Name: isolation of nuclei from flash-frozen liver tissue for single-cell multiomics
Uploaded: 2022-12-09T14:40:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door de Helmholtz Pioneer Campus (M.S., K.Y., C.P.M.-J.) en het Institute of Computational Biology (C. T.-L.). Dit onderzoek werd ook ondersteund door AMED onder Grant Number JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). We bedanken de Core Genomics bij HMGU (I. de la Rosa) en Bioinformatics (T. Walzthoeni) ondersteuning, in het bijzonder Xavier Pastor voor training en begeleiding. We bedanken A. Feuchtinger, U. Buchholz, J. Bushe en alle andere medewerkers van de HMGU Pathology and Tissue Analytic core facility voor hun technische en wetenschappelijke ondersteuning, evenals J. Zorn, R. Erdelen, D. Würzinger, medewerkers van E-Streifen, evenals de core facility Laboratory Animal Services voor hun voortdurende wetenschappelijke ondersteuning en discussie. We zijn dankbaar voor de Core Facility Cell Analysis bij TranslaTUM (R. Mishra) en Luminex, A DiaSorin Company (P. Rein). Wij danken Dr. I Deligiannis voor zijn technische ondersteuning. Dr. M. Hartman, Dr. A. Schröder en mevrouw A. Barden (Helmholtz Pioneer Campus) waren fundamenteel voor hun juridische, bestuurlijke en administratieve ondersteuning.

