Name: isolation of nuclei from flash-frozen liver tissue for single-cell multiomics
Uploaded: 2022-12-09T14:40:00
Duration: 9 min 9 s
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이 연구는 Helmholtz Pioneer Campus (M.S., K.Y., C.P.M.-J.)와 Institute of Computational Biology (C. T.-L.)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 또한 보조금 번호 JP20jm0610035 (C.P.M.-J.)에 따라 AMED의 지원을 받았습니다. HMGU (I. de la Rosa)의 핵심 유전체학 (I. de la Rosa)과 생물 정보학 (T. Walzthoeni) 지원, 특히 Xavier Pastor의 교육과지도에 감사드립니다. A. Feuchtinger, U. Buchholz, J. Bushe 및 HMGU 병리학 및 조직 분석 핵심 시설의 다른 모든 직원의 기술 및 과학적 지원과 J. Zorn, R. Erdelen, D. Würzinger, E-Streifen의 직원 및 지속적인 과학적 지원 및 토론에 대한 실험실 동물 서비스 핵심 시설에 감사드립니다. TranslaTUM(R. Mishra)과 DiaSorin Company(P. Rein)의 핵심 시설 세포 분석에 감사드립니다. 우리는 그의 기술 지원에 대해 Dr. I Deligiannis에게 감사드립니다. M. Hartman 박사, A. Schröder 박사 및 A. Barden (Helmholtz Pioneer Campus)은 법적, 관리 적 및 행정적 지원의 기본이었습니다.

