Name: isolation of nuclei from flash-frozen liver tissue for single-cell multiomics
Uploaded: 2022-12-09T14:40:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Helmholtz Pioneer Campus (MS, KY, CPM-J.) og Institute of Computational Biology (C. T.-L.). Denne forskning blev også støttet af AMED under tilskudsnummer JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). Vi takker Core Genomics på HMGU (I. de la Rosa) og Bioinformatics (T. Walzthoeni) støtte, især Xavier Pastor for uddannelse og vejledning. Vi takker A. Feuchtinger, U. Buchholz, J. Bushe og alle andre medarbejdere fra HMGU Pathology and Tissue Analytic core facility for deres tekniske og videnskabelige støtte samt J. Zorn, R. Erdelen, D. Würzinger, medarbejdere i E-Streifen samt Laboratory Animal Services kernefacilitet for deres løbende videnskabelige støtte og diskussion. Vi er taknemmelige for Core Facility Cell Analysis hos TranslaTUM (R. Mishra) og Luminex, A DiaSorin Company (P. Rein). Vi takker Dr. I Deligiannis for hans tekniske support. Dr. M. Hartman, Dr. A. Schröder og Ms. A. Barden (Helmholtz Pioneer Campus) var grundlæggende for deres juridiske, ledelsesmæssige og administrative støtte.