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse dierenwelzijnswetgeving en de voorschriften van de regering van Opper-Beieren. Huisvesting van dieren werd goedgekeurd volgens §11 van de Duitse dierenwelzijnswet en uitgevoerd in overeenstemming met Richtlijn 2010/63/EU.
1. Weefselvoorbereiding
<ol><li>Offer een 3 maanden oude tot 22 maanden oude mannelijke C57BL / 6J muis door cervicale dislocatie. Leg het dier op een ontleedplaat, zet de ledematen vast met pinnen en desinfecteer de buik met 70% ethanol.</li>
	<li>Voer obductie uit zoals aanbevolen door Treuting et al.16.<ol><li>Open de buik tot aan de ribbenkast, visualiseer de lever en gebruik een tang om de lever voorzichtig te verwijderen zonder de lobben te doorboren.</li>
		<li>Extraheer de intacte lever door het diafragma met een tang vast te houden en het verbindingsweefsel met een schaar te verwijderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Was het orgaan in koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), dep het droog op een schone papieren handdoek en snijd de leverlobben in verschillende stukken voor verschillende doeleinden: FF voor isolatie met één kern en multiomics; paraformaldehyde-gefixeerd (10% PFA) voor paraffine-inbedding; en/of ingebed in een optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) voor verdere histologische analyses (figuur 1A).</li>
	<li>Aliquot de leverstukken in cryovialen of 5 ml schroefdopbuizen en bevries onmiddellijk in vloeibare stikstof. Bewaar de bevroren levermonsters bij −80 °C voor downstream single-nucleus multiomics-experimenten (figuur 1B, C). OPMERKING: Het gecryopreserveerde weefsel kan gedurende meerdere jaren veilig worden bewaard bij −80 °C en moet altijd vóór gebruik op droogijs bij −80 °C worden vervoerd.</li>
</ol>2. Kernen isolatie
<ol><li>Benchtop reiniging en voorbereiding van de buffers en verbruiksartikelen<ol><li>Reinig de werkbladen en pipetten met 70% ethanol en RNase-decontaminatieoplossing, of gebruik speciale RNase-vrije werkbladen en materialen.</li>
		<li>Prechill zowel de zwenkbak als de centrifuges met vaste hoek, buizen van 1,5 ml/2 ml en multiputplaten tot 4 °C, zoals hieronder beschreven.</li>
		<li>Prechill de RNase-vrije pincet voor eenmalig gebruik die wordt gebruikt voor weefselbehandeling, een steriel wegwerp scalpel en een petrischaaltje op droogijs (−60 °C).</li>
		<li>Prechill de Dounce glashomogenisator en stampers op ijs (4 °C). Plaats elke stamper (A en B) in een buis van 5 ml om direct contact met het ijs en mogelijke RNase-verontreiniging te voorkomen.</li>
		<li>Bereid een verdunningsoplossing van iodixanolmedium (IDM) (tabel 1A) en gebruik deze om 50% en 29% verdunningen te maken van het 60% iodixanol stock density gradient medium (respectievelijk tabel 1B en tabel 1C).</li>
		<li>Prechill alle buizen. Bereid voor elk monster dat zal worden verwerkt de volgende buizen voor:<ol><li>Bereid drie 1,5 ml laag-DNA-bindende buizen voor (één voor het gefilterde weefselhomogenaat, een tweede met 250 μL van een 50% verdunning van iodixanoloplossing en een derde voor de schone kernenuspensie).</li>
			<li>Bereid een buis van 2 ml met ronde bodem met 500 μL van een 29% verdunning van iodixanoloplossing voor de dichtheidsgradiëntscheiding.</li>
			<li>Bereid een conische buis van 15 ml voor de kernen isolatiemedium-2 (NIM-2) en homogenisatiebuffer (HB).</li>
		</ol></li>
		<li>Bereid de kernen isolatie medium-1 (NIM-1) voor (tabel 1D) en gebruik deze om de NIM-2 (tabel 1E) en vervolgens de HB (tabel 1F) te maken. Voeg beide RNAse-remmers vlak voor gebruik toe, zoals hieronder beschreven in het protocol.</li>
		<li>Bereid de opslagbuffer van kernen (NSB) voor zoals beschreven in tabel 1G. Voeg vlak voor gebruik de recombinante RNAseremmer toe. Voeg op eiwitten gebaseerde RNAse-remmer toe aan de NSB voor gebruik voor FACS-sortering (optioneel).</li>
		<li>Bereid een bekerglas van 500 ml met steriel water om de Dounce-homogenisatoren en -stampers na de weefselhomogenisatie te weken voor de optimale reiniging en het onderhoud van de homogenisatoren.</li>
	</ol></li>
	<li>Weefselhomogenisatie<ol><li>Snijd een stukje weefsel van 20-30 mg (of 5 mm3) met een vooraf gechilleerd scalpel in de petrischaal op droogijs. Breng de petrischaal vervolgens onmiddellijk over op nat ijs (4 °C). Voeg 1 ml HB toe en gebruik het koude scalpel en gehakt het weefsel zoveel mogelijk om het gemakkelijk te laten aanzuigen met een 1 ml brede openingpunt. OPMERKING: Gebruik altijd tips voor brede openingen voor alle weefsel/ kernoverdrachten. Als alternatief kunnen 1 ml tips worden gesneden met een steriel scalpel op een steriele plastic hoes om brede openingen te genereren (figuur 2A).</li>
		<li>Verzamel de weefselsuspensie en breng deze over in een vooraf gegraveerde 2 ml glazen Dounce-homogenisator (figuur 2B).</li>
		<li>Was de petrischaal met nog eens 0,5-1 ml HB en verzamel alle resterende stukjes weefsel terwijl je alles op ijs houdt.</li>
		<li>Doe langzaam en voorzichtig vijf slagen met losse stamper A op ijs. Vermijd het creëren van bubbels door draaiende bewegingen van de stamper te gebruiken bij het op en neer trekken. Zorg ervoor dat de stamper bij elke slag voorzichtig van de bovenkant naar de onderkant van de homogenisator beweegt.</li>
		<li>Voer vervolgens 10-15 langzame slagen uit met strakke stamper B op ijs. Vermijd het creëren van bubbels. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de kernen visueel te inspecteren onder de microscoop na 10 slagen met stamper B om vast te stellen of er meer slagen nodig zijn. Doe dit door gebruik te maken van trypan blue staining (1:1 verhouding van trypan tot monster) en een handmatige hemocytometer (bijvoorbeeld 10 μL trypan blue mengen met 10 μL kernen suspensie, en gebruik 10 μL van het mengsel voor onderzoek onder de microscoop; Figuur 2C).</li>
		<li>Filtreer het homogenaat door een celzeef van 50 μm en breng het over in een vooraf gegraveerde buis van 1,5 ml. Gebruik meer dan één filter en/of buis voor homogenaten die een grote hoeveelheid bindweefselklonten bevatten.</li>
		<li>Spoel de homogenisator en de gebruikte filters af met een extra 0,5-1 ml HB om al het weefselhomogenaat grondig te verzamelen. Ga verder met de centrifugatie van de dichtheidsgradiënt.</li>
	</ol></li>
	<li>Dichtheid gradiënt centrifugatie<ol><li>Centrifugeer het gefilterde homogenaat in een vooraf gegraveerde centrifuge met vaste hoek bij 1.000 × g gedurende 8 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Bereid tijdens het draaien van het monster een buis van 1,5 ml met 250 μL 50% iodixanolverdunning en één buis van 2 ml met 500 μL 29% iodixanolverdunning. Houd beide buizen op ijs.</li>
		<li>Na centrifugeren, aspirateer het supernatant zonder de pellet te verstoren met behulp van een vacuümpomp. OPMERKING: Het gebruik van handmatig pipetteren zal de kwaliteit van de uiteindelijke kernophanging in gevaar brengen.</li>
		<li>Voeg 250 μL HB toe aan de pellet met behulp van de 1 ml brede opening pipetpunt en resuspenseer heel langzaam.</li>
		<li>Breng 250 μL van de kernsuspensie over in een vooraf gegraveerde buis van 1,5 ml met 250 μL 50% iodixanolverdunning en meng voorzichtig maar grondig om een 25% iodixanol/ kernensuspensie te genereren.</li>
		<li>Breng 500 μL van de 25% iodixanol/kernen suspensie over in een vooraf gegraveerde buis van 2 ml met 500 μL 29% iodixanolverdunning. OPMERKING: De 500 μL van de 25% iodixanol/kernen suspensie moet voorzichtig worden afgezet bovenop de 500 μL 29% iodixanoloplossing, zodat de 25%/29% iodixanolmengsels een duidelijke fasescheiding vertonen. Gebruik de zijkant van de buiswand met de pipetpunt in een hoek van 45° om deze gradiëntinterface te creëren. Vanaf dat moment moet de buis voorzichtig worden gehanteerd om deze gradiënt niet te verstoren.</li>
		<li>Centrifugeer de buis in een vooraf gegraveerde zwenkbakcentrifuge op 12.500 g gedurende 20 minuten met de rem op UIT gezet.</li>
		<li>Vlak voordat de centrifugatiestap is voltooid, voegt u de RNAse-remmers toe aan de NSB-buffer wanneer u doorgaat naar de scRNA-seq-pijplijnen (zie tabel 1G).</li>
		<li>Na centrifugeren, aspirateer het supernatant zonder de pellet te verstoren met behulp van een vacuümpomp. OPMERKING: Het gebruik van handmatig pipetteren zal de kwaliteit van de uiteindelijke kernophanging in gevaar brengen.</li>
		<li>Gebruik de 1 ml brede opening van de pipetpunt met brede opening en resuspenseer de pellet voorzichtig in 100-300 μL NSB en breng de kernsuspensie over in een schone, vooraf gegraveerde buis van 1,5 ml.</li>
		<li>Tel de kernen met behulp van trypan blue-oplossing (1:1 verhouding van trypan tot monster) en een handmatige hemocytometer (meng bijvoorbeeld 10 μL trypan blue met 10 μL kernsuspensie en gebruik 10 μL van het mengsel voor het tellen; Figuur 2D).</li>
		<li>Gebruik de verkregen kernensuspensie onmiddellijk voor de single-nucleus genomics-test. OPMERKING: De kernsuspensie in NSB kan gedurende maximaal 1 week gekoeld bij 4 °C worden bewaard voor verdere analyse door flow- en/of imaging flowcytometrie, maar niet voor snRNA-seq of snATAC-seq.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kernen sorteren op hepatocyten ploïdie profilering of goed gebaseerde sequencing benaderingen
<ol><li>Voor flowcytometrie-gebaseerde celsortering filtert u de kernensuspensie door een filter van 50 μm in een vooraf gegraveerde FACS-buis van 5 ml.</li>
	<li>Gebruik een flowcytometriesorteerder uitgerust met een mondstuk van 100 μm. Plaats de FACS-buis op de sorteerder en bekijk een voorbeeld van het monster.</li>
	<li>Stel de gatingstrategie voor het sorteren van kernen in, te beginnen met een strooipoort door het voorwaartse strooigebied uit te zetten versus het zijverstrooiingsgebied (FSC-A / SSC-A), gevolgd door Hoechst-Height versus Hoechst-Area (kernpoort) en vervolgens Hoechst-Width versus Hoechst-Area (singlets gate). Visualiseer het ploïdieprofiel van de kernen op het Histogram van het Hoechst-Gebied. OPMERKING: Voor een betere piekresolutie visualiseert u het Hoechst-kanaal (450/50) op de lineaire schaal (figuur 3A).</li>
	<li>Voor het sorteren in 96-/384-well platen, stelt u de druppelvertraging in en optimaliseert u de plaatuitlijning met behulp van de colorimetrische methode met benzidinesubstraat-mierikswortelperoxidase (TMB-HRP), zoals eerder beschreven6.</li>
	<li>Stel zowel de monsterkoeling als de plaathouder in op koeling bij 4 °C, waarbij de monsterrotatie bij 300 tpm wordt ingeschakeld.</li>