모든 동물 실험은 독일 동물 복지법 및 어퍼 바이에른 정부의 규정에 따라 수행되었습니다. 동물 사육은 독일 동물 복지법 §11에 따라 승인되었으며 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었습니다.
1. 조직 준비
<ol><li>3개월 된 수컷 C57BL/6J 마우스를 자궁경부 탈구로 희생시켰다. 동물을 해부 보드에 놓고 핀으로 사지를 고정하고 복부를 70 % 에탄올로 소독하십시오.</li>
	<li>Treuting et al.16에서 권장하는대로 부검을 수행하십시오.<ol><li>복부를 흉곽까지 열고 간을 시각화하고 집게를 사용하여 소엽을 뚫지 않고 간을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
		<li>횡격막을 집게로 잡고 가위로 연결 조직을 제거하여 손상되지 않은 간을 추출하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>차가운 인산염 완충 식염수 (PBS)로 장기를 씻고 깨끗한 종이 타월로 두드려 말리고 간 소엽을 여러 조각으로 잘라 다른 목적으로 자릅니다 : 단일 핵 분리 및 다중오믹스를위한 FF; 파라핀 매립을 위한 파라포름알데히드 고정(10% PFA); 및/또는 추가 조직학적 분석을 위해 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 매립됩니다(그림 1A).</li>
	<li>간 조각을 냉동 바이알 또는 5mL 스크류 캡 튜브에 분취하고 즉시 액체 질소에서 급속 동결합니다. 다운스트림 단일 핵 다중오믹스 실험을 위해 냉동 간 샘플을 -80°C에 보관하십시오(그림 1B, C). 알림: 냉동 보존 된 조직은 수년간 -80 ° C에서 안전하게 보관할 수 있으며 사용하기 전에 항상 -80 ° C의 드라이 아이스로 운반해야합니다.</li>
</ol>2. 핵 분리
<ol><li>벤치탑 청소 및 버퍼 및 소모품 준비<ol><li>70% 에탄올 및 RNase 오염 제거 용액으로 작업용 벤치탑과 피펫을 세척하거나 전용 RNase가 없는 벤치탑 및 재료를 사용하십시오.</li>
		<li>아래 설명된 대로 스윙 버킷과 고정각 원심분리기, 1.5mL/2mL 튜브 및 멀티웰 플레이트를 모두 4°C로 사전 냉각합니다.</li>
		<li>조직 취급에 사용되는 RNase가 없는 일회용 핀셋, 일회용 멸균 메스 및 페트리 접시를 드라이아이스(-60°C)에서 미리 냉각합니다.</li>
		<li>Dounce 유리 균질화기와 유봉을 얼음 위에서 미리 냉각합니다(4°C). 얼음과의 직접적인 접촉 및 잠재적인 RNase 오염을 피하기 위해 각 유봉(A 및 B)을 5mL 튜브에 넣습니다.</li>
		<li>요오드 잔산 올 배지 (IDM) (표 1A)의 희석액 용액을 준비하고,이를 사용하여 60 % 요오드 잔올 스톡 밀도 구배 배지 (각각 표 1B 및 표 1C)의 50 % 및 29 % 희석을 만듭니다.</li>
		<li>모든 튜브를 미리 식히십시오. 처리 할 각 샘플에 대해 다음 튜브를 준비하십시오.<ol><li>3 개의 1.5mL 저 DNA 결합 튜브 (하나는 여과 된 조직 균질 액 용, 두 번째는 250 % 희석 된 50 μL의 iodixanol 용액 용, 세 번째는 깨끗한 핵 현탁액 용)를 준비합니다.</li>
			<li>밀도 구배 분리를 위해 29% 희석된 요오드딕산올 용액 500μL를 포함하는 2mL 둥근 바닥 튜브 1개를 준비합니다.</li>
			<li>핵 분리 배지-2(NIM-2) 및 균질화 완충액(HB)을 위한 15mL 원뿔형 튜브 1개를 준비합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>핵 분리 배지-1(NIM-1)(표 1D)을 준비하고, 이를 사용하여 NIM-2(표 1E)를 만들고, 이어서 HB(표 1F)를 만든다. 프로토콜에서 하기에 설명된 바와 같이 사용 직전에 두 RNAse 억제제를 모두 추가한다.</li>
		<li>표 1G에 기재된 바와 같이 핵 저장 완충액 (NSB)을 준비한다. 사용 직전에 재조합 RNAse 억제제를 추가하십시오. FACS 분류에 사용하기 전에 단백질 기반 RNAse 억제제를 NSB에 추가하십시오 (선택 사항).</li>
		<li>균질화기의 최적 세척 및 유지를 위해 조직 균질화 후 Dounce 균질화기 및 유봉을 담가 멸균수로 500mL 비커를 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>조직 균질화<ol><li>드라이 아이스의 페트리 접시 안에 미리 식힌 메스로 20-30mg (또는 5mm3) 티슈 조각을 자릅니다. 그런 다음 즉시 페트리 접시를 젖은 얼음(4°C)으로 옮깁니다. HB 1mL를 넣고 차가운 메스를 사용하여 1mL 넓은 오리피스 팁으로 쉽게 흡인할 수 있도록 조직을 최대한 다집니다. 알림: 모든 조직/핵 전달에는 항상 넓은 오리피스 팁을 사용하십시오. 대안으로, 멸균 플라스틱 커버에서 멸균 메스로 1mL 팁을 절단하여 넓은 오리피스를 생성할 수 있습니다(그림 2A).</li>
		<li>조직 현탁액을 수집하고, 이를 미리 냉각된 2 mL 유리 Dounce 균질화기로 옮긴다(그림 2B).</li>
		<li>추가 0.5-1mL의 HB로 페트리 접시를 씻고 모든 것을 얼음 위에 유지하면서 나머지 모든 티슈 조각을 수집합니다.</li>
		<li>얼음 위에 느슨한 유봉 A 로 천천히 조심스럽게 5 스트로크를하십시오. 유봉을 위아래로 당길 때 유봉의 비틀림 동작을 사용하여 거품을 만들지 마십시오. 유봉이 각 스트로크마다 균질 기의 상단에서 하단으로 조심스럽게 움직이는 지 확인하십시오.</li>
		<li>그 후, 얼음 위에 단단한 유봉 B 로 10-15 번의 느린 스트로크를 수행하십시오. 거품을 만들지 마십시오. 알림: 유봉 B 로 10 회 스트로크 후 현미경으로 핵을 육안으로 검사하여 더 많은 스트로크가 필요한지 확인하는 것이 좋습니다. 트리판 블루 염색(시료에 대한 트리판의 1:1 비율) 및 수동 혈구계(예: 10μL의 트리판 블루와 10μL의 핵 현탁액을 혼합하고 현미경 검사를 위해 혼합물 10μL를 사용; 그림 2C).</li>
		<li>균질액을 50μm 세포 스트레이너를 통해 여과하는 동시에 미리 냉각된 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 다량의 결합 조직 덩어리를 포함하는 균질액에 대해 하나 이상의 필터 및/또는 튜브를 사용하십시오.</li>
		<li>균질화기 및 추가 0.5-1 mL의 HB와 함께 사용된 필터를 헹구어 모든 조직 균질액을 완전히 수집한다. 밀도 구배 원심분리를 진행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>밀도 구배 원심분리<ol><li>여과된 균질액을 1,000 ×g의 사전 냉각된 고정각 원심분리기에서 4°C에서 8분 동안 원 심분리합니다.</li>
		<li>샘플이 회전하는 동안 50% 요오드 딕산올 희석액 250μL를 포함하는 1.5mL 튜브와 29% 요오드 희석액 500μL를 포함하는 2mL 튜브 1개를 준비합니다. 두 튜브를 얼음 위에 두십시오.</li>
		<li>원심분리 후, 진공 펌프를 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인한다. 참고: 수동 피펫팅을 사용하면 최종 핵 현탁액의 품질이 저하됩니다.</li>
		<li>1mL 와이드 오리피스 피펫 팁을 사용하여 250μL의 HB를 펠릿에 추가하고 매우 천천히 재현탁합니다.</li>
		<li>250μL의 핵 현탁액을 250μL의 50% 요오드 딕산올 희석액이 포함된 사전 냉각된 1.5mL 튜브에 옮기고 부드럽지만 완전히 혼합하여 25% 요오드 현탁액/핵 현탁액을 생성합니다.</li>
		<li>500μL의 25% 요오드딕사놀/핵 현탁액을 29% 요오드 희석액 500μL가 포함된 사전 냉각된 2mL 튜브로 옮깁니다. 참고: 500%/25% 요오드딕산올 현탁액 500μL는 29%/29% 요오드딕산올 혼합물이 명확한 상 분리를 나타내도록 500μL의 29% 요오드 잔올 용액 위에 부드럽게 증착되어야 합니다. 피펫 팁이 45° 각도로 배치된 튜브 벽의 측면을 사용하여 이 그래디언트 인터페이스를 만듭니다. 그때부터는이 그라데이션을 방해하지 않도록 튜브를 부드럽게 다루어야합니다.</li>
		<li>브레이크를 OFF로 설정한 상태에서 12,500g의 사전 냉각된 스윙 버킷 원심분리기에 튜브를 20 분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>원심분리 단계가 완료되기 직전에, scRNA-seq 파이프라인으로 진행할 때 RNAse 억제제를 NSB 버퍼에 첨가한다( 표 1G 참조).</li>
		<li>원심분리 후, 진공 펌프를 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인한다. 참고: 수동 피펫팅을 사용하면 최종 핵 현탁액의 품질이 저하됩니다.</li>
		<li>1mL 와이드 오리피스 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 100-300μL의 NSB에 부드럽게 재현탁하고 핵 현탁액을 깨끗하고 사전 냉각된 1.5mL 튜브에 옮깁니다.</li>
		<li>트리판 블루 용액(샘플에 대한 트리판의 1:1 비율) 및 수동 혈구계(예: 10μL의 트리판 블루와 10μL의 핵 현탁액을 혼합하고 계수를 위해 혼합물의 10μL를 사용; 그림 2D).</li>
		<li>수득된 핵 현탁액을 단일핵 유전체학 분석에 즉시 사용한다. 참고: NSB의 핵 현탁액은 흐름 및/또는 이미징 유세포분석에 의한 추가 분석을 위해 최대 1주일 동안 4°C에서 냉장 보관할 수 있지만 snRNA-seq 또는 snATAC-seq에 대해서는 보관할 수 없습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 간세포 배수성 프로파일링 또는 웰 기반 시퀀싱 접근법을 위한 핵 분류
<ol><li>유세포분석 기반 세포 분류의 경우 50μm 필터를 통해 핵 현탁액을 사전 냉각된 5mL FACS 튜브에 여과합니다.</li>
	<li>100μm 노즐이 장착된 유세포분석 분류기를 사용하십시오. FACS 튜브를 분류기에 넣고 샘플을 미리 봅니다.</li>
	<li>전방 산란 영역 대 측면 산란 영역(FSC-A/SSC-A)을 플로팅하여 산란 게이트부터 시작하여 Hoechst-높이 대 Hoechst-Area(핵 게이트), Hoechst-너비 대 Hoechst-Area(싱글 게이트 순)를 플로팅하여 핵 분류를 위한 게이팅 전략을 설정합니다. Hoechst-Area 히스토그램에서 핵 배수성 프로파일을 시각화합니다. 참고: 피크 해상도를 높이려면 Hoechst 채널(450/50)을 선형 스케일로 시각화합니다(그림 3A).</li>
	<li>96-/384-웰 플레이트로 분류하려면 액적 지연을설정하고 앞서 설명한 대로 벤지딘 기질-양 고추냉이 과산화효소(TMB-HRP)를 사용한 비색법을 사용하여 플레이트 정렬을 최적화합니다 6.</li>
	<li>시료 냉각과 플레이트 홀더를 모두 4°C에서 냉각하도록 설정하고 시료 회전을 300rpm으로 켭니다.</li>
	<li>~1 x 105 핵/mL의 샘플 농도와 200-500 이벤트/초의 유속으로 단일 핵을 분류합니다.</li>
</ol>4. 이미징 세포 분석에 의한 핵 매개 변수의 육안 검사 및 정량화 (옵션)
<ol><li>2 × 107 nuclei/mL의 농도로 50μL의 핵 현탁액을 포함하는 0.5mL 튜브를 로드합니다.</li>
	<li>종횡비 대 Hoechst 형광 채널을 기반으로 모든 이벤트 게이트를 설정하여 핵 배수성 프로파일을 시각화합니다(그림 3B).</li>
	<li>명시야(BF)와 Hoechst 형광 채널을 사용하여 40x 배율로 샘플을 획득합니다.</li>
	<li>명시야 측정 및 이미징 세포분석 소프트웨어를 사용한 Hoechst 형광 강도를 사용하여 2n 및 4n 핵을 검사하고 정량화합니다(그림 3C).</li>
</ol>5. 단일 핵 RNA-seq, ATAC-seq 또는 멀티옴 라이브러리 구성 및 시퀀싱
<ol><li>액적 기반 snRNA-seq 접근법의 경우, 자동화된 병렬 분할 및 분자 바코드(17)를 위해 정제된 핵 현탁액을 미세유체 장치에 직접 로딩한다.</li>
	<li>마이크로유체 실행이 단일-세포 분할 장치에서 완료된 후, 겔 비드-캡슐화된 핵을 수집하고, 인큐베이션하고, 제조자의 가이드라인17에 이전에 설명된 바와 같이 세척한다.</li>
	<li>다음 프로그램을 사용하여 cDNA 사전 증폭을 위해 11 개의 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 사이클을 수행하십시오 : 98 ° C에서 3 분, (98 ° C에서 15 초, 63 ° C에서 20 초, 및 72 ° C에서 1 분) x 11, 72 ° C에서 1 분, 4 ° C에서 유지. 제조업체17에 표시된 대로 최종 수리 및 A-테일링 단계 및 어댑터 결찰을 계속합니다. 후속 최종 유전자 발현 라이브러리 구축을 위해, 다음 프로그램을 사용하여 10 PCR 사이클을 수행한다: 98°C에서 45초, (98°C에서 20초, 54°C에서 30초, 72°C에서 20초) x 10, 72°C에서 1분, 및 4°C에서 유지.</li>
	<li>획득 된 라이브러리를 ~ 20,000-50,000 개의 핵 당 평균 판독 깊이로 시퀀싱합니다.</li>
	<li>관절 다중오믹스(RNA + ATAC) 액적 기반 시퀀싱의 경우 간 핵을 용해 완충액에서 5분 동안 배양한 다음 앞서 설명한 대로 1시간 동안 태그를 지정합니다.</li>
	<li>태그된 핵을 미세유체 장치에 직접 로딩하여 자동화된 병렬 분할 및 분자 바코딩을 수행합니다.</li>
	<li>마이크로유체 실행이 완료된 후, 겔 비드-캡슐화된 핵을 수집하고, 인큐베이션하고, 제조기(18)에 의해 기재된 바와 같이 세척한다.</li>
	<li>하기 프로그램을 사용하여 cDNA 예비증폭 단계에 대해 6회의 PCR 사이클을 수행한다: 72°C에서 5분, 98°C에서 3분, (98°C에서 20초, 63°C에서 30초, 72°C에서 1분) x 6, 72°C에서 1분, 및 4°C에서 유지.</li>
	<li>예비증폭된 샘플 35 μL를 취하고, 다음과 같이 cDNA 증폭을 수행하였다: 98°C에서 3분, (98°C에서 15초, 63°C에서 20초, 72°C에서 1분) x 6, 72°C에서 1분, 및 4°C에서 유지. 제조업체18 에 의해 지시된 바와 같이 최종 수리 및 A-테일링 단계 및 어댑터 결찰을 계속하십시오. 후속 최종 샘플 인덱싱 PCR의 경우, 다음과 같이 15 PCR 사이클을 수행한다: 98°C에서 45초, (98°C에서 20초, 54°C에서 30초, 72°C에서 20초) x 15, 72°C에서 1분, 및 4°C에서 유지.</li>
	<li>ATAC 라이브러리 구축을 위해 40μL를 사용하고 다음 프로그램을 사용하여 샘플 인덱싱을 위해 6개의 PCR 주기 동안 증폭합니다: 98°C에서 45초, (98°C에서 20초, 67°C에서 30초, 72°C에서 20초) x 6, 72°C에서 1분, 4°C에서 유지.</li>
	<li>수득된 멀티옴 유전자 발현 라이브러리를 핵당 최소 판독 깊이로 서열화하고, 멀티옴 ATAC 라이브러리를 제조자(18)에 의해 권장된 바와 같이, 세포당 최소 판독 깊이인 25,000 판독 쌍으로 서열화한다.</li>
</ol>