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med den tyske dyrevelfærdslovgivning og reglerne fra regeringen i Oberbayern. Opstaldning af dyr blev godkendt i henhold til §11 i den tyske dyrevelfærdslov og udført i overensstemmelse med direktiv 2010/63/EU.
1. Vævspræparation
<ol><li>Ofr en 3 måneder gammel til 22 måneder gammel C57BL/6J hanmus ved cervikal forskydning. Læg dyret på et dissekeringsbræt, fastgør ekstremiteterne med stifter og desinficer maven med 70% ethanol.</li>
	<li>Udfør obduktion som anbefalet af Treuting et al.16.<ol><li>Åbn maven op til brystkassen, visualiser leveren, og brug tang til forsigtigt at fjerne leveren uden at gennembore lobulerne.</li>
		<li>Ekstraher den intakte lever ved at holde membranen med tang og fjerne forbindelsesvævet med en saks.</li>
	</ol></li>
	<li>Vask organet i koldt fosfatbufferet saltvand (PBS), dup det tørt på et rent papirhåndklæde, og skær leverlobulerne i flere stykker til forskellige formål: FF til enkeltkerneisolering og multiomics; paraformaldehydfikseret (10% PFA) til indlejring af paraffin; og/eller indlejret i optimal skæretemperaturforbindelse (OCT) til yderligere histologiske analyser (figur 1A).</li>
	<li>Aliquot leverstykkerne i cryovials eller 5 ml skruelågsrør, og straks flash-frys i flydende nitrogen. De frosne leverprøver opbevares ved -80 °C til downstream enkeltkernemultiomics-eksperimenter (figur 1B, C). BEMÆRK: Det kryopræserverede væv kan opbevares sikkert ved -80 °C i flere år og skal altid transporteres på tøris ved -80 °C inden brug.</li>
</ol>2. Isolering af kerner
<ol><li>Rengøring på bordpladen og klargøring af buffere og hjælpematerialer<ol><li>Rengør arbejdsbordplader og pipetter med 70 % ethanol og RNase-dekontamineringsopløsning, eller brug dedikerede RNase-frie bordplader og materialer.</li>
		<li>Prechill både svingskovlen og centrifuger med fast vinkel, 1,5 ml / 2 ml rør og multibrøndplader til 4 ° C, som beskrevet nedenfor.</li>
		<li>Prechill de RNase-fri engangspincetter, der bruges til vævshåndtering, en steril engangsskalpel og en petriskål på tøris (-60 °C).</li>
		<li>Prechill Dounce glas homogenisator og støder på is (4 ° C). Placer hver pistil (A og B) i et 5 ml rør for at undgå direkte kontakt med isen og potentiel RNase-forurening.</li>
		<li>Der fremstilles en fortyndingsopløsning af iodixanolsubstratet (IDM) (tabel 1A), og den anvendes til at fortynde 50 % og 29 % af 60 % iodixanolstamdensitetsgradientmediet (henholdsvis tabel 1B og tabel 1C).</li>
		<li>Prechill alle rørene. For hver prøve, der skal behandles, skal du forberede følgende rør:<ol><li>Der fremstilles tre 1,5 ml lav-DNA-bindingsrør (et til det filtrerede vævshomogenat, et andet indeholdende 250 μL af en 50% fortynding af iodixanolopløsning og et tredje til den rene kernesuspension).</li>
			<li>Der fremstilles et 2 ml rundbundet rør indeholdende 500 μL af en 29% fortynding af iodixanolopløsning til densitetsgradientseparationen.</li>
			<li>Forbered et 15 ml konisk rør til kerneisoleringsmedium-2 (NIM-2) og homogeniseringsbuffer (HB).</li>
		</ol></li>
		<li>Forbered kerneisoleringsmedium-1 (NIM-1) (tabel 1D), og brug det til at fremstille NIM-2 (tabel 1E) og efterfølgende HB (tabel 1F). Tilsæt begge RNAse-hæmmere lige før brug, som beskrevet nedenfor i protokollen.</li>
		<li>Kernelagerbufferen (NSB) forberedes som beskrevet i tabel 1G. Tilsæt rekombinant RNAse-hæmmer lige før brug. Tilsæt proteinbaseret RNAse-hæmmer i NSB før brug til FACS-sortering (valgfrit).</li>
		<li>Forbered et 500 ml bægerglas med sterilt vand for at suge Dounce-homogenisatorerne og pistlerne efter vævshomogeniseringen for optimal rengøring og vedligeholdelse af homogenisatorerne.</li>
	</ol></li>
	<li>Væv homogenisering<ol><li>Skær et 20-30 mg (eller 5 mm3) vævsstykke med en forkølet skalpel inde i petriskålen på tøris. Overfør derefter straks petriskålen til våd is (4 °C). Tilsæt 1 ml HB, og brug den kolde skalpel, hak vævet så meget som muligt, så det let kan aspireres med en 1 ml bred åbningsspids. BEMÆRK: Brug altid brede åbningsspidser til alle vævs- / kerneoverførsler. Som et alternativ kan 1 ml spidser skæres med en steril skalpel på et sterilt plastdæksel for at generere brede åbninger (figur 2A).</li>
		<li>Vævssuspensionen opsamles, og overfør den til en forkølet 2 ml glas Dounce homogenisator (figur 2B).</li>
		<li>Vask petriskålen med yderligere 0,5-1 ml HB, og saml alle de resterende vævsstykker, mens du holder alt på is.</li>
		<li>Lav langsomt og forsigtigt fem slag med løs støder A på is. Undgå at skabe bobler ved at bruge vridende bevægelser af pistlen, når du trækker den op og ned. Sørg for, at pistlen bevæger sig forsigtigt fra toppen til bunden af homogenisatoren med hvert slag.</li>
		<li>Udfør derefter 10-15 langsomme slag med tæt pistle B på is. Undgå at skabe bobler. BEMÆRK: Det anbefales at visuelt inspicere kernerne under mikroskopet efter 10 slag med pistil B for at fastslå, om der er behov for flere slagtilfælde. Gør dette ved at bruge trypanblå farvning (1: 1 forhold mellem trypan og prøve) og et manuelt hæmocytometer (f.eks. Bland 10 μL trypanblå med 10 μL kernesuspension, og brug 10 μL af blandingen til undersøgelse under mikroskopet; Figur 2C).</li>
		<li>Filtrer homogenatet gennem en 50 μm cellesi, mens det overføres til et forkølet 1,5 ml rør. Brug mere end ét filter og/eller rør til homogenater, der indeholder en stor mængde bindevævsklumper.</li>
		<li>Skyl homogenisatoren og de anvendte filtre med yderligere 0,5-1 ml HB for grundigt at opsamle alt vævshomogenat. Fortsæt til densitetsgradientcentrifugeringen.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugering af densitetsgradient<ol><li>Den filtrerede homogenat centrifugeres i en forkølet, fastvinklet centrifuge ved 1.000 × g i 8 minutter ved 4 °C.</li>
		<li>Mens prøven spinder, fremstilles et 1,5 ml rør indeholdende 250 μL 50% iodixanolfortynding og et 2 ml rør indeholdende 500 μL 29% iodixanolfortynding. Opbevar begge rør på is.</li>
		<li>Efter centrifugering opsuges supernatanten uden at forstyrre pelleten ved hjælp af en vakuumpumpe. BEMÆRK: Brug af manuel pipettering vil kompromittere kvaliteten af den endelige kernesuspension.</li>
		<li>Der tilsættes 250 μL HB til pelleten ved hjælp af 1 ml pipettespids med bredåbning, og resuspenderer meget langsomt.</li>
		<li>250 μL af kernesuspensionen overføres til et forkølet 1,5 ml rør indeholdende 250 μL 50% iodixanolfortynding, og blandes forsigtigt, men grundigt for at generere en 25% iodixanol/kernesuspension.</li>
		<li>500 μL af 25% iodixanol/kernesuspensionen overføres til et forkølet 2 ml rør indeholdende 500 μL 29% iodixanolfortynding. BEMÆRK: 500 μL af 25% iodixanol/kernesuspensionen skal deponeres forsigtigt oven på 500 μL 29% iodixanolopløsning, således at 25%/29% iodixanolblandingerne viser klar faseadskillelse. Brug siden af rørvæggen med pipettespidsen placeret i en vinkel på 45° for at skabe denne gradientgrænseflade. Fra da af skal røret håndteres forsigtigt for ikke at forstyrre denne gradient.</li>
		<li>Centrifuge røret i en forkølet svingende skovlcentrifuge ved 12.500 g i 20 minutter med bremsen indstillet til OFF.</li>
		<li>Lige før centrifugeringstrinnet er afsluttet, tilsættes RNAse-hæmmerne til NSB-bufferen, når man fortsætter til scRNA-seq-rørledningerne (se tabel 1G).</li>
		<li>Efter centrifugering opsuges supernatanten uden at forstyrre pelleten ved hjælp af en vakuumpumpe. BEMÆRK: Brug af manuel pipettering vil kompromittere kvaliteten af den endelige kernesuspension.</li>
		<li>Brug 1 ml bredåbningspipettespids til forsigtigt at suspendere pelleten i 100-300 μL NSB, og overfør kernesuspensionen til et rent, forkølet 1,5 ml rør.</li>
		<li>Kernerne tælles ved hjælp af trypanblå opløsning (1: 1 forhold mellem trypan og prøve) og et manuelt hæmocytometer (f.eks. Bland 10 μL trypanblå med 10 μL kernesuspension, og brug 10 μL af blandingen til tælling; Figur 2D).</li>
		<li>Brug straks den opnåede kernesuspension til enkeltkernegenomanalysen. BEMÆRK: Kernesuspensionen i NSB kan opbevares nedkølet ved 4 °C i op til 1 uge til yderligere analyse ved flow og/eller billeddannelsesflowcytometri, men ikke til snRNA-seq eller snATAC-seq.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Nuclei sortering for hepatocyt ploidy profilering eller velbaserede sekventeringsmetoder
<ol><li>Til flowcytometribaseret cellesortering filtreres kernesuspensionen gennem et 50 μm filter i et forkølet 5 ml FACS-rør.</li>
	<li>Brug en flowcytometrisorterer udstyret med en 100 μm dyse. Læg FACS-røret på sorteringsmaskinen, og få vist prøven.</li>
	<li>Opsæt gating-strategien for kernesorteringen, startende med en scatter-port ved at plotte det fremadrettede spredningsområde versus sidespredningsområdet (FSC-A/SSC-A), EFTERFULGT AF Hoechst-Height versus Hoechst-Area (nuclei gate) og derefter Hoechst-Width versus Hoechst-Area (singlets gate). Visualiser kernens ploidi-profil på Hoechst-Area histogrammet. BEMÆRK: For bedre topopløsning skal du visualisere Hoechst-kanalen (450/50) på den lineære skala (figur 3A).</li>
	<li>Til sortering i 96-/384-brøndplader indstilles dråbeforsinkelsen, og pladens justering optimeres ved hjælp af den kolorimetriske metode med benzidinsubstrat-peberrodsperoxidase (TMB-HRP), som beskrevet tidligere6.</li>
	<li>Både prøvekølingen og pladeholderen indstilles til at køle ved 4 °C, og prøverotationen er slået til ved 300 omdr./min.</li>
	<li>Sorter de enkelte kerner ved en prøvekoncentration på ~ 1 x 105 kerner / ml og med strømningshastigheden ved 200-500 begivenheder / s.</li>
</ol>4. Visuel inspektion og kvantificering af nukleare parametre ved billeddannelsescytometri (valgfrit)
<ol><li>Der indlæses et 0,5 ml rør indeholdende 50 μL kernesuspension i en koncentration på 2 × 107 kerner/ml.</li>