	<li>Sorteer de afzonderlijke kernen bij een monsterconcentratie van ~1 x 105 kernen/ml en met een stroomsnelheid van 200-500 gebeurtenissen/s.</li>
</ol>4. Visuele inspectie en kwantificering van nucleaire parameters door middel van beeldvorming van cytometrie (optioneel)
<ol><li>Laad een buis van 0,5 ml met 50 μL van de kernensuspensie in een concentratie van 2 × 107 kernen/ml.</li>
	<li>Stel een poort voor alle gebeurtenissen in op basis van de beeldverhouding ten opzichte van het Hoechst-fluorescentiekanaal om het ploïdieprofiel van kernen te visualiseren (figuur 3B).</li>
	<li>Verkrijg het monster bij een vergroting van 40x met behulp van brightfield (BF) en het Hoechst-fluorescentiekanaal.</li>
	<li>Inspecteer en kwantificeer 2n en 4n kernen met behulp van de brightfield-meting en Hoechst-fluorescentie-intensiteit met imagingcytometriesoftware (figuur 3C).</li>
</ol>5. Single-nucleus RNA-seq, ATAC-seq of multiome bibliotheek constructie en sequencing
<ol><li>Voor druppelgebaseerde snRNA-seq-benaderingen laadt u de gezuiverde kernensuspensie rechtstreeks in het microfluïdische apparaat voor geautomatiseerde parallelle partitionering en moleculaire barcodering17.</li>
	<li>Nadat de microfluïdische run is voltooid in het eencellige partitioneringsapparaat, verzamelt u de gel-geparel-ingekapselde kernen, incubeert en reinigt u zoals eerder beschreven in de richtlijnen van de fabrikant17.</li>
	<li>Voer 11 polymerasekettingreactie (PCR)-cycli uit voor de cDNA-voorversterking met behulp van het volgende programma: 3 minuten bij 98 °C (15 s bij 98 °C, 20 s bij 63 °C en 1 minuut bij 72 °C) x 11, 1 minuut bij 72 °C en houd vast bij 4 °C. Ga verder met een eindreparatie en A-tailing stap en adapterligatie, zoals aangegeven door de fabrikant17. Voer voor de daaropvolgende uiteindelijke genexpressiebibliotheekconstructie 10 PCR-cycli uit met behulp van het volgende programma: 45 s bij 98 °C (20 s bij 98 °C, 30 s bij 54 °C, 20 s bij 72 °C), x 10, 1 min bij 72 °C en houd vast bij 4 °C.</li>
	<li>Rangschik de verkregen bibliotheken tot een leesdiepte van ~20.000-50.000 gemiddelde leeswaarden per kern.</li>
	<li>Voor de joint multiomics (RNA + ATAC) druppelgebaseerde sequencing, incubeer de leverkernen in lysisbuffer gedurende 5 minuten en tag ze vervolgens gedurende 1 uur, zoals eerder beschreven18.</li>
	<li>Laad de gelabelde kernen rechtstreeks in een microfluïdisch apparaat voor geautomatiseerde parallelle partitionering en moleculaire barcodering.</li>
	<li>Nadat de microfluïdische run is voltooid, verzamelt u de gelparel-ingekapselde kernen, incubeert en reinigt u zoals beschreven door de fabrikant18.</li>
	<li>Voer zes PCR-cycli uit voor de cDNA-voorversterkingsstap met behulp van het volgende programma: 5 minuten bij 72 °C, 3 minuten bij 98 °C (20 s bij 98 °C, 30 s bij 63 °C, 1 min bij 72 °C), x 6, 1 minuut bij 72 °C en vasthouden bij 4 °C.</li>
	<li>Neem 35 μL van het voorgevulde monster en voer een cDNA-versterking uit als volgt: 3 min bij 98 °C (15 s bij 98 °C, 20 s bij 63 °C, 1 min bij 72 °C) x 6, 1 min bij 72 °C en houd vast bij 4 °C. Ga verder met de eindreparatie en A-tailing stap en adapterligatie, zoals aangegeven door de fabrikant18 . Voer voor de daaropvolgende pcr-indexering van het eindmonster 15 PCR-cycli als volgt uit: 45 s bij 98 °C (20 s bij 98 °C, 30 s bij 54 °C, 20 s bij 72 °C) x 15, 1 min bij 72 °C en houd vast bij 4 °C.</li>
	<li>Gebruik voor de bouw van ATAC-bibliotheken 40 μL en amplify voor zes PCR-cycli voor monsterindexering met behulp van het volgende programma: 45 s bij 98 °C (20 s bij 98 °C, 30 s bij 67 °C, 20 s bij 72 °C) x 6, 1 min bij 72 °C en houd vast bij 4 °C.</li>
	<li>Sequentieer de verkregen multioomgenexpressiebibliotheken tot een minimale leesdiepte van 20.000 leesparen per kern en de multioom-ATAC-bibliotheken tot een minimale leesdiepte van 25.000 leesparen per cel, zoals aanbevolen door de fabrikant18.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kamies, R., Martinez-Jimenez, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+of+single-cell+genomics+and+epigenomics+in+human+disease:+where+are+we+now.">Advances of single-cell genomics and epigenomics in human disease: where are we now.</a> Mamm Genome. 31 (5-6), 170-180 (2020).</li><li>Ramachandran, P., Matchett, K. P., Dobie, R., Wilson-Kanamori, J. R., Henderson, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+in+hepatology:+New+insights+into+liver+biology+and+disease+pathogenesis.">Single-cell technologies in hepatology: New insights into liver biology and disease pathogenesis.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 17 (8), 457-472 (2020).</li><li>Ramachandran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+fibrotic+niche+of+human+liver+cirrhosis+at+single-cell+level.">Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level.</a> Nature. 575 (7783), 512-518 (2019).</li><li>Andrews, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+single-nucleus,+and+spatial+RNA+sequencing+of+the+human+liver+identifies+cholangiocyte+and+mesenchymal+heterogeneity.">Single-cell, single-nucleus, and spatial RNA sequencing of the human liver identifies cholangiocyte and mesenchymal heterogeneity.</a> Hepatology Communications. 6 (4), 821-840 (2022).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+intercellular+crosstalk+in+healthy+and+NASH+liver+revealed+by+single-cell+secretome+gene+analysis.">Landscape of intercellular crosstalk in healthy and NASH liver revealed by single-cell secretome gene analysis.</a> Molecular Cell. 75 (3), 644-660 (2019).</li><li>Richter, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+RNA-seq2+reveals+functional+crosstalk+between+liver+zonation+and+ploidy.">Single-nucleus RNA-seq2 reveals functional crosstalk between liver zonation and ploidy.</a> Nature Communications. 12 (1), 4264 (2021).</li><li>Matsumoto, T., Wakefield, L., Tarlow, B. D., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+lineage+tracing+of+polyploid+hepatocytes+reveals+extensive+proliferation+during+liver+regeneration.">In vivo lineage tracing of polyploid hepatocytes reveals extensive proliferation during liver regeneration.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 34-47 (2020).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+distribution+of+hepatocyte+proliferation+in+liver+homeostasis+and+regeneration.">Broad distribution of hepatocyte proliferation in liver homeostasis and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 27-33 (2020).</li><li>Donne, R., Saroul-Ainama, M., Cordier, P., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+in+liver+development,+homeostasis+and+disease.">Polyploidy in liver development, homeostasis and disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 17 (7), 391-405 (2020).</li><li>Lengefeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+is+a+determinant+of+stem+cell+potential+during+aging.">Cell size is a determinant of stem cell potential during aging.</a> Science Advances. 7 (46), 0271 (2021).</li><li>Lanz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+size+remodels+the+proteome+and+promotes+senescence.">Increasing cell size remodels the proteome and promotes senescence.</a> Mol Cell. 82 (17), 3255-3269 (2022).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIDDosome-SCAP+crosstalk+controls+high-fructose-diet-dependent+transition+from+simple+steatosis+to+steatohepatitis.">PIDDosome-SCAP crosstalk controls high-fructose-diet-dependent transition from simple steatosis to steatohepatitis.</a> Cell Metabolism. 34 (10), 1548-1560 (2022).</li><li>Padovan-Merhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+mammalian+cells+compensate+for+differences+in+cellular+volume+and+DNA+copy+number+through+independent+global+transcriptional+mechanisms.">Single mammalian cells compensate for differences in cellular volume and DNA copy number through independent global transcriptional mechanisms.</a> Molecular Cell. 58 (2), 339-352 (2015).</li><li>Miettinen, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+transcriptional+and+metabolic+programs+related+to+mammalian+cell+size.">Identification of transcriptional and metabolic programs related to mammalian cell size.</a> Current Biology. 24 (6), 598-608 (2014).</li><li>Vargas-Garcia, C. A., Ghusinga, K. R., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+control+and+gene+expression+homeostasis+in+single-cells.">Cell size control and gene expression homeostasis in single-cells.</a> Current Opinion in Systems Biology. 8, 109-116 (2018).</li><li>Knoblaugh, S. E., Randolph-Habecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Necropsy and histology. In Comparative Anatomy and Histology: A Mouse, Rat, and Human Atlas (Second Edition). , (2018).</li><li>Chromium Next GEM Single Cell 3 Reagent Kits v3.1 User Guide. Document number CG000204 (Rev D). 10x Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2019)</li><li>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide. Document number CG000338 (Rev D). 10x Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide</a> (2021)</li><li>MacParland, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+of+human+liver+reveals+distinct+intrahepatic+macrophage+populations.">Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations.</a> Nature Communications. 9 (1), 4383 (2018).</li><li>Martinez-Jimenez, C. P., Kyrmizi, I., Cardot, P., Gonzalez, F. J., Talianidis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+4alpha+coordinates+a+transcription+factor+network+regulating+hepatic+fatty+acid+metabolism.">Hepatocyte nuclear factor 4alpha coordinates a transcription factor network regulating hepatic fatty acid metabolism.</a> Molecular and Cell Biology. 30 (3), 565-577 (2010).</li><li>Schmidt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-vertebrate+ChIP-seq+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+transcription+factor+binding.">Five-vertebrate ChIP-seq reveals the evolutionary dynamics of transcription factor binding.</a> Science. 328 (5981), 1036-1040 (2010).</li><li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data.">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Madad, S., Lareau, C. A., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+state+analysis+with+Signac.">Single-cell chromatin state analysis with Signac.</a> Nature Methods. 18 (11), 1333-1341 (2021).