<ol>
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Document number CG000338 (Rev D). 10x Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide</a> (2021)</li><li>MacParland, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+of+human+liver+reveals+distinct+intrahepatic+macrophage+populations.">Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations.</a> Nature Communications. 9 (1), 4383 (2018).</li><li>Martinez-Jimenez, C. P., Kyrmizi, I., Cardot, P., Gonzalez, F. J., Talianidis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+4alpha+coordinates+a+transcription+factor+network+regulating+hepatic+fatty+acid+metabolism.">Hepatocyte nuclear factor 4alpha coordinates a transcription factor network regulating hepatic fatty acid metabolism.</a> Molecular and Cell Biology. 30 (3), 565-577 (2010).</li><li>Schmidt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-vertebrate+ChIP-seq+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+transcription+factor+binding.">Five-vertebrate ChIP-seq reveals the evolutionary dynamics of transcription factor binding.</a> Science. 328 (5981), 1036-1040 (2010).</li><li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data.">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Madad, S., Lareau, C. A., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+state+analysis+with+Signac.">Single-cell chromatin state analysis with Signac.</a> Nature Methods. 18 (11), 1333-1341 (2021).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+organoids+can+repair+bile+ducts+after+transplantation+in+the+human+liver.">Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver.</a> Science. 371 (6531), 839-846 (2021).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+as+a+tool+for+studying+toxicity+and+drug+metabolism.">Human hepatocytes as a tool for studying toxicity and drug metabolism.</a> Current Drug Metabolism. 4 (4), 292-312 (2003).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+in+primary+culture:+The+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man.">Human hepatocytes in primary culture: The choice to investigate drug metabolism in man.</a> Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).</li><li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows.">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).</li><li>Nault, R., Fader, K. A., Bhattacharya, S., Zacharewski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nuclei+RNA+sequencing+assessment+of+the+hepatic+effects+of+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.">Single-nuclei RNA sequencing assessment of the hepatic effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (1), 147-159 (2021).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+as+a+mechanism+for+stress-induced+liver+adaptation.">Aneuploidy as a mechanism for stress-induced liver adaptation.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (9), 3307-3315 (2012).</li><li>Kreutz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+ploidy+is+a+diversity+factor+for+liver+homeostasis.">Hepatocyte ploidy is a diversity factor for liver homeostasis.</a> Frontiers in Physiology. 8, 862 (2017).</li><li>Hunt, N. J., Kang, S. W. S., Lockwood, G. P., Le Couteur, D. G., Cogger, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+aging+in+the+liver.">Hallmarks of aging in the liver.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 1151-1161 (2019).</li><li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+spectrum:+a+new+marker+in+HCC+classification.">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. 69 (2), 355-364 (2019).</li><li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li><li>Schwartz-Arad, D., Zajicek, G., Bartfeld, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+streaming+liver+IV:+DNA+content+of+the+hepatocyte+increases+with+its+age.">The streaming liver IV: DNA content of the hepatocyte increases with its age.</a> Liver. 9 (2), 93-99 (1989).</li><li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (6), 387-393 (1993).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Granja, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArchR+is+a+scalable+software+package+for+integrative+single-cell+chromatin+accessibility+analysis.">ArchR is a scalable software package for integrative single-cell chromatin accessibility analysis.</a> Nature Genetics. 53 (3), 403-411 (2021).</li><li>Bredikhin, D., Kats, I., Stegle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUON:+Multimodal+omics+analysis+framework.">MUON: Multimodal omics analysis framework.</a> Genome Biology. 23 (1), 42 (2022).</li><li>Velten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+temporal+and+spatial+patterns+of+variation+from+multimodal+data+using+MEFISTO.">Identifying temporal and spatial patterns of variation from multimodal data using MEFISTO.</a> Nature Methods. 19 (2), 179-186 (2022).</li></ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