	<li>Opsæt en port til alle begivenheder baseret på billedformatet versus Hoechst-fluorescenskanalen for at visualisere kernens ploidi-profil (figur 3B).</li>
	<li>Anskaf prøven ved en 40x forstørrelse ved hjælp af brightfield (BF) og Hoechst fluorescenskanalen.</li>
	<li>Undersøg og kvantificer 2n- og 4n-kerner ved hjælp af brightfield-måling og Hoechst-fluorescensintensitet med billeddannelsescytometrisoftware (figur 3C).</li>
</ol>5. Enkeltkerne RNA-seq, ATAC-seq eller multiom bibliotekskonstruktion og sekventering
<ol><li>For dråbebaserede snRNA-seq-tilgange skal du indlæse den oprensede kernesuspension direkte i den mikrofluidiske enhed til automatiseret parallel partitionering og molekylær stregkodning17.</li>
	<li>Når den mikrofluidiske kørsel er afsluttet i enkeltcellepartitioneringsenheden, skal du indsamle de gelperleindkapslede kerner, inkubere og rengøre som beskrevet tidligere i producentens retningslinjer17.</li>
	<li>Udfør 11 polymerasekædereaktionscyklusser (PCR) for cDNA-forforstærkeren ved hjælp af følgende program: 3 min ved 98 °C, (15 s ved 98 °C, 20 s ved 63 °C og 1 min ved 72 °C) x 11, 1 min ved 72 °C, og hold ved 4 °C. Fortsæt med en slutreparation og A-tailing trin og adapterligering, som angivet af producenten17. Til den efterfølgende endelige konstruktion af genekspressionsbibliotek skal du udføre 10 PCR-cyklusser ved hjælp af følgende program: 45 s ved 98 °C, (20 s ved 98 °C, 30 s ved 54 °C, 20 s ved 72 °C) x 10, 1 min ved 72 °C og hold ved 4 °C.</li>
	<li>Sekvenser de opnåede biblioteker til en læsedybde på ~ 20.000-50.000 gennemsnitlige læsninger pr. Kerne.</li>
	<li>For den fælles multiomics (RNA + ATAC) dråbebaserede sekventering inkuberes leverkernerne i lysisbuffer i 5 min, og derefter mærkes dem i 1 time, som beskrevet tidligere18.</li>
	<li>Indlæs de mærkede kerner direkte i en mikrofluidisk enhed til automatiseret parallel partitionering og molekylær stregkodning.</li>
	<li>Når den mikrofluidiske kørsel er afsluttet, samles de gelperleindkapslede kerner, inkuberes og rengøres som beskrevet af producenten18.</li>
	<li>Udfør seks PCR-cyklusser for cDNA-foramplifikationstrinnet ved hjælp af følgende program: 5 min ved 72 °C, 3 min ved 98 °C, (20 s ved 98 °C, 30 s ved 63 °C, 1 min ved 72 °C) x 6, 1 min ved 72 °C, og hold ved 4 °C.</li>
	<li>Tag 35 μL af den forforstærkede prøve, og udfør en cDNA-amplifikation som følger: 3 min ved 98 °C, (15 s ved 98 °C, 20 s ved 63 °C, 1 min ved 72 °C) x 6, 1 min ved 72 °C, og hold ved 4 °C. Fortsæt med slutreparation og A-tailing trin og adapter ligering, som angivet af producenten18 . For den efterfølgende endelige prøveindeksering af PCR udføres 15 PCR-cyklusser som følger: 45 s ved 98 °C, (20 s ved 98 °C, 30 s ved 54 °C, 20 s ved 72 °C) x 15, 1 min ved 72 °C og hold ved 4 °C.</li>
	<li>Til konstruktion af ATAC-biblioteker skal du bruge 40 μL og forstærke i seks PCR-cyklusser til prøveindeksering ved hjælp af følgende program: 45 s ved 98 ° C, (20 s ved 98 ° C, 30 s ved 67 ° C, 20 s ved 72 ° C) x 6, 1 min ved 72 ° C og hold ved 4 ° C.</li>
	<li>Sekvenser de opnåede multiomgenekspressionsbiblioteker til en mindste læsedybde på 20.000 læsepar pr. kerne og multiome ATAC-biblioteker til en mindste læsedybde på 25.000 læsepar pr. celle, som anbefalet af producenten18.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kamies, R., Martinez-Jimenez, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+of+single-cell+genomics+and+epigenomics+in+human+disease:+where+are+we+now.">Advances of single-cell genomics and epigenomics in human disease: where are we now.</a> Mamm Genome. 31 (5-6), 170-180 (2020).</li><li>Ramachandran, P., Matchett, K. P., Dobie, R., Wilson-Kanamori, J. R., Henderson, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+in+hepatology:+New+insights+into+liver+biology+and+disease+pathogenesis.">Single-cell technologies in hepatology: New insights into liver biology and disease pathogenesis.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 17 (8), 457-472 (2020).</li><li>Ramachandran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+fibrotic+niche+of+human+liver+cirrhosis+at+single-cell+level.">Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level.</a> Nature. 575 (7783), 512-518 (2019).</li><li>Andrews, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+single-nucleus,+and+spatial+RNA+sequencing+of+the+human+liver+identifies+cholangiocyte+and+mesenchymal+heterogeneity.">Single-cell, single-nucleus, and spatial RNA sequencing of the human liver identifies cholangiocyte and mesenchymal heterogeneity.</a> Hepatology Communications. 6 (4), 821-840 (2022).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+intercellular+crosstalk+in+healthy+and+NASH+liver+revealed+by+single-cell+secretome+gene+analysis.">Landscape of intercellular crosstalk in healthy and NASH liver revealed by single-cell secretome gene analysis.</a> Molecular Cell. 75 (3), 644-660 (2019).</li><li>Richter, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+RNA-seq2+reveals+functional+crosstalk+between+liver+zonation+and+ploidy.">Single-nucleus RNA-seq2 reveals functional crosstalk between liver zonation and ploidy.</a> Nature Communications. 12 (1), 4264 (2021).</li><li>Matsumoto, T., Wakefield, L., Tarlow, B. D., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+lineage+tracing+of+polyploid+hepatocytes+reveals+extensive+proliferation+during+liver+regeneration.">In vivo lineage tracing of polyploid hepatocytes reveals extensive proliferation during liver regeneration.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 34-47 (2020).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+distribution+of+hepatocyte+proliferation+in+liver+homeostasis+and+regeneration.">Broad distribution of hepatocyte proliferation in liver homeostasis and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 27-33 (2020).</li><li>Donne, R., Saroul-Ainama, M., Cordier, P., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+in+liver+development,+homeostasis+and+disease.">Polyploidy in liver development, homeostasis and disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 17 (7), 391-405 (2020).</li><li>Lengefeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+is+a+determinant+of+stem+cell+potential+during+aging.">Cell size is a determinant of stem cell potential during aging.</a> Science Advances. 7 (46), 0271 (2021).</li><li>Lanz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+size+remodels+the+proteome+and+promotes+senescence.">Increasing cell size remodels the proteome and promotes senescence.</a> Mol Cell. 82 (17), 3255-3269 (2022).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIDDosome-SCAP+crosstalk+controls+high-fructose-diet-dependent+transition+from+simple+steatosis+to+steatohepatitis.">PIDDosome-SCAP crosstalk controls high-fructose-diet-dependent transition from simple steatosis to steatohepatitis.</a> Cell Metabolism. 34 (10), 1548-1560 (2022).</li><li>Padovan-Merhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+mammalian+cells+compensate+for+differences+in+cellular+volume+and+DNA+copy+number+through+independent+global+transcriptional+mechanisms.">Single mammalian cells compensate for differences in cellular volume and DNA copy number through independent global transcriptional mechanisms.</a> Molecular Cell. 58 (2), 339-352 (2015).</li><li>Miettinen, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+transcriptional+and+metabolic+programs+related+to+mammalian+cell+size.">Identification of transcriptional and metabolic programs related to mammalian cell size.</a> Current Biology. 24 (6), 598-608 (2014).</li><li>Vargas-Garcia, C. A., Ghusinga, K. R., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+control+and+gene+expression+homeostasis+in+single-cells.">Cell size control and gene expression homeostasis in single-cells.</a> Current Opinion in Systems Biology. 8, 109-116 (2018).</li><li>Knoblaugh, S. E., Randolph-Habecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Necropsy and histology. In Comparative Anatomy and Histology: A Mouse, Rat, and Human Atlas (Second Edition). , (2018).</li><li>Chromium Next GEM Single Cell 3 Reagent Kits v3.1 User Guide. Document number CG000204 (Rev D). 10x Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2019)</li><li>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide. Document number CG000338 (Rev D). 10x Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide</a> (2021)</li><li>MacParland, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+of+human+liver+reveals+distinct+intrahepatic+macrophage+populations.">Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations.</a> Nature Communications. 9 (1), 4383 (2018).</li><li>Martinez-Jimenez, C. P., Kyrmizi, I., Cardot, P., Gonzalez, F. J., Talianidis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+4alpha+coordinates+a+transcription+factor+network+regulating+hepatic+fatty+acid+metabolism.">Hepatocyte nuclear factor 4alpha coordinates a transcription factor network regulating hepatic fatty acid metabolism.</a> Molecular and Cell Biology. 30 (3), 565-577 (2010).</li><li>Schmidt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-vertebrate+ChIP-seq+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+transcription+factor+binding.">Five-vertebrate ChIP-seq reveals the evolutionary dynamics of transcription factor binding.</a> Science. 328 (5981), 1036-1040 (2010).</li><li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data.">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Madad, S., Lareau, C. A., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+state+analysis+with+Signac.">Single-cell chromatin state analysis with Signac.</a> Nature Methods. 18 (11), 1333-1341 (2021).