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+organoids+can+repair+bile+ducts+after+transplantation+in+the+human+liver.">Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver.</a> Science. 371 (6531), 839-846 (2021).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+as+a+tool+for+studying+toxicity+and+drug+metabolism.">Human hepatocytes as a tool for studying toxicity and drug metabolism.</a> Current Drug Metabolism. 4 (4), 292-312 (2003).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+in+primary+culture:+The+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man.">Human hepatocytes in primary culture: The choice to investigate drug metabolism in man.</a> Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).</li><li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows.">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).</li><li>Nault, R., Fader, K. A., Bhattacharya, S., Zacharewski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nuclei+RNA+sequencing+assessment+of+the+hepatic+effects+of+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.">Single-nuclei RNA sequencing assessment of the hepatic effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (1), 147-159 (2021).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+as+a+mechanism+for+stress-induced+liver+adaptation.">Aneuploidy as a mechanism for stress-induced liver adaptation.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (9), 3307-3315 (2012).</li><li>Kreutz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+ploidy+is+a+diversity+factor+for+liver+homeostasis.">Hepatocyte ploidy is a diversity factor for liver homeostasis.</a> Frontiers in Physiology. 8, 862 (2017).</li><li>Hunt, N. J., Kang, S. W. S., Lockwood, G. P., Le Couteur, D. G., Cogger, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+aging+in+the+liver.">Hallmarks of aging in the liver.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 1151-1161 (2019).</li><li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+spectrum:+a+new+marker+in+HCC+classification.">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. 69 (2), 355-364 (2019).</li><li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li><li>Schwartz-Arad, D., Zajicek, G., Bartfeld, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+streaming+liver+IV:+DNA+content+of+the+hepatocyte+increases+with+its+age.">The streaming liver IV: DNA content of the hepatocyte increases with its age.</a> Liver. 9 (2), 93-99 (1989).</li><li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (6), 387-393 (1993).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Granja, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArchR+is+a+scalable+software+package+for+integrative+single-cell+chromatin+accessibility+analysis.">ArchR is a scalable software package for integrative single-cell chromatin accessibility analysis.</a> Nature Genetics. 53 (3), 403-411 (2021).</li><li>Bredikhin, D., Kats, I., Stegle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUON:+Multimodal+omics+analysis+framework.">MUON: Multimodal omics analysis framework.</a> Genome Biology. 23 (1), 42 (2022).</li><li>Velten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+temporal+and+spatial+patterns+of+variation+from+multimodal+data+using+MEFISTO.">Identifying temporal and spatial patterns of variation from multimodal data using MEFISTO.</a> Nature Methods. 19 (2), 179-186 (2022).</li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Het ontleden van de cellulaire samenstelling van de lever door eencellig of enkelkernig RNA-seq biedt een dieper inzicht in de ontwikkeling en progressie van leverziekten 3,4,5,24. Eencellige isolatie van levers is tijdrovend en vereist protocollen die harde mechanische of enzymatische dissociatie omvatten 25,26,27. Het is algemeen aanvaard dat elk weefsel een systematische evaluatie vereist om het optimale weefseldissociatieprotocol te bepalen, evenals een geschikte opslagmethode om fragiele celtypen of kernen te vangen28. Afhankelijk van de beschikbaarheid van weefsel, de ziekte van belang, het ontwikkelingsstadium of het modelorganisme, kan de voorbereiding van een suspensie met één kern voor downstream-verwerking een geschiktere methode zijn dan het gebruik van eencellige suspensies. Belangrijk is dat scRNA-seq en snRNA-seq in de lever een hoge correlatie hebben aangetoond tussen nucleair en cytoplasmatisch mRNA, wat suggereert dat beide benaderingen complementaire informatie presenteren 2,3,4,6,29.
Dit artikel biedt een gestandaardiseerde, robuuste en reproduceerbare single-nucleus isolatie van bevroren, gearchiveerde levermonsters van muizen en andere soorten, waaronder mensen en makaken. Deze methode kan worden gebruikt voor wild-type muizen gevoed met chow en een vetrijk dieet (HFD) en voor muismodellen van leverfibrose met behulp van zowel goed op platen gebaseerde als op druppels gebaseerde single-nucleus genomische benaderingen6. Deze methode is gebaseerd op het protocol dat oorspronkelijk is beschreven voor hersenweefsel door Krishnaswami et al.30 met aanvullende aanpassingen op maat voor flash-frozen lever. Optimale homogenisatie bevrijdt de meeste kernen uit het weefsel zonder de integriteit van het kernmembraan negatief te beïnvloeden. Overdouncing kan echter de fragiele kernen beschadigen en hun algehele kwaliteit verminderen. Jonge en /of vette levers hebben meestal slechts 5 slagen nodig met stamper A en 10 slagen met stamper B, terwijl oude en / of fibrotische levers 15 slagen met stamper B nodig hebben, maar niet meer. Het wordt daarom niet aanbevolen om meer slagen uit te voeren dan de hier aangegeven nummers. Overdouncing kan de kwaliteit van de single-nucleus suspensie negatief beïnvloeden en de hoeveelheid omgevings-RNA verhogen. Vervolgens kan dit leiden tot de noodzaak om aanvullende computationele filterstappen uit te voeren tijdens de downstream data-analyses.
Het hier gepresenteerde protocol is veelzijdig en kan worden aangepast aan verschillende leveraandoeningen bij jonge (3 maanden) en oude (24 maanden) muizen. Omdat we ontdekten dat een groter deel van de lever nodig is voor oude, HFD- en fibrotische weefsels, kan de grootte van het weefsel dat beschikbaar is voor verwerking een beperking vormen voor sommige gebruikers met kleinere hoeveelheden biologisch uitgangsmateriaal. Gradiëntzuivering wordt echter sterk aanbevolen voor onmiddellijke monsterverwerking met op druppels gebaseerde genomische assays. Als de kernen FACS-gesorteerd moeten worden in 96-/384-putplaten voor goed onderbouwde testen, kan gradiëntzuivering worden weggelaten. We moedigen gebruikers aan om nog steeds de gradiëntzuivering uit te voeren als er voldoende weefselmonster is om de aanbevolen kernconcentratie voor FACS-sortering te verkrijgen (d.w.z. ~ 1 × 105 kernen / ml).
De lever wordt gekenmerkt door de polyploïde aard van hepatocyten9, maar de rol van hepatocyten ploïdie in normale fysiologie en ziekte is nog niet duidelijk. Er is een groeiend aantal aanwijzingen dat ploïdie genomische variabiliteit biedt31, en het is bekend dat ploïdie toeneemt met de leeftijdvan 32,33 jaar. De verrijking van mononucleated tetraploïde hepatocyten is echter ook klinisch geassocieerd met een slechte prognose bij humaan hepatocellulair carcinoom (HCC)34. Evenzo zijn veranderingen in hepatocyten ploïdiespiegels gekoppeld aan verouderingsgerelateerde chronische leverziekten zoals niet-alcoholische leververvetting (NAFLD)35,36,37. Ploïdie is de voorwaarde van het bezit van meer dan twee kopieën van het genoom, die kunnen worden onderzocht door de genoominhoud te kleuren met een DNA-kleurstof zoals Hoechst38. Hoechstkleurstof, die voorafgaand aan de extractie aan het HB wordt toegevoegd, labelt alle kernen tijdens het isolatieprotocol. Dit maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen diploïde en polyploïde kernen op basis van hun DNA-gehalte wanneer ze worden geëxciteerd door een UV(350 nm) of violette (450 nm) laser op een flowcytometrie-instrument. Met de gepresenteerde gatingstrategie kunnen 2n, 4n, 8n en hogere niveaus van hepatocyten ploïdie worden onderzocht in bevroren, gearchiveerde levers om de rol van cellulaire heterogeniteit in weefselfunctie beter te begrijpen1 (figuur 3A). Bovendien kan de nucleaire morfologie, inclusief de grootte en het volume, worden gekwantificeerd met behulp van imaging flowcytometrie om veranderingen in de kerngrootte te correleren met veranderingen in het totale aantal tellingen of het aantal genen, afhankelijk van het ploïdieniveau (figuur 3B, C).
Multimodale omics-meting biedt de mogelijkheid om meerdere lagen van genomische organisatie tegelijkertijd te onderzoeken. De gezamenlijke RNA + ATAC multiomics-benadering maakt het onderzoek van stroomopwaartse regulatoren en downstream metabole genen mogelijk, wat een uitgebreide benadering biedt voor het bestuderen van transcriptionele netwerken en de chromatine-architectuur geassocieerd met de leverfunctie bij de eencellige resolutie. Bovendien, met de vooruitgang in computationele methoden die rekening kunnen houden met gegevensspaarheid en de vermindering van sequencingkosten, pioniert single-cell multiomics met de beoordeling van meerdere modaliteiten uit dezelfde cel. Dit single-nucleus isolatieprotocol is compatibel met de individuele en gezamenlijke beoordeling van expressie- en chromatinegegevenssets. We hebben standaardpijplijnen gebruikt die zijn opgesteld door Stuart et al.23 (Signac-pakket) om de kwaliteit van de gegevens te illustreren, terwijl verschillende beschikbare en alternatieve computationele methoden gemakkelijk kunnen worden toegepast voor downstream-analyses 23,39,40,41.
Over het algemeen maakt single-nucleus multiomics het onderzoek mogelijk van bio-gearchiveerde, FF-muis-, menselijke en niet-menselijke leverweefsels van primaten met behulp van een zeer kleine hoeveelheid uitgangsmonstermateriaal door het hier gepresenteerde kernextractieprotocol te implementeren. Dit onschatbare hulpmiddel zal leverbiologen in staat stellen om zowel genexpressie als chromatinetoegankelijkheid te onderzoeken in de context van verschillende leverpathologieën. Bovendien kunnen verschillende niveaus van hepatocyten ploïdie en de resulterende aanpassing van genexpressie afhankelijk van hun locatie in de leverlob hun rol in leverpathologieën onthullen. Daarom verwachten we dat het onderzoek naar cellulaire heterogeniteit nieuwe mogelijkheden zal bieden voor de ontwikkeling van precisiegeneeskunde en gerichte interventies tegen ziekten zoals HCC en NAFLD.