단일 세포 또는 단일 핵 RNA-seq에 의한 간의 세포 구성을 해부하면 간 질환 발달 및 진행에 대한 더 깊은 이해를 제공합니다 3,4,5,24. 간에서 단일 세포 분리는 시간이 많이 걸리고 가혹한 기계적 또는 효소 해리를 포함하는 프로토콜이 필요합니다25,26,27. 모든 조직은 최적의 조직 해리 프로토콜을 결정하기 위한 체계적인 평가뿐만 아니라 취약한 세포 유형 또는 핵(28)을 포획하기 위한 적절한 저장 방법을 필요로 한다는 것이 널리 받아들여지고 있다. 조직 가용성, 관심 질병, 발달 단계 또는 모델 유기체에 따라 다운스트림 처리를 위한 단일 핵 현탁액의 제조가 단일 세포 현탁액을 사용하는 것보다 더 적합한 방법론일 수 있습니다. 중요하게도, 간에서 scRNA-seq 및 snRNA-seq는 핵과 세포질 mRNA 사이에 높은 상관 관계를 보여 주었으며, 이는 두 접근법 모두 상보적인 정보 2,3,4,6,29를 제시한다는 것을 시사한다.
이 논문은 생쥐와 인간과 원숭이를 포함한 다른 종의 냉동되고 보관된 간 샘플에서 표준화되고 강력하며 재현 가능한 단일 핵 분리를 제공합니다. 이 방법은 차우와 고지방 식단(HFD)을 먹인 야생형 마우스와 웰 플레이트 기반 및 액적 기반 단일 핵 게놈 접근법을 모두 사용하는 간 섬유증의 마우스 모델에 사용할 수 있습니다6. 이 방법은 원래 Krishnaswami et al.30 에 의해 뇌 조직에 대해 설명한 프로토콜에 의존하며 급속 냉동 간에 맞게 조정된 추가 수정이 있습니다. 최적의 균질화는 핵막 무결성에 부정적인 영향을 미치지 않고 조직으로부터 대부분의 핵을 유리시킨다. 그러나 너무 많이 사용하면 깨지기 쉬운 핵이 손상되고 전반적인 품질이 저하 될 수 있습니다. 젊은 및/또는 지방간은 일반적으로 유봉 A 로 5회, 유봉 B로 10회만 필요한 반면, 노인 및/또는 섬유성 간은 유봉 B 로 15회만 필요하지만 그 이상은 필요하지 않습니다. 따라서 여기에 표시된 숫자 이상으로 더 많은 스트로크를 수행하지 않는 것이 좋습니다. 오버 더블은 단일 핵 현탁액의 품질에 부정적인 영향을 미치고 주변 RNA의 양을 증가시킬 수 있습니다. 결과적으로 다운스트림 데이터 분석 중에 추가 계산 필터링 단계를 수행해야 할 수 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 다목적이며 젊은 (3 개월) 및 노인 (24 개월) 마우스의 다양한 간 상태에 맞게 조정할 수 있습니다. 우리는 오래된, HFD 및 섬유 성 조직에 간의 더 큰 부분이 필요하다는 것을 발견했기 때문에 처리에 사용할 수있는 조직의 크기는 생물학적 물질의 양이 적은 일부 사용자에게는 한계를 제기 할 수 있습니다. 그러나 그래디언트 정제는 액적 기반 게놈 분석을 사용한 즉각적인 샘플 처리에 적극 권장됩니다. 웰 기반 분석을 위해 핵을 96-/384-웰 플레이트로 FACS 분류해야 하는 경우 그래디언트 정제를 생략할 수 있습니다. FACS 분류를 위한 권장 핵 농도(즉, ~1 ×10 5 핵/mL)를 얻기에 충분한 조직 샘플이 있는 경우 사용자가 그래디언트 정제를 수행하는 것이 좋습니다.
간은 간세포의 배수체 성질을 특징으로하지만, 정상적인 생리학및 질병에서 간세포 배수체의 역할은 아직 명확하지 않다. 배수성이 게놈 가변성31을 제공한다는 증거가 증가하고 있으며, 배수성이32,33세에 따라 증가한다는 것은 잘 알려져 있습니다. 그러나 단핵 사배체 간세포의 농축은 인간 간세포 암종 (HCC)의 예후가 좋지 않은 것과 임상 적으로 관련이 있습니다.34. 유사하게, 간세포 배수성 수준의 변화는 비 알코올성 지방간 질환 (NAFLD)과 같은 노화 관련 만성 간 질환과 관련이 있습니다.35,36,37. 배수성은 두 개 이상의 게놈 사본을 소유하는 상태이며, 이는 Hoechst38과 같은 DNA 염료로 게놈 함량을 염색하여 탐색 할 수 있습니다. 추출 전에 HB에 첨가되는 Hoechst 염료는 분리 프로토콜 동안 모든 핵에 라벨을 붙입니다. 이를 통해 유세포 분석 장비에서 UV (350nm) 또는 보라색 (450nm) 레이저에 의해 여기 될 때 DNA 함량을 기반으로 이배체와 배수체 핵을 구별 할 수 있습니다. 전시된 게이팅 전략을 통해 2n, 4n, 8n 및 더 높은 수준의 간세포 배수성을 냉동된 간에서 조사하여 조직 기능1에서 세포 이질성의 역할을 더 잘 이해할 수 있습니다(그림 3A). 또한, 크기 및 부피를 포함한 핵 형태는 이미징 유세포 분석을 사용하여 정량화하여 핵 크기의 변화를 배수성 수준에 따라 총 카운트 수 또는 유전자 수의 변화와 연관시킬 수 있습니다 (그림 3B, C).
다중 모드 체학 측정은 여러 층의 게놈 조직을 동시에 조사할 수 있는 기회를 제공합니다. 공동 RNA + ATAC 다중오믹스 접근 방식을 사용하면 업스트림 조절자 및 다운스트림 대사 유전자를 조사할 수 있으므로 단일 세포 분해능에서 간 기능과 관련된 전사 네트워크 및 염색질 구조를 연구하기 위한 포괄적인 접근 방식을 제공합니다. 또한 데이터 희소성과 시퀀싱 비용 절감을 설명할 수 있는 계산 방법의 발전으로 단일 세포 다중오믹스는 동일한 세포에서 여러 양식의 평가를 개척하고 있습니다. 이 단일 핵 분리 프로토콜은 발현 및 염색질 데이터 세트의 개별 및 공동 평가와 호환됩니다. 우리는 데이터의 품질을 설명하기 위해 Stuart et al.23 (Signac 패키지)에 의해 확립 된 표준 파이프 라인을 사용했으며, 다운 스트림 분석23,39,40,41에 사용 가능한 몇 가지 대체 계산 방법을 쉽게 채택 할 수 있습니다.
전반적으로, 단일핵 다중오믹스는 여기에 제시된 핵 추출 프로토콜을 구현함으로써 매우 적은 양의 출발 샘플 물질을 사용하여 바이오 아카이브, FF 마우스, 인간 및 비인간 영장류 간 조직의 조사를 가능하게 합니다. 이 귀중한 도구는 간 생물학자가 다양한 간 병리의 맥락에서 유전자 발현과 염색질 접근성을 모두 조사할 수 있도록 합니다. 또한, 다양한 수준의 간세포 배수성과 간 소엽에서의 위치에 의존하는 유전자 발현의 결과 조정은 간 병리에서의 역할을 나타낼 수 있습니다. 따라서 우리는 세포 이질성에 대한 조사가 정밀 의학 개발과 간세포 암종 및 NAFLD와 같은 질병에 대한 표적 개입을위한 새로운 기회를 제공 할 것으로 기대합니다.