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+organoids+can+repair+bile+ducts+after+transplantation+in+the+human+liver.">Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver.</a> Science. 371 (6531), 839-846 (2021).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+as+a+tool+for+studying+toxicity+and+drug+metabolism.">Human hepatocytes as a tool for studying toxicity and drug metabolism.</a> Current Drug Metabolism. 4 (4), 292-312 (2003).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+in+primary+culture:+The+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man.">Human hepatocytes in primary culture: The choice to investigate drug metabolism in man.</a> Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).</li><li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows.">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).</li><li>Nault, R., Fader, K. A., Bhattacharya, S., Zacharewski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nuclei+RNA+sequencing+assessment+of+the+hepatic+effects+of+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.">Single-nuclei RNA sequencing assessment of the hepatic effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (1), 147-159 (2021).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+as+a+mechanism+for+stress-induced+liver+adaptation.">Aneuploidy as a mechanism for stress-induced liver adaptation.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (9), 3307-3315 (2012).</li><li>Kreutz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+ploidy+is+a+diversity+factor+for+liver+homeostasis.">Hepatocyte ploidy is a diversity factor for liver homeostasis.</a> Frontiers in Physiology. 8, 862 (2017).</li><li>Hunt, N. J., Kang, S. W. S., Lockwood, G. P., Le Couteur, D. G., Cogger, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+aging+in+the+liver.">Hallmarks of aging in the liver.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 1151-1161 (2019).</li><li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+spectrum:+a+new+marker+in+HCC+classification.">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. 69 (2), 355-364 (2019).</li><li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li><li>Schwartz-Arad, D., Zajicek, G., Bartfeld, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+streaming+liver+IV:+DNA+content+of+the+hepatocyte+increases+with+its+age.">The streaming liver IV: DNA content of the hepatocyte increases with its age.</a> Liver. 9 (2), 93-99 (1989).</li><li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (6), 387-393 (1993).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Granja, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArchR+is+a+scalable+software+package+for+integrative+single-cell+chromatin+accessibility+analysis.">ArchR is a scalable software package for integrative single-cell chromatin accessibility analysis.</a> Nature Genetics. 53 (3), 403-411 (2021).</li><li>Bredikhin, D., Kats, I., Stegle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUON:+Multimodal+omics+analysis+framework.">MUON: Multimodal omics analysis framework.</a> Genome Biology. 23 (1), 42 (2022).</li><li>Velten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+temporal+and+spatial+patterns+of+variation+from+multimodal+data+using+MEFISTO.">Identifying temporal and spatial patterns of variation from multimodal data using MEFISTO.</a> Nature Methods. 19 (2), 179-186 (2022).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Dissekering af leverens cellulære sammensætning af enkeltcelle eller enkeltkerne RNA-seq giver en dybere forståelse af udvikling og progression af leversygdom 3,4,5,24. Enkeltcelleisolering fra lever er tidskrævende og kræver protokoller, der involverer hård mekanisk eller enzymatisk dissociation25,26,27. Det er almindeligt accepteret, at hvert væv kræver en systematisk evaluering for at bestemme den optimale vævsdissociationsprotokol samt en passende opbevaringsmetode til at fange skrøbelige celletyper eller kerner28. Afhængigt af vævets tilgængelighed, sygdom af interesse, udviklingsstadium eller modelorganisme kan fremstilling af en enkeltkernesuspension til downstream-behandling være en mere egnet metode end anvendelse af enkeltcellesuspensioner. Det er vigtigt, at scRNA-seq og snRNA-seq i leveren har vist en høj korrelation mellem nukleart og cytoplasmatisk mRNA, hvilket tyder på, at begge tilgange præsenterer komplementær information 2,3,4,6,29.
Dette papir giver en standardiseret, robust og reproducerbar enkeltkerneisolering fra frosne, arkiverede leverprøver fra mus og andre arter, herunder mennesker og makaker. Denne metode kan bruges til vildtypemus fodret med chow og en fedtfattig diæt (HFD) og til musemodeller af leverfibrose ved hjælp af både godt pladebaserede og dråbebaserede enkeltkernegenomiske tilgange6. Denne metode er afhængig af den protokol, der oprindeligt blev beskrevet for hjernevæv af Krishnaswami et al.30 med yderligere modifikationer skræddersyet til flashfrossen lever. Optimal homogenisering frigør de fleste kerner fra vævet uden at påvirke kernemembranens integritet negativt. Overdouncing kan dog skade de skrøbelige kerner og reducere deres samlede kvalitet. Unge og / eller fedtlever kræver normalt kun 5 slag med pestle A og 10 slagtilfælde med pistil B, mens gamle og / eller fibrotiske lever kan kræve 15 slagtilfælde med pistil B, men ikke mere. Det anbefales derfor ikke at udføre flere slag ud over de tal, der er angivet her. Overdouncing kan påvirke kvaliteten af enkeltkernesuspensionen negativt og øge mængden af omgivende RNA. Efterfølgende kan dette føre til behovet for at udføre yderligere beregningsfiltreringstrin under downstream-dataanalyserne.
Protokollen, der præsenteres her, er alsidig og kan justeres til forskellige leverforhold hos unge (3 måneder) og gamle (24 måneder) mus. Da vi fandt ud af, at en større del af leveren er nødvendig for gamle, HFD og fibrotiske væv, kan størrelsen af det væv, der er tilgængeligt til behandling, udgøre en begrænsning for nogle brugere med mindre mængder biologisk startmateriale. Gradientrensning anbefales dog stærkt til øjeblikkelig prøvebehandling med dråbebaserede genomiske assays. Hvis kernerne skal FACS sorteres i 96-/384-brøndplader til velbaserede assays, kan gradientrensning udelades. Vi opfordrer brugerne til stadig at udføre gradientrensningen, hvis der er nok vævsprøve til at opnå den anbefalede kernekoncentration til FACS-sortering (dvs. ~ 1 × 105 kerner / ml).
Leveren er karakteriseret ved den polyploide karakter af hepatocytter9, men hepatocytploididens rolle i normal fysiologi og sygdom er endnu ikke klar. Der er en voksende mængde beviser, der tyder på, at ploidy giver genomisk variabilitet31, og det er velkendt, at ploidy stiger medalderen 32,33. Berigelsen af mononukleerede tetraploide hepatocytter er imidlertid også klinisk forbundet med dårlig prognose i humant hepatocellulært karcinom (HCC)34. Tilsvarende er ændringer i hepatocyt ploidiniveauer forbundet med aldringsrelaterede kroniske leversygdomme såsom ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD)35,36,37. Ploidy er betingelsen for at besidde mere end to kopier af genomet, som kan udforskes ved at farve genomindholdet med et DNA-farvestof som Hoechst38. Hoechst-farvestof, der tilsættes HB før ekstraktion, mærker alle kernerne under isolationsprotokollen. Dette gør det muligt at skelne mellem diploide og polyploide kerner baseret på deres DNA-indhold, når de ophidses af en UV (350 nm) eller violet (450 nm) laser på et flowcytometriinstrument. Med den fremviste gating-strategi kan 2n, 4n, 8n og højere niveauer af hepatocytploidi undersøges i frosne, arkiverede lever for bedre at forstå rollen som cellulær heterogenitet i vævsfunktion1 (figur 3A). Desuden kan den nukleare morfologi, herunder størrelse og volumen, kvantificeres ved hjælp af billeddannelsesflowcytometri for at korrelere ændringer i kernestørrelsen med ændringer i det samlede antal tællinger eller antal gener afhængigt af ploidiniveauet (figur 3B, C).
Multimodal omics-måling giver mulighed for at undersøge flere lag af genomisk organisation samtidigt. Den fælles RNA + ATAC multiomics-tilgang tillader undersøgelse af opstrømsregulatorer og nedstrøms metaboliske gener, hvilket giver en omfattende tilgang til undersøgelse af transkriptionelle netværk og kromatinarkitekturen forbundet med leverfunktionen ved enkeltcelleopløsningen. Med fremskridtene inden for beregningsmetoder, der kan tage højde for datasparsomhed og reduktionen i sekventeringsomkostninger, er enkeltcelle multiomics banebrydende for vurderingen af flere modaliteter fra den samme celle. Denne enkeltkerneisoleringsprotokol er kompatibel med den individuelle og fælles vurdering af ekspressions- og kromatindatasæt. Vi har brugt standardrørledninger etableret af Stuart et al.23 (Signak-pakke) til at illustrere kvaliteten af dataene, mens flere tilgængelige og alternative beregningsmetoder let kan anvendes til downstream-analyser23,39,40,41.
Samlet set tillader enkeltkernemultiomics undersøgelse af bioarkiveret, FF-mus, humant og ikke-humant primatlevervæv ved hjælp af en meget lille mængde startprøvemateriale ved at implementere kerneekstraktionsprotokollen, der præsenteres her. Dette uvurderlige værktøj vil give leverbiologer mulighed for at forhøre både genekspression og kromatintilgængelighed i forbindelse med forskellige leverpatologier. Derudover kan forskellige niveauer af hepatocytploidi og den resulterende justering af genekspression afhængigt af deres placering i leverlobulen afsløre deres rolle i leverpatologier. Derfor forventer vi, at undersøgelsen af cellulær heterogenitet vil give nye muligheder for udvikling af præcisionsmedicin og målrettede interventioner mod sygdomme som HCC og NAFLD.