Eencellige genomica wordt snel een essentiële methodologie om de leverfunctie te bestuderen en de impact van cellulaire heterogeniteit op gezondheids- en ziekteomstandighedente beoordelen 1. De snelle ontwikkeling van "multiomics" voor het gelijktijdig meten van verschillende informatielagen en de parallelle uitbreiding van robuuste computationele pijplijnen maakt de weg vrij voor de ontdekking van voorheen onbekende celtypen en subtypen in de normale en zieke lever2.
De mogelijkheid om biobanken en gearchiveerde bevroren monsters te verkennen, heeft de mogelijkheden om de rol van niet-parenchymale cellen 3,4,5 opnieuw te bekijken en te ontdekken en de rol van polyploïde hepatocyten tijdens veroudering en bij chronische ziekten te onderzoekenaanzienlijk vergroot 6,7,8,9 . Daarom beschrijft dit artikel een robuust en reproduceerbaar single-nucleus isolatieprotocol voor flash-frozen (FF) gearchiveerde levers dat compatibel is met downstream single-nucleus RNA-sequencing en ATAC-sequencing, evenals met multimodale omics (joint RNA-seq en ATAC-seq) (figuur 1).
Deze workflow maakt het mogelijk om het transcriptoom en de chromatinetoegankelijkheid van alle celtypen in de lever te onderzoeken, onafhankelijk van de celgrootte of kwetsbaarheid, in enzymatische dissociatieprotocollen. Het kan worden uitgevoerd met kleine weefselsecties (15-30 mg of 5-10 mm3) van kostbare menselijke monsters of transgene muizen. Het bepalen van de hoge zuiverheid van de kernisolatie omvat de kwantificering en meting van de nucleaire grootte, die kan correleren met verhoogde celgrootte en senescentie 10,11, en deze zuiverheid is relevant voor de analyse van zowel hepatocyte ploïdie12 als celgrootte-afhankelijke transcriptionele mechanismen 11,13,14,15 . Bovendien behouden kernen geïsoleerd uit bevroren levers waardevolle informatie over leverzonatie. De workflow en weefselverzameling maken de validatie mogelijk van single-cell genomics-gegevens of verdere aanvullende analyses, zoals immunohistochemie of ruimtelijke transcriptomica van hetzelfde weefsel en hetzelfde individu. Daarom kan deze aanpak worden toegepast op meerdere leverziekteaandoeningen en systematisch en betrouwbaar modelorganismen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20 - 5 mL</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive PCR film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Sorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000619</td>
			<td>Use chilled at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Kit v3.1, 4 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) 1 M solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td>Make 1 mM stock solution and use at 1 &#181;M final concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA AWAY Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10223471</td>
			<td>Wipe surfaces and pipettes before start of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16628742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16638742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (EB) - 250 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13527550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13518470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade - 100 mL&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10517694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters 50 &#181;m, sterile&#160;&#160;</td>
			<td>SYSMEX PARTEC - CELLTRICS</td>
			<td>04-004-2327</td>
			<td>Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) - 1 L</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP3905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herenz Heinz ABS Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen TE Buffer - 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11568846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2 M), RNase-free, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M), 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10209104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10733087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#246;rser 2 mL DOUNCE</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH</td>
			<td>9651632</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td>Or any other strip and tube mini centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Hemocytometer</td>
			<td>OMNILAB&#160; LABORZENTRUM</td>
			<td>5435293</td>
			<td>Visualize and count nuclei under microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips RT LTS 1000 &#181;L, Wide-O</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30389218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pistill &#34;A&#34; 2 mL</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH&#160;</td>
			<td>9651621</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pistill &#34;B&#34; 2 mL</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH</td>
			<td>9651627</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10579691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10634141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10100151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector RNase inhibitor - 2,000 U</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3335399001</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-based RNase Inhibitor SUPERase&#8226;In (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Clontech Takara</td>
			<td>2313B</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free microfuge tubes - 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Wipe surfaces and pipettes before start of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIselect - 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318</td>
			<td>Aliquot and store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, 500 g</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td>Make a 1 M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11798343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI (1M), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10671652</td>
			<td>Make 10% stock solution. Keep at 4 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11538886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex- Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-1372</td>
			<td>Or any other type of vortex</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of nuclei from flash-frozen liver tissue for single-cell multiomics