단일 세포 유전체학은 간 기능을 연구하고 건강 및질병 상태에서 세포 이질성의 영향을 평가하는 데 필수적인 방법론이 되고 있습니다1. 서로 다른 정보 계층의 동시 측정과 강력한 컴퓨팅 파이프라인의 병렬 확장을 위한 "다중오믹스"의 급속한 발전은 정상 및 병든 간에서 이전에 알려지지 않은 세포 유형 및 하위 유형을 발견할 수 있는 길을 열어주고 있습니다2.
바이오뱅크 및 보관된 냉동 샘플을 탐색할 수 있는 가능성은 비실질 세포 3,4,5의 역할을 재검토 및 발견하고 노화 및 만성 질환 동안 배수체 간세포의 역할을 조사할 수 있는 기회를 크게 증가시켰습니다.6,7,8,9 . 따라서 이 백서에서는 다운스트림 단일 핵 RNA 시퀀싱 및 ATAC 시퀀싱은 물론 다중 모드 오믹스(관절 RNA-seq 및 ATAC-seq)와 호환되는 급속 냉동(FF) 보관 간에 대한 강력하고 재현 가능한 단일 핵 분리 프로토콜에 대해 설명합니다(그림 1).
이 워크플로우를 통해 효소 해리 프로토콜에서 세포 크기 또는 취약성에 관계없이 간에 있는 모든 세포 유형의 전사체 및 염색질 접근성을 조사할 수 있습니다. 귀중한 인간 샘플 또는 형질 전환 마우스의 작은 조직 절편 (15-30 mg 또는 5-10 mm3)으로 수행 할 수 있습니다. 핵 분리의 고순도를 결정하는 것은 증가된 세포 크기 및 노화10,11와 상관관계가 있을 수 있는 핵 크기의 정량화 및 측정을 포함하며, 이 순도는 간세포 배수성12 및 세포 크기 의존적 전사 메커니즘11,13,14,15 모두의 분석과 관련이 있습니다. . 또한 냉동 간에서 분리 된 핵은 간 구역화에 대한 귀중한 정보를 보유합니다. 워크플로우 및 조직 수집을 통해 단일 세포 유전체학 데이터 또는 동일한 조직 및 동일한 개인의 면역조직화학 또는 공간 전사체학과 같은 추가 보완 분석을 검증할 수 있습니다. 따라서이 접근법은 여러 간 질환 상태 및 모델 유기체에 체계적이고 안정적으로 적용될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20 - 5 mL</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive PCR film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Sorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000619</td>
			<td>Use chilled at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Kit v3.1, 4 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) 1 M solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td>Make 1 mM stock solution and use at 1 &#181;M final concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA AWAY Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10223471</td>
			<td>Wipe surfaces and pipettes before start of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16628742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16638742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (EB) - 250 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13527550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13518470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade - 100 mL&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10517694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters 50 &#181;m, sterile&#160;&#160;</td>
			<td>SYSMEX PARTEC - CELLTRICS</td>
			<td>04-004-2327</td>
			<td>Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) - 1 L</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP3905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herenz Heinz ABS Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen TE Buffer - 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11568846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2 M), RNase-free, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M), 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10209104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10733087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#246;rser 2 mL DOUNCE</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH</td>
			<td>9651632</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td>Or any other strip and tube mini centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Hemocytometer</td>
			<td>OMNILAB&#160; LABORZENTRUM</td>
			<td>5435293</td>
			<td>Visualize and count nuclei under microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips RT LTS 1000 &#181;L, Wide-O</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30389218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pistill &#34;A&#34; 2 mL</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH&#160;</td>
			<td>9651621</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pistill &#34;B&#34; 2 mL</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH</td>
			<td>9651627</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10579691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10634141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10100151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector RNase inhibitor - 2,000 U</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3335399001</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-based RNase Inhibitor SUPERase&#8226;In (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Clontech Takara</td>
			<td>2313B</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free microfuge tubes - 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Wipe surfaces and pipettes before start of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIselect - 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318</td>
			<td>Aliquot and store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, 500 g</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td>Make a 1 M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11798343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI (1M), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10671652</td>
			<td>Make 10% stock solution. Keep at 4 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11538886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex- Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-1372</td>
			<td>Or any other type of vortex</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of nuclei from flash-frozen liver tissue for single-cell multiomics

간은 에너지 항상성 유지 및 생체 이물질의 신진 대사와 같은 많은 중요한 생리적 기능을 수행하는 복잡하고 이질적인 조직입니다. 이러한 작업은 간 실질 세포와 비 실질 세포 사이의 긴밀한 조정을 통해 수행됩니다. 또한 다양한 대사 활동이 간 소엽의 특정 영역에 국한되어 간 구역 화라고하는 현상입니다. 최근 단일 세포 시퀀싱 기술의 발전으로 연구자들은 단일 세포 분해능에서 조직 이질성을 조사할 수 있게 되었습니다. 간을 포함한 많은 복잡한 조직에서 가혹한 효소 및/또는 기계적 해리 프로토콜은 건강 및 질병에서 이 기관을 포괄적으로 특성화하는 데 필요한 단일 세포 현탁액의 생존력 또는 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
이 논문은 냉동되고 보관된 간 조직에서 핵을 분리하기 위한 강력하고 재현 가능한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 단일 핵 RNA-seq, 고처리량 시퀀싱을 사용한 트랜스포아제 접근 염색질 분석(ATAC-seq) 및 다중 모드 오믹스(공동 RNA-seq 및 ATAC-seq)를 포함한 다운스트림, 단일 세포 체학 접근법과 호환되는 고품질 핵을 생성합니다. 이 방법은 건강하고 병에 걸린 인간, 마우스 및 비인간 영장류 냉동 간 샘플에서 핵을 분리하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 접근법은 간에서 모든 주요 세포 유형을 편향되지 않게 분리 할 수 있으므로 단일 세포 분해능에서 간을 연구하기위한 강력한 방법론을 제공합니다.