Enkeltcellegenomik er hurtigt ved at blive en vigtig metode til at studere leverfunktion og vurdere virkningen af cellulær heterogenitet i sundheds- og sygdomstilstande1. Den hurtige udvikling af "multiomics" til samtidig måling af forskellige lag af information og den parallelle udvidelse af robuste beregningsrørledninger baner vejen for opdagelsen af tidligere ukendte celletyper og undertyper i den normale og syge lever2.
Muligheden for at udforske biobanker og arkiverede frosne prøver har signifikant øget mulighederne for at revidere og opdage rollen som ikke-parenkymale celler 3,4,5 og undersøge rollen som polyploide hepatocytter under aldring og i kroniske sygdomme 6,7,8,9 . Derfor beskriver dette papir en robust og reproducerbar enkeltkerneisoleringsprotokol for flashfrosne (FF) arkiverede lever, der er kompatible med downstream single-nucleus RNA-sekventering og ATAC-sekventering samt med multimodal omics (fælles RNA-seq og ATAC-seq) (figur 1).
Denne arbejdsgang giver mulighed for undersøgelse af transkriptomet og kromatintilgængeligheden af alle celletyper i leveren, uafhængigt af cellestørrelsen eller skrøbeligheden, i enzymatiske dissociationsprotokoller. Det kan udføres med små vævssektioner (15-30 mg eller 5-10 mm3) fra dyrebare humane prøver eller transgene mus. Bestemmelse af kerneisoleringens høje renhed inkluderer kvantificering og måling af den nukleare størrelse, som kan korrelere med øget cellestørrelse og ældning 10,11, og denne renhed er relevant for analysen af både hepatocytploidi 12 og cellestørrelsesafhængige transkriptionelle mekanismer11,13,14,15 . Derudover bevarer kerner isoleret fra frosne lever værdifuld information om leverbeboelse. Arbejdsgangen og vævsindsamlingen giver mulighed for validering af enkeltcellegenomiske data eller yderligere komplementære analyser, såsom immunohistokemi eller rumlig transkriptomik fra det samme væv og det samme individ. Derfor kan denne tilgang anvendes til flere leversygdomstilstande og modelorganismer systematisk og pålideligt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20 - 5 mL</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive PCR film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Sorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000619</td>
			<td>Use chilled at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Kit v3.1, 4 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) 1 M solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td>Make 1 mM stock solution and use at 1 &#181;M final concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA AWAY Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10223471</td>
			<td>Wipe surfaces and pipettes before start of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16628742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16638742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (EB) - 250 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13527550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13518470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade - 100 mL&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10517694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters 50 &#181;m, sterile&#160;&#160;</td>
			<td>SYSMEX PARTEC - CELLTRICS</td>
			<td>04-004-2327</td>
			<td>Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) - 1 L</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP3905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herenz Heinz ABS Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen TE Buffer - 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11568846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2 M), RNase-free, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M), 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10209104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10733087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#246;rser 2 mL DOUNCE</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH</td>
			<td>9651632</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td>Or any other strip and tube mini centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Hemocytometer</td>
			<td>OMNILAB&#160; LABORZENTRUM</td>
			<td>5435293</td>
			<td>Visualize and count nuclei under microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips RT LTS 1000 &#181;L, Wide-O</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30389218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pistill &#34;A&#34; 2 mL</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH&#160;</td>
			<td>9651621</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pistill &#34;B&#34; 2 mL</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH</td>
			<td>9651627</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10579691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10634141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10100151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector RNase inhibitor - 2,000 U</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3335399001</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-based RNase Inhibitor SUPERase&#8226;In (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Clontech Takara</td>
			<td>2313B</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free microfuge tubes - 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Wipe surfaces and pipettes before start of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIselect - 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318</td>
			<td>Aliquot and store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, 500 g</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td>Make a 1 M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11798343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI (1M), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10671652</td>
			<td>Make 10% stock solution. Keep at 4 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11538886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex- Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-1372</td>
			<td>Or any other type of vortex</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of nuclei from flash-frozen liver tissue for single-cell multiomics