De lever is een complex en heterogeen weefsel dat verantwoordelijk is voor het uitvoeren van vele kritieke fysiologische functies, zoals het behoud van energiehomeostase en het metabolisme van xenobiotica, onder anderen. Deze taken worden uitgevoerd door een nauwe coördinatie tussen leverparenchymale en niet-parenchymale cellen. Bovendien zijn verschillende metabolische activiteiten beperkt tot specifieke gebieden van de leverlobben - een fenomeen dat leverzonatie wordt genoemd. Recente ontwikkelingen in single-cell sequencing-technologieën hebben onderzoekers in staat gesteld om weefselheterogeniteit met een eencellige resolutie te onderzoeken. In veel complexe weefsels, waaronder de lever, kunnen harde enzymatische en / of mechanische dissociatieprotocollen de levensvatbaarheid of de kwaliteit van de eencellige suspensies die nodig zijn om dit orgaan uitgebreid te karakteriseren in gezondheid en ziekte negatief beïnvloeden.
Dit artikel beschrijft een robuust en reproduceerbaar protocol voor het isoleren van kernen uit bevroren, gearchiveerde leverweefsels. Deze methode levert hoogwaardige kernen op die compatibel zijn met downstream, single-cell omics-benaderingen, waaronder single-nucleus RNA-seq, assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing (ATAC-seq), evenals multimodale omics (joint RNA-seq en ATAC-seq). Deze methode is met succes gebruikt voor de isolatie van kernen uit gezonde en zieke menselijke, muis- en niet-menselijke ingevroren levermonsters van primaten. Deze benadering maakt de onbevooroordeelde isolatie van alle belangrijke celtypen in de lever mogelijk en biedt daarom een robuuste methodologie voor het bestuderen van de lever met de eencellige resolutie.

