قبل الطرد المركزي المتدرج الكثافة.بالنسبة لأجهزة الطرد المركزي المتدرجة الكثافة ، قم بالطرد المركزي للتجانس المصفى في جهاز طرد مركزي ثابت الزاوية مبرد مسبقا عند 1000 جم لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية. أثناء الحصول على الطرد المركزي للعينة ، قم بإعداد أنبوب سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 250 ميكرولتر من تخفيف اليوديكسانول بنسبة 50٪ وأنبوب واحد سعة 2 ملليلتر يحتوي على 500 ميكرولتر من تخفيف اليوديكسانول بنسبة 29٪. ضع كلا الأنبوبين على الثلج.ثم من تعليق جهاز الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات باستخدام مضخة تفريغ. أعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من محلول التجانس باستخدام طرف ماصة فتحة عريضة ملليلتر. ثم انقل 250 ميكرولترا من معلق النوى إلى أنبوب مبرد مسبقا سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 250 ميكرولتر من 50٪ يوديكسانول واخلطه برفق ودقة لتوليد تعليق نوى يوديكسانول بنسبة 25٪.بعد ذلك ، انقل 500 ميكرولتر من معلق نوى اليوديكسانول بنسبة 25٪ إلى أنبوب مليلتر أنبوبي مبرد مسبقا يحتوي على 500 ميكرولتر من تخفيف اليوديكسانول بنسبة 29٪. قم بالطرد المركزي للأنبوب في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح مبرد مسبقا عند 12،500 G لمدة 20 دقيقة ، مع ضبط الفاصل على إيقاف التشغيل. قبل اكتمال خطوة الطرد المركزي مباشرة ، أضف مثبطات الحمض النووي الريبي إلى مخزن تخزين النوى ، أو NSB أثناء المتابعة إلى خطوط أنابيب تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة.بعد الانتهاء من الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات باستخدام مضخة تفريغ. أعد تعليق الحبيبات برفق في 100 إلى 300 ميكرولتر من NSB باستخدام طرف ماصة بفتحة عريضة ملليلتر واحد وانقل تعليق النوى إلى أنبوب نظيف مبرد مسبقا سعة 1.5 ملليلتر. عد النوى باستخدام محلول تريبان الأزرق مع مقياس الدم اليدوي واستخدم على الفور تعليق النوى الذي تم الحصول عليه لفحص جينوم النواة المفردة.لفرز الخلايا القائمة على قياس التدفق الخلوي ، قم بتصفية تعليق النوى من خلال مرشح 50 ميكرومتر في فرز الخلايا المنشط بالفلورة المنشطة المبردة مسبقا أو أنبوب فاكس. استخدم فارز قياس التدفق الخلوي المزود بفوهة 100 ميكرومتر وقم بتحميل أنبوب الفاكس على فارز قبل معاينة العينة. قم بإعداد استراتيجية البوابة لفرز النوى ، بدءا من بوابة مبعثرة عن طريق رسم منطقة التشتت الأمامية مقابل منطقة التشتت الجانبية ، متبوعة بالارتفاع المخادع مقابل المنطقة المخادعة ، ثم العرض المخادع مقابل المنطقة المخادعة.تصور ملف تعريف النوى الصيغة الصبغية على الرسم البياني للمنطقة المخادعة. للفرز إلى 96 أو 384 لوحة بئر ، اضبط تأخير القطرة وقم بتحسين محاذاة اللوحة باستخدام طريقة قياس الألوان. اضبط تبريد العينة وحامل اللوحة على أربع درجات مئوية مع تشغيل دوران العينة عند 300 دورة في الدقيقة.قم بفرز النوى المفردة عند تركيز عينة يبلغ حوالي واحد في 10 إلى النوى الخامسة لكل ملليلتر بمعدل تدفق يتراوح من 200 إلى 500 حدث في الثانية. أظهر الفحص المجهري للنوى المستخرجة من الكبد المتجمد أن خطوة الطرد المركزي المتدرج الكثافة سهلت إلى حد كبير إزالة الحطام الخلوي والأنسجة غير المرغوب فيه. حافظت هذه المنهجية على جميع مستويات الصيغة الصبغية ، والتي تم التحقق من صحتها وقياسها كميا من خلال التحليل الخلوي.لوحظت مقاييس عالية الجودة من البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام استخراج النوى. يمثل التقريب والإسقاط المتشعب الموحد عدد الأعداد عبر جميع النوى وأنواع الخلايا الرئيسية ، والتي لا يمكن تحديدها بثقة إلا من خلال النسخ النووي والتسلسل الضحل نسبيا. سمح هذا النهج بالتحقيق في عوامل النسخ الخاصة بالكبد والجينات المستهدفة النهائية المشاركة في عملية التمثيل الغذائي للأجانب الحيوية.أظهر النمط التكميلي للجينات المميزة مثل CYP2E1 المركزي و CYP2F2 المحيطة أن النوى المستخرجة احتفظت بمعلومات مهمة حول التبرع بالكبد. تم تسلسل مكتبة التعبير الجيني للحمض النووي الريبي إلى عمق 44،600 قراءة لكل نواة ومكتبة ATAC إلى عمق 43،500 قراءة لكل نواة. سمح تحليل أقرب جار مرجح تم إجراؤه لقياسات متعددة لكلتا الطريقتين ، RNA بالإضافة إلى ATAC ، باستخدام حزم Seurat و Signac بتحديد أنواع خلايا الكبد الرئيسية والثانوية والتعليق عليها دون تحيزات بارزة بسبب حجم الخلية أو الهشاشة النووية.كما تم الكشف عن منظمات النسخ المنبع والجينات المميزة للتبرع بالكبد في هذه الطريقة. من المهم تجنب إنشاء الكثير من الفقاعات أثناء تجانس الأسفل عند تحريك المدقات لأعلى ولأسفل ، والالتزام بعدد السكتات الدماغية المشار إليها في البروتوكول.

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

عزل النواة من الخلايا العصبية البشرية تشريح أنسجة المخ

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

جيل وحيدة الخلية معلقات من الأنسجة العصبية ماوس

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

عزل القائم على تقارب من معلم النواة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة لتحليل التعبير الجيني

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

عزل النوى عن الأنسجة الكاملة باستخدام المنظفات وطريقة خالية من الانزيم

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

استخراج الكروماتين من أنسجة الكبد الخيمرية المجمدة لتحليل الترسيب المناعي للكروماتين

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

عزل النوى من كلية الفأر البالغة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

عزل وتوصيف وتطبيق علاجي للحويصلات خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية المستزرعة

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

تحضير معلق أحادي الخلية من أمعاء البلطي النيلي لتسلسل الخلية الواحدة

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

عزل وتحليل النسخ لأنواع الخلايا النباتية

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...