Leveren er et komplekst og heterogent væv, der er ansvarlig for at udføre mange kritiske fysiologiske funktioner, såsom vedligeholdelse af energihomeostase og metabolisme af xenobiotika, blandt andre. Disse opgaver udføres gennem tæt koordinering mellem hepatiske parenkymale og ikke-parenkymale celler. Derudover er forskellige metaboliske aktiviteter begrænset til bestemte områder af leverlobule-et fænomen kaldet leverzonation. Nylige fremskridt inden for enkeltcellesekventeringsteknologier har givet forskere mulighed for at undersøge vævs heterogenitet ved en enkeltcelleopløsning. I mange komplekse væv, herunder leveren, kan barske enzymatiske og / eller mekaniske dissociationsprotokoller negativt påvirke levedygtigheden eller kvaliteten af de enkeltcellesuspensioner, der er nødvendige for omfattende karakterisering af dette organ i sundhed og sygdom.
Dette papir beskriver en robust og reproducerbar protokol til isolering af kerner fra frosset, arkiveret levervæv. Denne metode giver kerner af høj kvalitet, der er kompatible med downstream, enkeltcelle omics-tilgange, herunder enkeltkerne RNA-seq, assay for transposase-tilgængelig kromatin med high-throughput sekventering (ATAC-seq) samt multimodal omics (fælles RNA-seq og ATAC-seq). Denne metode er med succes blevet anvendt til isolering af kerner fra sunde og syge humane, mus og ikke-menneskelige primat frosne leverprøver. Denne tilgang tillader upartisk isolering af alle de vigtigste celletyper i leveren og tilbyder derfor en robust metode til at studere leveren ved enkeltcelleopløsningen.