냉동 간 샘플에서 단일 핵 분리를 위한 이 워크플로우는 단일 핵 다중오믹스에 맞게 조정되며 i) 세포 이질성 및 조직 구조의 병렬 분석을 위한 샘플 수집, ii) 단일 핵 현탁액 및 iii) 단일 핵 다중오믹스로 요약할 수 있는 세 가지 주요 단계에 의존합니다(그림 1 ). 추출된 간은 안락사된 마우스에서 해부되고 파라핀 포매, 냉동 절개 또는 둘 다에 대한 조직학적 검사를 위해 조각으로 절단됩니다. 다른 절단 조각은 다중오믹스 분석을 위한 다운스트림, 단일 핵 분리를 위해 액체 질소에서 즉시 급속 냉동됩니다. 이 조직 수집 시스템을 통해 사용자는 동일한 개인의 조직 절편에 대한 단일 핵 체학 데이터를 추가로 검증할 수 있으므로 필요한 경우 공간 전사체학 또는 면역조직화학 분석으로 데이터 세트를 보완할 수 있습니다.
여기에 설명된 방법으로 냉동 간에서 추출한 핵의 현미경 검사는 밀도 구배 원심분리 단계가 원치 않는 세포 및 조직 파편의 제거를 크게 용이하게 한다는 것을 보여줍니다(그림 2C, D). 또한 이 방법론은 세포분석 분석을 통해 검증하고 정량화할 수 있는 모든 수준의 배수성을 보존합니다(그림 3).
이 프로토콜의 성능을 추가로 검증하기 위해 분류되지 않은 핵과 FACS 분류 핵에 대해 액적 기반 snRNA-seq를 수행하고 Seurat 파이프라인에 따라 데이터를 분석했습니다. 간략하게, 추출된 단일 핵을 앞서 도19에 기재된 바와 같이 액적 기반 snRNA-seq에 대해 제조하였다. 2n 및 4n 핵 또는 그 이상의 수준의 배수성의 snRNA-seq의 경우, cDNA 증폭 단계에 11 사이클을, 최종 유전자 발현 라이브러리 구축을 위해 10 사이클을 사용하였다. 결과 라이브러리는 핵 당 ~ 25,000-39,000 평균 판독의 판독 깊이로 시퀀싱되었습니다. 획득된 단일 핵 판독은 GRCm39/mm39 마우스 게놈에 매핑되었습니다. 전처리 파이프라인을 실행할 때 핵에 존재하는 스플라이싱되지 않은 메신저 RNA(mRNA)의 포함 및 정량화를 확인하기 위해 - -include-intron 명령을 추가했습니다. 얼라이너 내에 통합된 EmptyDrops 알고리즘은 빈 드롭릿을 필터링하고 제거했습니다.
R 패키지 Seurat(버전 4.1.1)는 snRNA-seq 분석 파이프라인에서 출력되는 고유 분자 식별자(UMI) 카운트 매트릭스를 사용하여 품질 관리(QC) 메트릭을 계산하는 데 사용되었습니다. 100개 미만의 특징(유전자)과 10개 미만의 세포를 가진 카운트는 제거되었습니다. 확인된 QC 역치에 따라 핵을 여과하였다: 최소 유전자 수 = 200 및 최대 유전자 수 = 8,000, 미토콘드리아 분획 <1% 및 리보솜 분획 <2%). 상위 3,000 개의 고도로 가변적 인 유전자 (HVG)는 Seurat에서 구현 된 주성분 분석 (PCA)에 사용되었습니다. 그래프 기반 클러스터링은 PCA 분석 결과 상위 15개 PC 치수를 입력한 후 수행되었습니다. 세포를 클러스터링하기 위해 분해능 파라미터를 0.5로 설정한 모듈성 최적화 기술(Louvain 알고리즘)을 적용했습니다. 이 데이터 세트를 시각화하고 탐색하기 위해 비선형 차원 축소, 즉 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection)를 실행했습니다. 각 클러스터의 동일성은 마커 유전자 6,20,21의 사전 지식에 기초하여 할당되었다.
도 4A는 핵 추출의 이 방법을 사용하여 얻어진 데이터로부터의 고품질 메트릭들을 도시한다. UMAP는 핵 전사체와 상대적으로 얕은 시퀀싱(~25,000-40,000개의 세포당 평균 판독)으로만 확실하게 식별할 수 있는 모든 핵 및 주요 세포 유형에 걸친 카운트 수를 나타냅니다(그림 4B). 이 접근법은 Hnf4a, Mlxipl 및 Ppara와 같은 간 특이적 전사 인자뿐만 아니라 생체 이물질의 대사에 관여하는 다운스트림 표적 유전자(즉, Cyp2e1 및 Cyp2f2)의 조사를 허용합니다(그림 4C). 참고로, 추출 된 핵은 주변 중심 Cyp2e1 및 주변 문맥 Cyp2f2와 같은 특징적인 유전자의 상보적인 패턴에서 알 수 있듯이 간 구역 화에 대한 중요한 정보를 유지했습니다 (그림 4C).
우리는 동일한 단일 핵18에서 후성 유전체 풍경 (ATAC) 및 유전자 발현 (RNA)의 동시 프로파일 링을위한 새로운 다중오믹스 분석과 함께이 방법을 사용하여 추출 된 분류되지 않은 핵의 호환성을 추가로 평가했습니다. 핵 용해 배양 시간을 전치 전 5분으로 최적화했습니다. 시퀀싱 라이브러리는 cDNA 예비증폭을 위해 6개의 PCR 사이클을 실행하여 구축하였다. 사전 증폭된 샘플로부터, 35 μL를 취하고, 유전자 발현 라이브러리를 구축하기 위한 샘플 인덱싱을 위해 15 PCR 사이클에 의해 추가로 증폭하였다. cDNA 트레이스의 대표적인 전기페로그램이 도 5A (상단)에 도시되어 있다. ATAC 라이브러리의 구축을 위해 40μL의 사전 증폭된 샘플을 사용하고 샘플 인덱싱을 위해 추가로 6번의 PCR 주기 동안 실행했으며, DNA 추적의 대표적인 전기페로그램은 그림 5A (하단)에 나와 있습니다. 생성된 유전자 발현 라이브러리(RNA)는 핵당 44,600회 판독 깊이로, ATAC 라이브러리는 핵당 43,500회 판독 깊이로 시퀀싱되었습니다(그림 5B).
상술한 것과 유사하게, 단일 양식, 액적 기반 시퀀싱 프로토콜, 판독 맵핑, 정렬, 빈 방울 제거, 및 단편 계수는 GRCm39/mm39 참조 게놈18을 사용하여 이전에 설명된 바와 같이 표준 지침에 따라 수행되었다. Seurat 및 Signac 패키지22를 사용하여 두 양식(RNA + ATAC)(그림 5C)의 다중 측정을 위해 "가중 최근접 이웃"(WNN) 분석을 수행하여 세포 크기 또는 핵 취약성으로 인한 현저한 편향 없이 주요 및 부 간 세포 유형을 식별하고 주석을 달 수 있었습니다(그림 5D). Satija 실험실22,23에서 발표 한 파이프 라인에는 두 분석에서 독립적으로 수행 된 표준 QC 단계 전처리 및 치수 감소가 포함됩니다. RNA-seq 및 ATAC-seq 양식의 가중 조합을 양호하게 표현하기 위해, WNN 그래프를 플롯팅하고, 이전에 확인된 마커 유전자 6,20,21에 기초하여 UMAP 시각화, 클러스터링 및 주석에 사용하였다. 단일 양식을 사용한 분석과 유사하게, 우리는 또한 업스트림 전사 조절자 (Hnf4a, Ppara, Mlxipl) 및 간 구역화의 특징적인 유전자 (Hamp, Cyp2e1 및 Cyp2f2)를 검출했다 (그림 5E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig01.jpg"> 그림 1: 실험 개요, 워크플로 및 단일 세포 게놈 응용 프로그램. (A) 조직학을 위한 조직 샘플링(왼쪽, 파라핀 임베딩 및/또는 냉동 절제를 위해 3개 섹션 선택), 단일 세포 유전체학을 위한 플래시 냉동 조직 수집(가운데), 대표적인 면역조직화학 및 면역형광 분석(오른쪽)의 예시적 표현; 스케일 바 = 100 μm. (B) 고품질 단일 핵 현탁액을위한 중요한 단계. (C) 핵 현탁액은 10x 크롬 칩에 로딩되거나 FACS 분류 및 플레이트 기반 접근법에 사용될 수 있습니다. 약어 : H & E = 헤 마톡 실린 및 에오신; DAPI = 4',6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌; FACS = 형광 활성화 세포 분류. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig02.jpg"> 그림 2: 간 해부 및 Dounce-유리 조직 균질화. (A) 3개월령 C57BL6/J 마우스(왼쪽)로부터의 대표적인 쥐간 간 섹션은 메스로 조직을 분쇄하기 전(가운데)과 후(오른쪽) 단일 핵 분리에 사용됩니다. 스케일 바 = 1cm. (B) "느슨한"유봉 A (왼쪽)와 "단단한"유봉 B (오른쪽)로 치기 전에 2mL Dounce-유리 균질화의 예시 이미지. 구배 원심분리 전 (C) 및 구배 원심분리 후 (D) 혈구계를 사용하여 조직 균질화를 모니터링한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig03.jpg"> 그림 3: 고처리량 핵 특성 분석을 위한 형광 활성화 세포 분류 및 이미징 유세포분석 . (A) 다양한 수준의 배수성을 조사하기 위해 플레이트로 분류하는 단일 핵 FACS를 위한 게이팅 전략. 전방 산란 영역 대 측면 산란 영역에 기초하여 파편을 배제하도록 설정된 산란 게이트; 여러 핵 집단을 통합하는 Hoechst-높이 대 Hoechst-Area를 기반으로 하는 핵 게이트; 이중 차별을 위해 Hoechst-Width 대 Hoechst-A 세트를 기반으로 한 싱글 렛 게이트; Hoechst-A 히스토그램을 사용하면 핵 배수성 프로파일을 시각화 할 수 있습니다. (B) 이배체 및 사배체 핵을 보여주는 모든 사건(왼쪽) 및 단일(오른쪽) 사건의 대표적인 영상화 세포분석 정량화. (C) 2n 및 4n 핵의 명시야 및 Hoechst 이미지와 이미징 세포 분석을 사용한 정량화. 약어: FACS = 형광 활성화 세포 분류; FSC-A = 전방 산란 영역; SSC-A = 측면 산란 영역; 회히스트-H = 회히스트-높이; 회흐스트-A = 회흐스트 면적; Hoechst-W = Hoechst-Width. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig04.jpg"> 그림 4: snRNA-seq를 사용한 간세포 배수성의 심층 특성 분석 . (A) 유전자 수, 개수, 미토콘드리아 유전자의 백분율 및 검출된 리보솜 유전자의 백분율을 보여주는 바이올린 플롯. (B) snRNA-seq (왼쪽)를 사용하여 검출 된 세포 유형을 보여주는 UMAP와 핵의 백분율로 표현 된 정량화 (오른쪽). (c) UMAP는 개수를 예시하고 간세포 특이적 유전자의 발현을 지시하였다. 모든 핵(윗줄), 2n 핵(중간 행), 4n 핵(아랫줄). 약어 : snRNA-seq = 단일 핵 RNA-seq; UMAP = 균일 매니 폴드 근사 및 투영; 미톡. = 미토콘드리아 유전자; 리보스. = 리보솜 유전자. