Name: isolation of nuclei from flash-frozen liver tissue for single-cell multiomics
Uploaded: 2022-12-09T14:40:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Helmholtz Pioneer Campus (MS, KY, CPM-J.) og Institutt for beregningsbiologi (CT-L.). Denne forskningen ble også støttet av AMED under Grant Number JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). Vi takker Core Genomics ved HMGU (I. de la Rosa) og Bioinformatikk (T. Walzthoeni) støtte, spesielt Xavier Pastor for opplæring og veiledning. Vi takker A. Feuchtinger, U. Buchholz, J. Bushe og alle andre ansatte fra HMGU Pathology and Tissue Analytic kjernefasiliteten for deres tekniske og vitenskapelige støtte, samt J. Zorn, R. Erdelen, D. Würzinger, ansatte i E-Streifen, samt Laboratory Animal Services kjernefasilitet for deres pågående vitenskapelige støtte og diskusjon. Vi er takknemlige for kjernefasilitetscelleanalysen ved TranslaTUM (R. Mishra), og Luminex, A DiaSorin Company (P. Rein). Vi takker Dr. I Deligiannis for hans tekniske støtte. Dr. M. Hartman, Dr. A. Schröder og Ms A. Barden (Helmholtz Pioneer Campus) var grunnleggende for deres juridiske, ledelsesmessige og administrative støtte.

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med tysk dyrevelferdslovgivning og forskriftene fra regjeringen i Øvre Bayern. Dyrehus ble godkjent i henhold til §11 i den tyske dyrevelferdsloven og utført i samsvar med direktiv 2010/63/EU.
1. Forberedelse av vev
<ol><li>Ofre en 3 måneder gammel til 22 måneder gammel mannlig C57BL / 6J mus ved cervikal dislokasjon. Legg dyret på et dissekeringsbrett, fest ekstremiteter med pinner og desinfiser magen med 70% etanol.</li>
	<li>Utfør nekropsy som anbefalt av Treuting et al.16.<ol><li>Åpne magen opp til brystkassen, visualiser leveren og bruk tang for å fjerne leveren forsiktig uten å stikke hull i lobulene.</li>
		<li>Trekk ut den intakte leveren ved å holde membranen med tang og fjerne forbindelsesvevet med saks.</li>
	</ol></li>
	<li>Vask orgelet i kaldt fosfatbufret saltvann (PBS), klapp det tørt på et rent papirhåndkle, og kutt leveren lobules i flere stykker for forskjellige formål: FF for enkeltkjerneisolasjon og multiomikk; paraformaldehydfast (10% PFA) for paraffininnbygging; og/eller innebygd i optimal skjæretemperatur (OCT)-forbindelse for videre histologiske analyser (figur 1A).</li>
	<li>Aliquot leveren stykker i cryovials eller 5 ml skrukork rør, og umiddelbart flash-fryse i flytende nitrogen. Oppbevar de frosne leverprøvene ved −80 °C for nedstrøms enkeltkjerne-multiomics-eksperimenter (figur 1B, C). MERK: Det kryopreserverte vevet kan trygt lagres ved −80 °C i flere år og skal alltid transporteres på tørris ved −80 °C før bruk.</li>
</ol>2. Nuclei isolasjon
<ol><li>Rengjøring og klargjøring av buffere og forbruksvarer<ol><li>Rengjør benkeplatene og pipettene med 70 % etanol- og RNase-dekontamineringsløsning, eller bruk dedikerte RNase-frie benkeplater og materialer.</li>
		<li>Forkjøl både svingskuffen og sentrifuger med fast vinkel, 1,5 ml/2 ml rør og flerbrønnsplater til 4 °C, som beskrevet nedenfor.</li>
		<li>Forkjøl den RNasefrie engangspinsetten som brukes til vevshåndtering, en steril skalpell til engangsbruk og en petriskål på tørris (−60 °C).</li>
		<li>Forkjøl Dounce glasshomogenisatoren og pistill på is (4 °C). Plasser hver pestle (A og B) i et 5 ml rør for å unngå direkte kontakt med isen og potensiell RNase-forurensning.</li>
		<li>Forbered en fortynningsvæske av iodixanolmedium (IDM) (tabell 1A), og bruk den til å lage 50% og 29% fortynninger av 60% iodixanol stock density gradient medium (henholdsvis tabell 1B og tabell 1C).</li>