Denne arbejdsgang for enkeltkerneisolering fra frosne leverprøver er skræddersyet til enkeltkernemultiomik og er afhængig af tre hovedtrin, som kan opsummeres som i) prøveindsamling til parallel analyse af cellulær heterogenitet og vævsarkitektur, ii) enkeltkernesuspension og iii) enkeltkernemultiomik (figur 1 ). De ekstraherede lever dissekeres fra aflivede mus og skæres i stykker til histologisk inspektion for enten paraffinindlejring, kryosektion eller begge dele. Andre udskårne stykker flashfryses straks i flydende nitrogen til nedstrøms, enkeltkerneisolering til multiomics-analyser. Dette system til vævsindsamling giver brugeren mulighed for yderligere at validere enkeltkerneomics-dataene om vævssektioner fra det samme individ og derved supplere datasættet med rumlig transkriptomik eller med immunohistokemiske analyser, hvis det er nødvendigt.
Den mikroskopiske undersøgelse af kernerne ekstraheret fra frosne lever med den her beskrevne metode viser, at densitetsgradientcentrifugeringstrinnet i høj grad letter fjernelsen af uønsket cellulært og vævsaffald (figur 2C, D). Desuden bevarer denne metode alle niveauer af ploidi, som kan valideres og kvantificeres ved cytometriske analyser (figur 3).
For yderligere at validere udførelsen af denne protokol gennemførte vi dråbebaseret snRNA-seq på usorterede og FACS-sorterede kerner og analyserede dataene efter Seurat-rørledningen. Kort fortalt blev de ekstraherede enkeltkerner forberedt til dråbebaseret snRNA-seq som beskrevet tidligere19. Til snRNA-seq af 2n- og 4n-kerner eller højere niveauer af ploidi blev 11 cyklusser anvendt til cDNA-amplifikationstrinnet og 10 cyklusser til den endelige genekspressionsbibliotekskonstruktion. De resulterende biblioteker blev sekventeret til en læsedybde på ~ 25.000-39.000 gennemsnitlige læsninger pr. Kerne. De opnåede enkeltkernelæsninger blev kortlagt til GRCm39/mm39 musegenomet. Når forbehandlingsrørledningen køres, blev kommandoen - -include-intron tilføjet for at fastslå inkluderingen og kvantificeringen af det usplejsede messenger RNA (mRNA), der er til stede i kernerne. EmptyDrops-algoritmen , der er indbygget i justeringen, filtrerede ud og fjernede de tomme dråber.
R-pakken Seurat (version 4.1.1) blev brugt til at beregne kvalitetskontrol (QC) målinger ved hjælp af den unikke molekylære identifikator (UMI) tællematrix som udsendt af snRNA-seq-analysepipelinen. Tællinger med mindre end 100 træk (gener) og mindre end 10 celler blev fjernet. Kernerne blev filtreret i henhold til identificerede QC-tærskler: minimum antal gener = 200 og maksimalt antal gener = 8.000, mitokondrie fraktion <1% og ribosomal fraktion <2%. De øverste 3.000 meget variable gener (HVG'er) blev brugt til hovedkomponentanalysen (PCA), som implementeret i Seurat. Grafbaseret klyngedannelse blev udført efter indtastning af de 15 bedste pc-dimensioner som følge af PCA-analysen. For at gruppere cellerne anvendte vi modularitetsoptimeringsteknikken (Louvain-algoritmen) med en opløsningsparameter indstillet til 0,5. For at visualisere og udforske dette datasæt kørte vi ikke-lineær dimensionel reduktion, nemlig Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). Identiteten af hver klynge blev tildelt baseret på forudgående kendskab til markørgenerne 6,20,21.
Figur 4A viser målinger af høj kvalitet fra de data, der er opnået ved hjælp af denne metode til kerneekstraktion. UMAP repræsenterer antallet af tællinger på tværs af alle kernerne og de vigtigste celletyper, der med sikkerhed kun kan identificeres med det nukleare transkriptom og relativt overfladisk sekventering (~ 25.000-40.000 gennemsnitlige læsninger pr. Celle) (figur 4B). Denne fremgangsmåde tillader undersøgelse af leverspecifikke transkriptionsfaktorer såsom Hnf4a, Mlxipl og Ppara samt nedstrøms målgener involveret i metabolismen af xenobiotika (dvs. Cyp2e1 og Cyp2f2) (figur 4C). Bemærk, at de ekstraherede kerner bevarede kritisk information om leverbezonation, som det fremgår af det komplementære mønster af kendetegnende gener såsom pericentral Cyp2e1 og periportalen Cyp2f2 (figur 4C).
Vi vurderede yderligere kompatibiliteten af de usorterede kerner ekstraheret ved hjælp af denne metode med nyere multiomics-assays til samtidig profilering af det epigenomiske landskab (ATAC) og genekspression (RNA) i de samme enkeltkerner18. Vi optimerede kernelysisinkubationstiden til 5 minutter før transponering. Sekventeringsbibliotekerne blev konstrueret ved at køre seks PCR-cyklusser til cDNA-foramplifikationen. Fra den forforstærkede prøve blev 35 μL taget og yderligere forstærket af 15 PCR-cyklusser til prøveindeksering for at konstruere genekspressionsbiblioteket. Et repræsentativt elektroferogram af cDNA-sporet er vist i figur 5A (øverst). Til konstruktion af ATAC-bibliotekerne blev 40 μL forforstærket prøve anvendt og kørt i yderligere seks PCR-cyklusser til prøveindeksering med det repræsentative elektroferogram af DNA-sporet vist i figur 5A (nederst). Det resulterende genekspressionsbibliotek (RNA) blev sekventeret til en dybde på 44.600 læsninger pr. kerne og ATAC-biblioteket til en dybde på 43.500 læsninger pr. kerne (figur 5B).
I lighed med den ovenfor beskrevne blev enkeltmodalitet, dråbebaseret sekventeringsprotokol, læsekortlægning, justering, fjernelse af tomme dråber og fragmenttælling udført efter standardretningslinjer, som beskrevet tidligere, ved hjælp af GRCm39 / mm39 referencegenom18. Ved hjælp af Seurat- og Signak-pakkerne22 udførte vi en "vægtet nærmeste nabo" (WNN) analyse for flere målinger af begge modaliteter (RNA + ATAC) (figur 5C), som gjorde det muligt for os at identificere og kommentere både de større og mindre levercelletyper uden fremtrædende forstyrrelser på grund af cellestørrelse eller nuklear skrøbelighed (figur 5D). Rørledningen, som offentliggjort af Satija-laboratoriet22,23, inkluderer standard QC-trinforbehandling og dimensionel reduktion udført på begge assays uafhængigt. For at få en god repræsentation af den vægtede kombination af RNA-seq- og ATAC-seq-modaliteterne blev WNN-grafen plottet og brugt til UMAP-visualisering, klyngedannelse og annotation baseret på tidligere identificerede markørgener 6,20,21. I lighed med analyserne ved hjælp af enkeltmodalitet opdagede vi også opstrøms transkriptionelle regulatorer (Hnf4a, Ppara, Mlxipl) og kendetegnende gener for leverzonering (Hamp, Cyp2e1 og Cyp2f2) (figur 5E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig01.jpg"> Figur 1: Eksperimentel oversigt, arbejdsgang og enkeltcellede genomiske applikationer. (A) Illustrativ repræsentation af vævsprøvetagning til histologi (til venstre, tre sektioner er udvalgt til paraffinindlejring og / eller kryosektion), flashfrossen vævsindsamling til enkeltcellegenomik (midten) og repræsentative immunohistokemi- og immunfluorescensanalyser (højre) skala bar = 100 μm. (B) Kritiske trin for enkeltkernesuspensioner af høj kvalitet. (C) Kernesuspensionerne kan lægges på en 10x kromchip eller bruges til FACS-sortering og pladebaserede tilgange. Forkortelser: H&E = hæmatoxylin og eosin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig02.jpg"> Figur 2: Leverdissektion og Dounce-glasvævshomogenisering. (A) Repræsentativ murinlever fra en 3 måneder gammel C57BL6/J-mus (til venstre); leversektionen, der anvendes til enkeltkerneisolering før (midten) og efter hakning af vævet med skalpellen (højre). Skalastænger = 1 cm. (B) Illustrative billeder af 2 ml Dounce-glashomogenisering før streger med "løs" pistil A (venstre) og efter "stram" pistil B (højre ). Overvågning af vævshomogeniseringen ved hjælp af et hæmocytometer (C) før gradientcentrifugering og (D) efter gradientcentrifugering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig03.jpg"> Figur 3: Fluorescensaktiveret cellesortering og billeddannelsesflowcytometri til karakterisering af kerner med høj kapacitet. (A) Gating-strategi for enkeltkerne FACS-sortering i en plade til forhør af forskellige niveauer af ploidi. Scatter gate baseret på det fremadrettede spredningsområde versus sidespredningsområdet, der er indstillet til at udelukke snavs; kerneport baseret på Hoechst-Height versus Hoechst-Area, der inkorporerer multipel kernepopulationer; singlets gate baseret på Hoechst-Width versus Hoechst-A sæt til dubletdiskrimination; Hoechst-A-histogrammet tillader visualisering af kernens ploidi-profil. (B) Repræsentativ billeddannelsescytometrikvantificering af alle hændelser (venstre) og enkelte (højre) hændelser, der viser diploide og tetraploide kerner. (C) Brightfield- og Hoechst-billeder af 2n- og 4n-kerner og deres kvantificering ved hjælp af billeddannelsescytometri. Forkortelser: FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; FSC-A = fremadrettet spredningsområde; SSC-A = side scatter område; Hoechst-H = Hoechst-højde; Hoechst-A = Hoechst-området; Hoechst-W = Hoechst-bredde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig04.jpg"> Figur 4: Dyb karakterisering af hepatocytploidi med snRNA-seq . (A) Violinplots, der viser antallet af gener, tællinger, procentdel af mitokondriegener og procentdel af ribosomale gener detekteret. (B) UMAP, der demonstrerer de celletyper, der er påvist ved hjælp af snRNA-seq (venstre), med kvantificeringen udtrykt i procent af kerner (højre). (C) UMAP illustrerer antallet af tællinger og angiver ekspressionen af hepatocytspecifikke gener. Alle kernerne (øverste række), 2n kerner (midterste række) og 4n kerner (nederste række). Forkortelser: snRNA-seq = enkeltkerne RNA-seq; UMAP = ensartet mangfoldighed tilnærmelse og projektion; Mitoc. = mitokondrie gener; Ribos. = ribosomale gener. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig05.jpg"> Figur 5: Kvalitetskontrol og analyse af multiomics (joint RNA-seq og ATAC-seq) fra frosne, arkiverede unge lever . (A) Repræsentative automatiske elektroforetiske spor opnået efter den multiomiske pipeline, der viser molekylvægtsproduktet efter cDNA-syntese og ATAC. (B) Violinplot, der viser antallet af tællinger for ATAC-seq, RNA-seq, procentdelen af mitokondriegener og procentdelen af ribosomale gener før og efter filtrering. (C) UMAP viser genekspressionen fra RNA-seq (venstre), ATAC-seq (midten) og fælles modaliteter-RNA-seq og ATAC-seq (højre). (D) Forskellige celletyper er kommenteret i forskellige farver med ekspression af indikerede hepatocytspecifikke gener. (E) Funktionsdiagram, der viser den klyngespecifikke ekspression af de angivne gener i de angivne celletyper. Forkortelser: ATAC-seq = assay for transposase-tilgængelig kromatin med high-throughput sekventering; Mid Hep = mid-zonal hepatocytter; Endo = endotelceller; PV Hep = periportal hepatocytter; Ikke-z Hep = ikke-zonede hepatocytter; CV Hep = pericentrale hepatocytter; Kup & DC = Kupffer & dendritiske celler; SC = stellatceller, Neu = neutrofiler; Chol = cholangiocytter; Mitoc. = mitokondrie gener; Ribos. = ribosomale gener. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Reagens</td>
			<td>Lager</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>15 ml</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">a) Iodixanol Medium (IDM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">250 mM saccharose</td>
			<td>1 mio. kr.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">150 mM KCl</td>
			<td>2Mio.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3,75 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">30 mM MgCl2</td>
			<td>1 mio. kr.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">60 mM Tris buffer pH 8,0</td>
			<td>1 mio. kr.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Ultrarent RNasefrit vand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>29,25 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">B) 50 % internt fordrevne</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Iodixanol</td>
			<td>60%</td>
			<td></td>
			<td>12,5 ml</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">IDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,5 ml</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">(C) 29% IDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Iodixanol</td>
			<td>60%</td>
			<td></td>
			<td>7,25 ml</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">IDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7,75 ml</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">D ) Kerneisoleringsmedium-1 (NIM-1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">250 mM saccharose</td>
			<td>1 mio. kr.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">25 mM KCl</td>
			<td>2Mio.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0,625 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5 mM MgCl2</td>
			<td>1 mio. kr.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0,25 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 mM Tris buffer pH 8,0</td>
			<td>1 mio. kr.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Ultrarent Rnase-frit vand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>36.125 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">(E ) Kerner Isolering medium-2 (NIM-2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">NIM-1 buffer</td>
			<td></td>
			<td>9,99 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>0,01 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Proteasehæmmer tablet (EDTA-fri)</td>
			<td>1</td>
			<td>1 Tablet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">f ) Homogeniseringsbuffer (HB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">NIM-2 buffer</td>
			<td></td>
			<td>9.697 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Rekombinant RNasehæmmer</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Proteinbaseret RNAse-hæmmer (SUPERase•IN)</td>
			<td>20 U/μL</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">0,1% Triton-X</td>
			<td>10%</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">3 μg/ml Hoechst 33342</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>0,003 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">g ) Buffer til opbevaring af kerner (NSB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">166,5 mM saccharose</td>
			<td>1 mio. kr.</td>
			<td>1.665 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">5 mM MgCl2</td>
			<td>1 mio. kr.</td>
			<td>0,05 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 mM Tris pH 8,0</td>
			<td>1 mio. kr.</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Rekombinant RNasehæmmer</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Proteinbaseret RNase-hæmmer (SUPERase•IN) *</td>
			<td>20 U/μL</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Ultrarent RNasefrit vand</td>
			<td></td>
			<td>8.085 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">* Valgfri (kun til FACS-sortering)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Løsningsopskrifter. A) Fremstilling af iodixanolmedium (IDM) B) 50% fortynding af iodixanolopløsning C) 29% fortynding af iodixanolopløsningen. D) Fremstilling af kerneisoleringsmedium-1 (NIM-1). E) Fremstilling af kerneisoleringsmedium-2 (NIM-2). (F) Forberedelse af homogeniseringsbuffer (HB). G) Forberedelse af kernelagringsbuffer (NSB).