Deze workflow voor single-nucleus isolatie van bevroren levermonsters is op maat gemaakt voor single-nucleus multiomics en is gebaseerd op drie hoofdstappen, die kunnen worden samengevat als i) monsterverzameling voor de parallelle analyse van cellulaire heterogeniteit en weefselarchitectuur, ii) single-nucleus suspensie en iii) single-nucleus multiomics (figuur 1 ). De geëxtraheerde levers worden ontleed van geëuthanaseerde muizen en in stukken gesneden voor histologische inspectie voor paraffine-inbedding, cryosectie of beide. Andere gesneden stukken worden onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof voor downstream, single-nucleus isolatie voor multiomics-analyses. Dit systeem van weefselverzameling stelt de gebruiker in staat om de single-nucleus omics-gegevens op weefselsecties van hetzelfde individu verder te valideren, waardoor de dataset indien nodig wordt aangevuld met ruimtelijke transcriptomica of met immunohistochemische analyses.
Het microscopisch onderzoek van de kernen geëxtraheerd uit bevroren levers met de hier beschreven methode laat zien dat de dichtheidsgradiënt centrifugatiestap de verwijdering van ongewenst cellulair en weefselafval aanzienlijk vergemakkelijkt (figuur 2C, D). Bovendien behoudt deze methodologie alle niveaus van ploïdie, die kunnen worden gevalideerd en gekwantificeerd door cytometrische analyses (figuur 3).
Om de prestaties van dit protocol verder te valideren, hebben we druppelgebaseerde snRNA-seq uitgevoerd op ongesorteerde en FACS-gesorteerde kernen en de gegevens na de Seurat-pijplijn geanalyseerd. Kortom, de geëxtraheerde enkele kernen werden bereid voor druppelgebaseerde snRNA-seq zoals eerder beschreven19. Voor de snRNA-seq van 2n en 4n kernen of hogere niveaus van ploïdie werden 11 cycli gebruikt voor de cDNA-amplificatiestap en 10 cycli voor de uiteindelijke genexpressiebibliotheekconstructie. De resulterende bibliotheken werden gesequenced tot een leesdiepte van ~ 25.000-39.000 gemiddelde leeswaarden per kern. De verkregen single nuclei reads werden in kaart gebracht op het GRCm39/mm39 muisgenoom. Bij het uitvoeren van de voorbewerkingspijplijn werd het commando --include-intron toegevoegd om de inclusie en kwantificering van het niet-gesplitste boodschapper-RNA (mRNA) in de kernen vast te stellen. Het EmptyDrops-algoritme dat in de aligner is opgenomen, filterde de lege druppels eruit en verwijderde deze.
Het R-pakket Seurat (versie 4.1.1) werd gebruikt om kwaliteitscontrole (QC) -statistieken te berekenen met behulp van de unieke moleculaire identificatie (UMI) telmatrix zoals uitgevoerd door de snRNA-seq-analysepijplijn. Tellingen met minder dan 100 kenmerken (genen) en minder dan 10 cellen werden verwijderd. De kernen werden gefilterd volgens geïdentificeerde QC-drempels: minimum aantal genen = 200 en maximaal aantal genen = 8.000, mitochondriale fractie <1% en ribosomale fractie <2%. De top 3.000 zeer variabele genen (HVG's) werden gebruikt voor de principal component analysis (PCA), zoals geïmplementeerd in Seurat. Op grafieken gebaseerde clustering werd uitgevoerd na het invoeren van de top 15 pc-dimensies die het resultaat waren van de PCA-analyse. Om de cellen te clusteren, pasten we de modulariteitsoptimalisatietechniek (Louvain-algoritme) toe met een resolutieparameter ingesteld op 0,5. Om deze dataset te visualiseren en te verkennen, hebben we niet-lineaire dimensionale reductie uitgevoerd, namelijk Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). De identiteit van elk cluster werd toegewezen op basis van voorkennis van de markergenen 6,20,21.
Figuur 4A toont hoogwaardige statistieken van de gegevens die zijn verkregen met behulp van deze methode van kernextractie. UMAP vertegenwoordigt het aantal tellingen in alle kernen en de belangrijkste celtypen die alleen met vertrouwen kunnen worden geïdentificeerd met het nucleaire transcriptoom en relatief ondiepe sequencing (~ 25.000-40.000 gemiddelde reads per cel) (figuur 4B). Deze benadering maakt het onderzoek mogelijk van leverspecifieke transcriptiefactoren zoals Hnf4a, Mlxipl en Ppara, evenals downstream doelgenen die betrokken zijn bij het metabolisme van xenobiotica (d.w.z. Cyp2e1 en Cyp2f2) (figuur 4C). Van belang is dat de geëxtraheerde kernen kritische informatie over leverzonatie behielden, zoals blijkt uit het complementaire patroon van kenmerkgenen zoals de pericentrale Cyp2e1 en de periportal Cyp2f2 (figuur 4C).
We beoordeelden verder de compatibiliteit van de ongesorteerde kernen geëxtraheerd met behulp van deze methode met nieuwere multiomics-assays voor de gelijktijdige profilering van het epigenomische landschap (ATAC) en genexpressie (RNA) in dezelfde enkele kernen18. We hebben de incubatietijd van de kernlysis geoptimaliseerd tot 5 minuten voorafgaand aan de transpositie. De sequencingbibliotheken werden geconstrueerd door zes PCR-cycli uit te voeren voor de cDNA-voorversterking. Uit het voorgeïnmplificeerde monster werd 35 μL genomen en verder versterkt door 15 PCR-cycli voor monsterindexering om de genexpressiebibliotheek te construeren. Een representatief elektroferogram van het cDNA-spoor is weergegeven in figuur 5A (boven). Voor de constructie van de ATAC-bibliotheken werd 40 μL voorgevuld monster gebruikt en uitgevoerd voor nog eens zes PCR-cycli voor monsterindexering, met het representatieve elektroferogram van het DNA-spoor weergegeven in figuur 5A (onder). De resulterende genexpressiebibliotheek (RNA) werd gesequenced tot een diepte van 44.600 reads per kern en de ATAC-bibliotheek tot een diepte van 43.500 reads per nucleus (figuur 5B).
Vergelijkbaar met het hierboven beschreven, single-modality, droplet-based sequencing protocol, read mapping, alignment, empty drop removal en fragment counting werden uitgevoerd volgens standaardrichtlijnen, zoals eerder beschreven, met behulp van het GRCm39/mm39 referentiegenoom18. Met behulp van de Seurat- en Signac-pakketten22 voerden we een "weighted nearest neighbor" (WNN) -analyse uit voor meerdere metingen van beide modaliteiten (RNA + ATAC) (figuur 5C), waardoor we zowel de grote als de kleine leverceltypen konden identificeren en annoteren zonder prominente vooroordelen als gevolg van celgrootte of nucleaire kwetsbaarheid (figuur 5D). De pijplijn, zoals gepubliceerd door het laboratorium van Satija22,23, omvat standaard QC-stappen-voorverwerking en dimensionale reductie-uitgevoerd op beide assays onafhankelijk van elkaar. Om een goede weergave te hebben van de gewogen combinatie van de RNA-seq- en ATAC-seq-modaliteiten, werd de WNN-grafiek uitgezet en gebruikt voor UMAP-visualisatie, clustering en annotatie op basis van eerder geïdentificeerde markergenen 6,20,21. Vergelijkbaar met de testen met behulp van enkele modaliteit, detecteerden we ook upstream transcriptionele regulatoren (Hnf4a, Ppara, Mlxipl) en kenmerkende genen van leverzonatie (Hamp, Cyp2e1 en Cyp2f2) (figuur 5E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig01.jpg"> Figuur 1: Experimenteel overzicht, workflow en eencellige genomische toepassingen. (A) Illustratieve weergave van weefselbemonstering voor histologie (links worden drie secties geselecteerd voor paraffine-inbedding en / of cryosectioning), flash-frozen weefselverzameling voor eencellige genomica (midden) en representatieve immunohistochemie en immunofluorescentieanalyses (rechts); schaalbalk = 100 μm. (B) Kritische stappen voor hoogwaardige single-nucleus suspensies. (C) De kernsuspensies kunnen op een 10x chroomchip worden geladen of worden gebruikt voor FACS-sortering en op platen gebaseerde benaderingen. Afkortingen: H&E = hematoxyline en eosine; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig02.jpg"> Figuur 2: Leverdissectie en homogenisatie van dounceglasweefsel. (A) Representatieve muizenlever van een 3 maanden oude C57BL6/J-muis (links); de leversectie die wordt gebruikt voor de isolaties met één kern vóór (midden) en na het hakken van het weefsel met het scalpel (rechts). Schaalstaven = 1 cm. (B) Illustratieve afbeeldingen van 2 ml Dounce-glas homogenisatie vóór slagen met "losse" stamper A (links) en na "strakke" stamper B (rechts). Monitoring van de weefselhomogenisatie met behulp van een hemocytometer (C) vóór gradiëntcentrifugatie en (D) na gradiëntcentrifugatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig03.jpg"> Figuur 3: Fluorescentie-geactiveerde celsortering en imaging flowcytometrie voor high-throughput kernkarakterisering. (A) Gating-strategie voor single-nucleus FACS-sortering in een plaat voor de ondervraging van verschillende niveaus van ploïdie. Strooipoort op basis van het voorwaartse strooigebied versus het zijverstrooiingsgebied dat is ingesteld om puin uit te sluiten; kernenpoort gebaseerd op Hoechst-Hoogte versus Hoechst-Gebied met meerdere kernenpopulaties; singlets gate gebaseerd op Hoechst-Width versus Hoechst-A set voor doublet discriminatie; het Hoechst-A histogram maakt de visualisatie van het kernen ploïdieprofiel mogelijk. (B) Representatieve beeldvorming cytometrie kwantificering van alle gebeurtenissen (links) en enkele (rechts) gebeurtenissen, met diploïde en tetraploïde kernen. (C) Brightfield- en Hoechst-beelden van 2n- en 4n-kernen en hun kwantificering met behulp van beeldvormingscytometrie. Afkortingen: FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; FSC-A = voorwaarts strooigebied; SSC-A = zijspreidingsgebied; Hoechst-H = Hoechst-Hoogte; Hoechst-A = Hoechst-gebied; Hoechst-W = Hoechst-Breedte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig04.jpg"> Figuur 4: Diepe karakterisering van hepatocyten ploïdie met snRNA-seq. (A) Vioolplots met het aantal genen, tellingen, percentage mitochondriale genen en percentage ribosomale genen gedetecteerd. (B) UMAP die de celtypen demonstreert die zijn gedetecteerd met behulp van snRNA-seq (links), met de kwantificering uitgedrukt in percentage kernen (rechts). (C) UMAP illustreert het aantal tellingen en geeft de expressie van hepatocyt-specifieke genen aan. Alle kernen (bovenste rij), 2n kernen (middelste rij) en 4n kernen (onderste rij). Afkortingen: snRNA-seq = single-nucleus RNA-seq; UMAP = Uniforme Manifold Benadering en Projectie; Mitoc. = mitochondriale genen; Ribos. = ribosomale genen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig05.jpg"> Figuur 5: Kwaliteitscontrole en analyse van multiomics (joint RNA-seq en ATAC-seq) uit bevroren, gearchiveerde jonge levers. (A) Representatieve automatische elektroforetische sporen verkregen na de multinomische pijplijn met het molecuulgewichtproduct na cDNA-synthese en ATAC. (B) Vioolplot die het aantal tellingen voor ATAC-seq, RNA-seq, het percentage mitochondriale genen en het percentage ribosomale genen voor en na filtering aantoont. (C) UMAP toont de genexpressie van RNA-seq (links), ATAC-seq (midden) en gewrichtsmodaliteiten-RNA-seq en ATAC-seq (rechts). (D) Verschillende celtypen worden geannoteerd in verschillende kleuren, met de expressie van geïndiceerde hepatocyt-specifieke genen. (E) Kenmerkenpolitie die de clusterspecifieke expressie van de aangegeven genen in de aangegeven celtypen weergeeft. Afkortingen: ATAC-seq = assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing; Mid Hep = mid-zonale hepatocyten; Endo = endotheelcellen; PV Hep = periportale hepatocyten; Non-z Hep = niet-gezoneerde hepatocyten; CV Hep = pericentrale hepatocyten; Kup & DC = Kupffer & dendritische cellen; SC = stellaatcellen, Neu = neutrofielen; Chol = cholangiocyten; Mitoc. = mitochondriale genen; Ribos. = ribosomale genen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Reagens</td>
			<td>Voorraad</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>15 ml</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">(A) Iodixanol Medium (IDM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">250 mM sucrose</td>
			<td>1m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">150 mM KCl</td>
			<td>2m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3,75 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">30 mM MgCl2</td>
			<td>1m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">60 mM Tris buffer pH 8,0</td>
			<td>1m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Ultrapuur RNase vrij water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>29,25 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">B) 50 % IDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Iodixanol</td>
			<td>60%</td>
			<td></td>
			<td>12,5 ml</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">IDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,5 ml</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">(C) 29% IDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Iodixanol</td>
			<td>60%</td>
			<td></td>
			<td>7,25 ml</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">IDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7,75 ml</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">(D) Kernisolatie Medium-1 (NIM-1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">250 mM sucrose</td>
			<td>1m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">25 mM KCl</td>
			<td>2m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0,625 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5 mM MgCl2</td>
			<td>1m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0,25 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 mM Tris buffer pH 8,0</td>
			<td>1m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Ultrapuur Rnase-vrij water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>36.125 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">(E) Kernen Isolatie Medium-2 (NIM-2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">NIM-1 buffer</td>
			<td></td>
			<td>9,99 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>0,01 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Protease Inhibitor tablet (EDTA-vrij)</td>
			<td>1</td>
			<td>1 tablet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">F) Homogenisatiebuffer (HB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">NIM-2 buffer</td>
			<td></td>
			<td>9,697 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Recombinant RNase-remmer</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">RNAseremmer op basis van eiwitten (SUPERase•IN)</td>
			<td>20 U/μL</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">0,1% Triton-X</td>
			<td>10%</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">3 μg/ml Hoechst 33342</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>0,003 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">(G) Opslagbuffer voor kernen (NSB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">166.5 mM sucrose</td>
			<td>1m</td>
			<td>1.665 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">5 mM MgCl2</td>
			<td>1m</td>
			<td>0,05 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 mM Tris pH 8,0</td>
			<td>1m</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Recombinant RNase-remmer</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Op eiwitten gebaseerde RNase-remmer (SUPERase•IN) *</td>
			<td>20 U/μL</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Ultrapuur RNase vrij water</td>
			<td></td>
			<td>8.085 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">* Optioneel (alleen voor FACS-sortering)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Oplossingsrecepten. (A) Bereiding van iodixanol medium (IDM); B) 50% verdunning van iodixanoloplossing; C) 29% verdunning van iodixanoloplossing. (D) Voorbereiding van kernisolatiemedium-1 (NIM-1). (E) Voorbereiding van kernen isolatie medium-2 (NIM-2). (F) Bereiding van homogenisatiebuffer (HB). (G) Bereiding van de opslagbuffer van kernen (NSB).