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig05.jpg"> 그림 5: 냉동되고 보관된 어린 간에서 추출한 다중오믹스(관절 RNA-seq 및 ATAC-seq)의 품질 관리 및 분석 . (A) cDNA 합성 및 ATAC 후 분자량 생성물을 보여주는 다중오믹스 파이프라인 후에 얻어진 대표적인 자동 전기영동 트레이스. (B) ATAC-seq, RNA-seq, 미토콘드리아 유전자의 백분율 및 필터링 전후의 리보솜 유전자의 백분율에 대한 카운트 수를 보여주는 바이올린 플롯. (c) UMAP는 RNA-서열(왼쪽), ATAC-서열(중간) 및 관절 양상-RNA-서열 및 ATAC-서열(오른쪽)로부터의 유전자 발현을 나타낸다. (D) 다른 세포 유형은 표시된 간세포 특이 적 유전자의 발현과 함께 다른 색상으로 주석이 달립니다. (E) 지시된 세포 유형에서 지시된 유전자의 군집 특이적 발현을 보여주는 특징 플롯. 약어: ATAC-seq = 고처리량 시퀀싱을 사용한 전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 분석; 중간 Hep = 중간 구역 간세포; 엔도 = 내피 세포; PV Hep = 문맥주위 간세포; 비 -z Hep = 비 구역 된 간세포; CV Hep = 중심 주위 간세포; Kup & DC = Kupffer & 수지상 세포; SC = 성상 세포, Neu = 호중구; Chol = 담관 세포; 미톡. = 미토콘드리아 유전자; 리보스. = 리보솜 유전자. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">시약</td>
			<td>주식</td>
			<td>10 밀리리터</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>50 밀리리터</td>
		</tr><tr><td colspan="3">(A ) 요오드 산올 배지 (IDM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">250 mM 자당</td>
			<td>1분</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12.5 밀리리터</td>
		</tr><tr><td colspan="3">150 밀리엠 KCl</td>
			<td>2분</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.75 밀리리터</td>
		</tr><tr><td colspan="3">30 mMMgCl2</td>
			<td>1분</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5 밀리람베르트</td>
		</tr><tr><td colspan="3">60 mM 트리스 버퍼 pH 8.0</td>
			<td>1분</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">초순수 RNase 프리 워터</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>29.25 밀리리터</td>
		</tr><tr><td colspan="3">(B) 50 % IDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">이오딕산올</td>
			<td>60%</td>
			<td></td>
			<td>12.5 밀리리터</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">증권 시세 표시기</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.5 밀리리터</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">(씨) 29% IDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">이오딕산올</td>
			<td>60%</td>
			<td></td>
			<td>7.25 밀리리터</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">증권 시세 표시기</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.75 밀리리터</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">(d ) 핵 분리 배지 -1 (NIM-1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">250 mM 자당</td>
			<td>1분</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12.5 밀리리터</td>
		</tr><tr><td colspan="3">25 밀리엠 케이씨엘</td>
			<td>2분</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.625 밀리리터</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5 mMMgCl2</td>
			<td>1분</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.25 밀리리터</td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 mM 트리스 버퍼 pH 8.0</td>
			<td>1분</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5 밀리리터</td>
		</tr><tr><td colspan="3">초순수 르나제 무함유 물</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>36.125 밀리리터</td>
		</tr><tr><td colspan="3">(E ) 핵 분리 배지 -2 (NIM-2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">NIM-1 버퍼</td>
			<td></td>
			<td>9.99 밀리리터</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">디티오트레이톨 (DTT)</td>
			<td>1 밀리미터</td>
			<td>0.01 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">프로테아제 억제제 정제 (EDTA 무첨가)</td>
			<td>1</td>
			<td>1 태블릿</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">(f ) 균질화 완충액 (HB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">NIM-2 버퍼</td>
			<td></td>
			<td>9.697 밀리리터</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">재조합 RNase 억제제</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>0.1 밀리리터</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">단백질 기반 RNAse 억제제 (슈퍼 아제 • IN)</td>
			<td>20 U/μL</td>
			<td>0.1 밀리리터</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">0.1% 트리톤-X</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.1 밀리리터</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">3 μg/mL 회히스트 33342</td>
			<td>10 밀리그램 / 밀리리터</td>
			<td>0.003 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">(g ) 핵 저장 완충액 (NSB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">166.5 mM 자당</td>
			<td>1분</td>
			<td>1.665 밀리리터</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">5 mMMgCl2</td>
			<td>1분</td>
			<td>0.05 밀리리터</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 mM 트리스 pH 8.0</td>
			<td>1분</td>
			<td>0.1 밀리리터</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">재조합 RNase 억제제</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>0.1 밀리리터</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">단백질 기반 RNase 억제제 (슈퍼 아제 • IN) *</td>
			<td>20 U/μL</td>
			<td>0.1 밀리리터</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">초순수 RNase 프리 워터</td>
			<td></td>
			<td>8.085 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">* 옵션(FACS 정렬에만 해당)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>표 1 : 솔루션 레시피. (a) 요오드 산올 배지 (IDM)의 제조; (b) 요오드 딕산올 용액의 50 % 희석; (C) 요오드 딕산올 용액의 29 % 희석. (D) 핵 분리 배지-1(NIM-1)의 제조. (E) 핵 분리 배지-2(NIM-2)의 제조. (f) 균질화 완충액(HB)의 제조. (g) 핵 저장 완충액(NSB)의 제조.