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics at JoVE.com

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

Her præsenterer vi en protokol til isolering af kerner fra flashfrosne, arkiverede levervæv til enkeltkerne RNA-seq, ATAC-seq og fælles multiomics (RNA-seq og ATAC-seq).

Isolering af kerner fra flashfrosset levervæv til enkeltcelle multiomics

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Denne nemme og reproducerbare protokol blev med succes brugt til at isolere kerner af høj kvalitet fra sunde og syge musemodellever samt lever fra menneskelige og ikke-menneskelige primater. Denne metode kræver kun en lille mængde frosset vævsmateriale. Tæthedsgradincitament giver også en meget ren nuklear suspension med alle de vigtigste celletyper i leveren bevaret i den endelige nukleare forberedelse.Denne metode til kerneekstraktion kan anvendes i bioarkiverede humane leverprøver, der opbevares i biobanker. Begynd vævshomogeniseringen ved at skære et 2230 milligram eller fem millimeter terningstykke fra et levervæv placeret i petriskålen på tøris ved hjælp af en forkølet skalpel. Overfør straks petriskålen til våd is og tilsæt en milliliter homogeniseringsbuffer.Brug den kolde skalpel til at hakke vævet så meget som muligt, så det kan aspirere med en en milliliter bred åbningsspids. Saml vævssuspensionen og overfør den til en forkølet to milliliter glas dounce Homogenizer. Vask petriskålen med yderligere 0,521 ml homogeniseringsbuffer og saml alle de resterende vævsstykker, mens alt holdes på is.Udfør langsomt og omhyggeligt fem slag med løs pistel A på is uden at skabe bobler. Sørg for, at pistlen bevæger sig forsigtigt fra toppen til bunden af homogenisatoren med hvert slag. Udfør derefter 10 til 15 langsomme slag med tæt pistle B på is uden at skabe bobler.Når det er gjort, filtreres homogenatet gennem en 50 mikrometer cellesi, mens det overføres til et forkølet 1,5 milliliter rør. Brug mere end et filter eller rør til homogenater, der indeholder en stor mængde bindevævsklumper. Skyl homogenisatoren og filtrene med yderligere 0,521 ml homogeniseringsbuffer for grundigt at opsamle alle vævshomogenater inden densitetsgradientcentrifugeringen.For densitetsgradientcentrifugering centrifugeres det filtrerede homogenat i en forkølet fastvinkelcentrifuge ved 1000 G i otte minutter ved fire grader Celsius. Mens prøven bliver centrifugeret, skal du forberede et 1,5 ml rør indeholdende 250 mikroliter 50% iodixanolfortynding og et to milliliter rør indeholdende 500 mikroliter 29% iodixanolfortynding. Placer begge rør på is.Derefter opsuges supernatanten fra centrifugesuspensionen uden at forstyrre pelleten ved hjælp af en vakuumpumpe. Suspender pelleten igen i 250 mikroliter homogeniseringsbuffer ved hjælp af den en milliliter brede åbningspipettespids. Overfør derefter 250 mikroliter af kernesuspensionen til et forkølet 1,5 ml rør indeholdende 250 mikroliter 50% iodixanol og bland det forsigtigt og grundigt for at generere en 25% iodixanolkernesuspension.Overfør derefter 500 mikroliter af 25% iodixanolkernesuspensionen til et forkølet rør milliliter rør indeholdende 500 mikroliter 29% iodixanolfortynding. Centrifuge røret i en forkølet svingende spandcentrifuge ved 12.500 G i 20 minutter, med pausen sat til at slukke. Lige før centrifugeringstrinnet er afsluttet, skal du tilføje RNA-hæmmerne til kernelagringsbufferen eller NSB, mens du fortsætter til de enkeltkernede RNA-sekventeringsrørledninger.Efter afslutningen af centrifugeringen opuges supernatanten uden at forstyrre pelleten ved hjælp af en vakuumpumpe. Ophæng forsigtigt pelleten i 100 til 300 mikroliter NSB ved hjælp af den ene milliliter brede åbningspippetspids, og overfør kernesuspensionen til et rent forkølet 1,5 milliliter rør. Tæl kernerne ved hjælp af trypanblå opløsning med et manuelt hæmocytometer, og brug straks den opnåede kernesuspension til enkeltkernegenomanalysen.Til flowcytometribaseret cellesortering filtreres kernesuspensionen gennem et 50 mikrometer filter i et forkølet fem milliliter fluorescensaktiveret cellesortering eller faxrør. Brug en flowcytometrisorterer udstyret med en dyse på 100 mikrometer, og læg faxrøret på sorteringen, før du får vist prøven. Opsæt gating-strategien for kernesorteringen, startende med en scatter-port ved at plotte det fremadrettede spredningsområde versus sidespredningsområdet efterfulgt af hoaxed height versus hoaxed area og derefter hoaxed width versus hoaxed area.Visualiser kernens ploidy-profil på det fupede områdehistogramme. Til sortering i 96 eller 384 brøndplader skal du indstille dråbeforsinkelsen og optimere pladejusteringen ved hjælp af den farvemetriske metode. Prøvekølingen og pladeholderen indstilles til fire grader Celsius med prøverotationen tændt ved 300 o / min.Sorter de enkelte kerner ved en prøvekoncentration på ca. en gange 10 til den femte kerne pr. milliliter med en strømningshastighed på 200 til 500 hændelser pr. Sekund. Den mikroskopiske undersøgelse af kernerne ekstraheret fra frosne lever viste, at densitetsgradientcentrifugeringstrinnet i høj grad lettede fjernelsen af uønsket cellulært og vævsrester. Denne metode bevarede alle niveauer af ploidi, som blev valideret og kvantificeret ved cytometrisk analyse.Målinger af høj kvalitet blev observeret ud fra de data, der blev opnået ved hjælp af kerneekstraktion. Ensartet mangfoldig tilnærmelse og projektion repræsenterede antallet af tællinger på tværs af alle kernerne og de vigtigste celletyper, som med sikkerhed kun kan identificeres med det nukleare transkriptom og relativt overfladisk sekventering. Denne fremgangsmåde tillod undersøgelse af leverspecifikke transkriptionsfaktorer og nedstrøms målgener involveret i metabolismen af xenobiotika.Det gratis mønster af kendetegnende gener som den percentrale CYP2E1 og periportalen CYP2F2 viste, at de ekstraherede kerner bevarede kritisk information om leverdonation. Genekspressionsbiblioteket af RNA blev sekventeret til en dybde på 44.600 læsninger pr. kerne og ATAC-biblioteket til en dybde på 43.500 læsninger pr. Kerne. En vægtet nærmeste naboanalyse udført til flere målinger af begge modaliteter, RNA plus ATAC, ved hjælp af Seurat- og Signak-pakkerne tillod identifikation og annotation af de større og mindre levercelletyper uden fremtrædende forstyrrelser på grund af cellestørrelse eller nuklear skrøbelighed.De opstrøms transkriptionelle regulatorer og kendetegnende gener ved leverdonation blev også påvist i denne metode. Det er vigtigt at undgå at skabe for mange bobler under duns homogenisering, når du bevæger pistlerne op og ned, og at holde sig til antallet af slag, der er angivet i protokollen.

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-baserede Isolering af Tagged Kerner fra<em&gt; Drosophila</em&gt; væv til genekspressionsanalyse

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Nuklei isolation fra hele væv ved hjælp af et vaskemiddel og enzym-Fri metode

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Kromatinekstraktion fra frosset kimært levervæv til kromatinimmunudfældningsanalyse

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Kerneisolering fra voksen musenyre til RNA-sekventering med en kerne

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, karakterisering og terapeutisk anvendelse af ekstracellulære vesikler fra dyrkede humane mesenkymale stamceller

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Enkeltcellesuspensionspræparat fra Nile Tilapia-tarm til enkeltcellesekventering

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Isolering og transkriptomanalyse af plantecelletyper

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...