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics at JoVE.com

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren van kernen uit flash-bevroren, gearchiveerde leverweefsels voor single-nucleus RNA-seq, ATAC-seq en gezamenlijke multiomics (RNA-seq en ATAC-seq).

Isolatie van kernen uit flash-bevroren leverweefsel voor eencellige multiomics

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Dit eenvoudige en reproduceerbare protocol werd met succes gebruikt om hoogwaardige kernen te isoleren van gezonde en zieke muismodellevers, evenals levers van menselijke en niet-menselijke primaten. Deze methode vereist slechts een kleine hoeveelheid bevroren weefselmateriaal. Ook geeft dichtheidsgraad-incentivisatie een zeer schone nucleaire suspensie met alle belangrijke celtypen in de lever bewaard in de uiteindelijke nucleaire voorbereiding.Deze methode van kernextractie kan worden gebruikt in bio-gearchiveerde menselijke levermonsters die worden opgeslagen in biobanken. Begin de weefselhomogenisatie door een blokstuk van 2230 milligram of vijf millimeter uit een leverweefsel te snijden dat in de petrischaal op droogijs is geplaatst met behulp van een vooraf gekoeld scalpel. Breng de petrischaal onmiddellijk over op nat ijs en voeg een milliliter homogenisatiebuffer toe.Gebruik het koude scalpel om het weefsel zoveel mogelijk te hakken, zodat het kan aspirateren met een een milliliter brede openingpunt. Verzamel de weefselsuspensie en breng deze over in een voorgekoelde twee milliliter glazen dounce homogenisator. Was de petrischaal met een extra homogenisatiebuffer van 0,521 milliliter en verzamel alle resterende stukjes weefsel terwijl alles op ijs wordt bewaard.Voer langzaam en voorzichtig vijf slagen uit met losse stamper A op ijs zonder bubbels te creëren. Zorg ervoor dat de stamper bij elke slag voorzichtig van de bovenkant naar de onderkant van de homogenisator beweegt. Voer vervolgens 10 tot 15 langzame slagen uit met strakke stamper B op ijs zonder bubbels te creëren.Als u klaar bent, filtert u het homogenaat door een 50 micrometer celzeef terwijl u het overbrengt in een voorgekoelde buis van 1,5 milliliter. Gebruik meer dan één filter of buis voor homogenaten die een grote hoeveelheid bindweefselklonten bevatten. Spoel de homogenisator en de filters af met een extra 0,521 milliliter homogenisatiebuffer om alle weefselhomogenaten grondig te verzamelen vóór de dichtheidsgradiëntcentrifugatie.Voor dichtheidsgradiëntcentrifugatie centrifugeert u het gefilterde homogenaat in een voorgekoelde centrifuge met vaste hoek bij 1000 G gedurende acht minuten bij vier graden Celsius. Terwijl het monster wordt gecentrifugeerd, bereidt u een buis van 1,5 milliliter met 250 microliter 50% iodixanolverdunning en een buis van twee milliliter met 500 microliter 29% iodixanolverdunning. Leg beide buisjes op ijs.Vervolgens uit de centrifugesuspensie het supernatant zuigen zonder de pellet te verstoren met behulp van een vacuümpomp. Suspensie de pellet opnieuw in 250 microliter homogenisatiebuffer met behulp van de één milliliter brede opening pipetpunt. Breng vervolgens 250 microliter van de kernsuspensie over in een voorgekoelde buis van 1,5 milliliter met 250 microliter 50% jodidinenol en meng deze voorzichtig en grondig om een 25% iodixanol-kernenuspensie te genereren.Breng vervolgens 500 microliter van de 25% iodixanol-kernenuspensie over in een voorgekoelde buis milliliterbuis met 500 microliter 29% iodixanolverdunning. Centrifugeer de buis in een voorgekoelde zwenkbakcentrifuge op 12.500 G gedurende 20 minuten, met de pauze uitgeschakeld. Net voordat de centrifugatiestap is voltooid, voegt u de RNA-remmers toe aan de kernopslagbuffer of NSB terwijl u doorgaat naar de RNA-sequencingpijplijnen met één kern.Na voltooiing van de centrifugatie, aspirateer het supernatant zonder de pellet te verstoren met behulp van een vacuümpomp. Suspensie de pellet voorzichtig opnieuw in 100 tot 300 microliter NSB met behulp van de één milliliter brede opening pippet tip en breng de kernen suspensie over in een schone voorgekoelde buis van 1,5 milliliter. Tel de kernen met behulp van trypan blue oplossing met een handmatige hemocytometer en gebruik onmiddellijk de verkregen kernensuspensie voor de single nucleus genomics assay.Voor flowcytometrie gebaseerde celsortering filtert u de kernensuspensie door een filter van 50 micrometer in een voorgekoelde vijf milliliter fluorescentie geactiveerde celsortering of faxbuis. Gebruik een flowcytometriesorteerder uitgerust met een mondstuk van 100 micrometer en laad de faxbuis op de sorteerder voordat u een voorbeeld van het monster bekijkt. Stel de gatingstrategie in voor het sorteren van kernen, te beginnen met een spreidingspoort door het voorwaartse spreidingsgebied uit te zetten versus het zijverstrooiingsgebied, gevolgd door hoaxed hoogte versus hoaxed gebied, en vervolgens hoaxed breedte versus hoaxed gebied.Visualiseer het ploïdieprofiel van de kernen op het hoaxed area histogram. Voor het sorteren in 96 of 384 putplaten, stelt u de druppelvertraging in en optimaliseert u de plaatuitlijning met behulp van de colormetrische methode. Stel de monsterkoeling en plaathouder in op vier graden Celsius met de monsterrotatie ingeschakeld bij 300 RPM.Sorteer de afzonderlijke kernen met een monsterconcentratie van ongeveer één keer 10 tot de vijfde kernen per milliliter met een stroomsnelheid van 200 tot 500 gebeurtenissen per seconde. Het microscopisch onderzoek van de kernen geëxtraheerd uit bevroren levers toonde aan dat de dichtheidsgradiëntcentrifugatiestap de verwijdering van ongewenst cellulair en weefselafval aanzienlijk vergemakkelijkte. Deze methodologie behield alle niveaus van ploïdie, die werd gevalideerd en gekwantificeerd door cytometrische analyse.Hoge kwaliteit statistieken werden waargenomen uit de gegevens verkregen met behulp van kernen extractie. Uniforme variëteitsbenadering en projectie vertegenwoordigden het aantal tellingen over alle kernen en de belangrijkste celtypen, die met vertrouwen alleen kunnen worden geïdentificeerd met het nucleaire transcriptoom en de relatief ondiepe sequencing. Deze aanpak maakte het onderzoek mogelijk van leverspecifieke transcriptiefactoren en downstream doelgenen die betrokken zijn bij het metabolisme van xenobiotica.Het complementaire patroon van kenmerkende genen zoals de percentrale CYP2E1 en de periportale CYP2F2 toonde aan dat de geëxtraheerde kernen kritische informatie over leverdonatie behielden. De genexpressiebibliotheek van RNA werd gesequenced tot een diepte van 44.600 reads per kern en de ATAC-bibliotheek tot een diepte van 43.500 reads per nucleus. Een gewogen nearest neighbor-analyse uitgevoerd voor meerdere metingen van beide modaliteiten, RNA plus ATAC, met behulp van de Seurat- en Signac-pakketten maakte de identificatie en annotatie van de grote en kleine leverceltypen mogelijk zonder prominente vooroordelen vanwege celgrootte of nucleaire kwetsbaarheid.De upstream transcriptionele regulatoren en de kenmerkende genen van leverdonatie werden ook gedetecteerd in deze methode. Het is belangrijk om te voorkomen dat er te veel bubbels ontstaan tijdens de homogenisatie van down bij het op en neer bewegen van de stampers en om vast te houden aan het aantal slagen dat in het protocol wordt aangegeven.

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neuronale Kernen Isolatie van Human postmortaal hersenweefsel

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Generatie van de Single-celsuspensies van Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

-Affiniteit gebaseerde Isolatie van Tagged Kernen uit<em&gt; Drosophila</em&gt; Tissues voor de analyse van genexpressie

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Nuclei isolatie van hele weefsel met behulp van een wasmiddel en enzym-vrije methode

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Nuclei-isolatie van volwassen muizennier voor single-nucleus RNA-sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolatie, karakterisering en therapeutische toepassing van extracellulaire blaasjes uit gekweekte menselijke mesenchymale stamcellen

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Single-Cell Suspension Voorbereiding van Nile Tilapia Intestine voor Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Isolatie en transcriptoomanalyse van plantenceltypen

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Isolation and Profiling of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

Enhancing Drug Discovery - Development of Automated, Standardized Protocols for Nuclei Extraction from Frozen Tissues (Video) | JoVE

Een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol voor de isolatie van afzonderlijke kernen uit ingevroren zoogdierweefsels voor sequencing van één kern