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Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

여기에서는 단일 핵 RNA-seq, ATAC-seq 및 관절 다중오믹스(RNA-seq 및 ATAC-seq)에 대해 급속 냉동되고 보관된 간 조직에서 핵을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

단일 세포 다중오믹스를 위한 급속 동결 간 조직으로부터 핵 분리

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

이 쉽고 재현 가능한 프로토콜은 건강하고 병든 마우스 모델 간뿐만 아니라 인간 및 비인간 영장류의 간에서 고품질 핵을 분리하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 방법은 소량의 냉동 조직 재료 만 필요합니다. 또한 밀도 등급 인센티브는 최종 핵 준비에서 보존된 간의 모든 주요 세포 유형과 함께 매우 깨끗한 핵 현탁액을 제공합니다.이 핵 추출 방법은 바이오뱅크에 저장된 바이오 아카이브된 인간 간 샘플에 사용할 수 있습니다. 미리 식힌 메스를 사용하여 드라이 아이스의 페트리 접시에 놓인 간 조직에서 2230 밀리그램 또는 5 밀리미터 큐브 조각을 절단하여 조직 균질화를 시작하십시오. 즉시 페트리 접시를 젖은 얼음으로 옮기고 균질화 버퍼 1 밀리리터를 첨가하십시오.차가운 메스를 사용하여 가능한 한 조직을 다진 다음 1 밀리리터 너비의 오리피스 팁으로 흡입 할 수 있습니다. 조직 현탁액을 수집하여 미리 냉각된 2밀리리터 유리 도운스 균질화기로 옮깁니다. 페트리 접시를 0.521 밀리리터의 균질화 완충액으로 씻고 모든 것을 얼음 위에 유지하면서 나머지 모든 조직 조각을 수집합니다.거품을 만들지 않고 얼음 위에 느슨한 유봉 A로 천천히 조심스럽게 5 스트로크를 수행하십시오. 유봉이 각 스트로크마다 균질 기의 상단에서 하단으로 조심스럽게 움직이는 지 확인하십시오. 그 후 거품을 생성하지 않고 얼음 위에 단단한 유봉 B로 10-15 번의 느린 스트로크를 수행하십시오.완료되면 균질액을 50마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 여과하는 동시에 사전 냉각된 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 다량의 결합 조직 덩어리를 포함하는 균질 액에 대해 하나 이상의 필터 또는 튜브를 사용하십시오. 밀도 구배 원심분리 전에 모든 조직 균질액을 완전히 수집하기 위해 균질화 완충액의 추가 0.521 밀리리터로 균질화기 및 필터를 헹굽니다.밀도 구배 원심분리의 경우, 여과된 균질액을 섭씨 4도에서 8분 동안 1000G의 사전 냉각된 고정각 원심분리기로 원심분리합니다. 샘플이 원심 분리되는 동안 250 마이크로 리터의 50 % 요오드 딕산올 희석액을 포함하는 1.5 밀리리터 튜브와 500 마이크로 리터의 29 % 요오드 잔산 올 희석액을 포함하는 하나의 2 밀리리터 튜브를 준비하십시오. 두 튜브를 얼음 위에 놓습니다.그런 다음 원심분리기 현탁액에서 진공 펌프를 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡입합니다. 1 밀리리터 너비의 오리피스 피펫 팁을 사용하여 250 마이크로리터의 균질화 완충액에 펠릿을 재현탁시킨다. 그런 다음 250 마이크로 리터의 핵 현탁액을 250 마이크로 리터의 50 % 요오드 잔올을 포함하는 사전 냉각 된 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 부드럽고 철저히 혼합하여 25 % 요오드 산놀 핵 현탁액을 생성합니다.다음으로, 500 마이크로 리터의 25 % 요오드 딕산올 핵 현탁액을 500 마이크로 리터의 29 % 요오드 산올 희석액을 포함하는 사전 냉각 튜브 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 사전 냉각 된 스윙 버킷 원심 분리기에서 튜브를 12, 500G에서 20 분 동안 원심 분리하고 브레이크를 해제합니다. 원심분리 단계가 완료되기 직전에 단일 핵 RNA 시퀀싱 파이프라인으로 진행하는 동안 RNA 억제제를 핵 저장 완충액 또는 NSB에 추가합니다.원심분리 완료 후, 진공 펌프를 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인한다. 1 밀리리터 너비의 오리피스 피펫 팁을 사용하여 100-300 마이크로 리터의 NSB에 펠릿을 부드럽게 다시 현탁시키고 핵 현탁액을 깨끗한 사전 냉각 된 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 수동 혈구계와 함께 trypan blue 용액을 사용하여 핵을 계수하고 즉시 얻은 핵 현탁액을 단일 핵 유전체학 분석에 사용합니다.유세포분석 기반 세포 분류의 경우 50마이크로미터 필터를 통해 핵 현탁액을 사전 냉각된 5밀리리터 형광 활성화 세포 분류 또는 팩스 튜브로 여과합니다. 샘플을 미리 보기 전에 100마이크로미터 노즐이 장착된 유세포분석 분류기를 사용하고 팩스 튜브를 분류기에 로드합니다. 핵 정렬을 위한 게이팅 전략을 설정하고, 전방 산란 영역 대 측면 산란 영역을 플로팅하여 산란 게이트부터 시작하여 가짜 높이 대 가짜 영역, 가짜 너비 대 가짜 영역을 플로팅합니다.가짜 영역 히스토그램에서 핵 배수성 프로파일을 시각화합니다. 96웰 또는 384웰 플레이트로 분류하려면 액적 지연을 설정하고 색도법을 사용하여 플레이트 정렬을 최적화합니다. 시료 회전을 300RPM으로 켠 상태에서 시료 냉각 및 플레이트 홀더를 섭씨 4도로 설정합니다.밀리리터당 약 1배 10 내지 5번째 핵의 샘플 농도에서 단일 핵을 초당 200 내지 500 이벤트의 유속으로 분류한다. 냉동 간에서 추출한 핵의 현미경 검사는 밀도 구배 원심분리 단계가 원치 않는 세포 및 조직 파편의 제거를 크게 촉진한다는 것을 보여주었습니다. 이 방법론은 세포 분석 분석에 의해 검증되고 정량화 된 모든 수준의 배수성을 보존했습니다.핵 추출을 사용하여 얻은 데이터로부터 고품질 메트릭이 관찰되었습니다. 균일한 매니폴드 근사 및 투영은 모든 핵 및 주요 세포 유형에 걸친 카운트 수를 나타내며, 이는 핵 전사체 및 상대적으로 얕은 시퀀싱으로만 확실하게 식별할 수 있습니다. 이 접근법은 간 특이 적 전사 인자 및 생체 이물질의 대사에 관여하는 다운 스트림 표적 유전자의 조사를 허용했습니다.중심성 CYP2E1 및 문맥 주위 CYP2F2와 같은 특징적인 유전자의 보완 패턴은 추출된 핵이 간 기증에 대한 중요한 정보를 보유하고 있음을 보여주었습니다. RNA의 유전자 발현 라이브러리는 핵 당 44, 600 판독의 깊이로, ATAC 라이브러리는 핵 당 43, 500 판독의 깊이로 시퀀싱되었다. Seurat 및 Signac 패키지를 사용하여 RNA와 ATAC 두 양식의 다중 측정을 위해 수행된 가중 최근접 이웃 분석을 통해 세포 크기 또는 핵 취약성으로 인한 현저한 편향 없이 주요 및 부 간 세포 유형을 식별하고 주석을 달 수 있었습니다.상류 전사 조절제와 간 기증의 특징적인 유전자도이 방법에서 검출되었습니다. 유봉을 위아래로 움직일 때 다운의 균질화 과정에서 너무 많은 거품을 생성하지 않고 프로토콜에 표시된 스트로크 수를 고수하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

인간의 사후 뇌 조직에서 핵의 연결을 격리

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

연구

생물학

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

마우스 신경 조직에서 단일 셀 Suspensions의 생성

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리<em&gt; 초파리</em유전자 발현 분석을위한&gt; 조직

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

세제 및 효소 없는 방법을 사용하여 조직 전체에서 핵 분리

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Single-Nucleus RNA 시퀀싱을 위한 성인 마우스 신장에서 핵 분리

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

식물 세포 유형의 분리 및 전사체 분석

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...