		<li>Prechill alle rørene. For hver prøve som skal behandles, klargjør du følgende rør:<ol><li>Forbered tre 1,5 ml lav-DNA-bindende rør (en for det filtrerte vevshomogenatet, en annen som inneholder 250 μL av en 50% fortynning av iodixanoloppløsning, og en tredje for den rene kjernesuspensjonen).</li>
			<li>Forbered ett 2 ml rundbunnsrør som inneholder 500 μL av en 29% fortynning av iodixanoloppløsning for tetthetsgradientseparasjon.</li>
			<li>Forbered ett 15 ml konisk rør for kjerneisoleringsmedium-2 (NIM-2) og homogeniseringsbuffer (HB).</li>
		</ol></li>
		<li>Forbered kjerneisoleringsmediet 1 (NIM-1) (tabell 1D), og bruk det til å lage NIM-2 (tabell 1E) og deretter HB (tabell 1F). Legg til begge RNAse-hemmerne like før bruk, som beskrevet nedenfor i protokollen.</li>
		<li>Klargjør kjernelagringsbufferen (NSB) som beskrevet i tabell 1G. Tilsett rekombinant RNAse-hemmer like før bruk. Tilsett proteinbasert RNAse-hemmer i NSB før bruk til FACS-sortering (valgfritt).</li>
		<li>Forbered et 500 ml beger med sterilt vann for å suge Dounce homogenisatorer og pestles etter vevshomogenisering for optimal rengjøring og vedlikehold av homogenisatorene.</li>
	</ol></li>
	<li>Vev homogenisering<ol><li>Skjær et 20-30 mg (eller 5 mm3) vevstykke med en forkjølt skalpell inne i petriskålen på tørris. Deretter overfører du petriskålen umiddelbart til våt is (4 °C). Tilsett 1 ml HB, og bruk den kalde skalpellen, hakk vevet så mye som mulig slik at det lett kan aspireres med en 1 ml bred åpningsspiss. MERK: Bruk alltid vidåpne tips for alle vev / kjerneoverføringer. Som et alternativ kan 1 ml spisser kuttes med en steril skalpell på et sterilt plastdeksel for å generere brede åpninger (figur 2A).</li>
		<li>Samle vevssuspensjonen, og overfør den til en forkjølt 2 ml glass Dounce homogenisator (figur 2B).</li>
		<li>Vask petriskålen med ytterligere 0,5-1 ml HB, og samle alle de resterende vevbitene mens du holder alt på is.</li>
		<li>Gjør sakte og forsiktig fem slag med løs pistill A på is. Unngå å lage bobler ved å bruke vridningsbevegelser av pestelen når du trekker den opp og ned. Sørg for at pestelen beveger seg forsiktig fra toppen til bunnen av homogenisatoren med hvert slag.</li>
		<li>Deretter utfører du 10-15 langsomme slag med tett pestle B på is. Unngå å lage bobler. MERK: Det anbefales å visuelt inspisere kjernene under mikroskopet etter 10 slag med pestle B for å finne ut om det er behov for flere slag. Gjør dette ved å bruke trypanblå farging (1: 1-forhold mellom trypan og prøve) og et manuelt hemocytometer (bland f.eks. 10 μL trypanblått med 10 μL kjernesuspensjon, og bruk 10 μL av blandingen til undersøkelse under mikroskopet; Figur 2C).</li>
		<li>Filtrer homogenatet gjennom en 50 μm cellesil mens du overfører den til et forkjølt 1,5 ml rør. Bruk mer enn ett filter og / eller rør for homogenater som inneholder en høy mengde bindevevsklumper.</li>
		<li>Skyll homogenisatoren og filtrene som brukes med ytterligere 0,5-1 ml HB for å samle alt vevshomogenatet grundig. Fortsett til sentrifugering av tetthetsgradienten.</li>
	</ol></li>
	<li>Sentrifugering av tetthetsgradient<ol><li>Sentrifuge det filtrerte homogenatet i en forkjølt sentrifuge med fast vinkel ved 1000 × g i 8 minutter ved 4 °C.</li>
		<li>Mens prøven spinner, lag et 1,5 ml rør som inneholder 250 μL 50% jodixanol fortynning og ett 2 ml rør som inneholder 500 μL 29% jodixanol fortynning. Hold begge rørene på is.</li>
		<li>Etter sentrifugering aspirerer du supernatanten uten å forstyrre pelleten ved hjelp av en vakuumpumpe. MERK: Bruk av manuell pipettering vil kompromittere kvaliteten på den endelige kjerneopphenget.</li>
		<li>Tilsett 250 μL HB til pelleten ved hjelp av 1 ml pipettespiss med bred åpning, og resuspender veldig sakte.</li>
		<li>Overfør 250 μL av kjernesuspensjonen til et forkjølt 1,5 ml rør som inneholder 250 μL 50% jodjanolfortynning, og bland forsiktig, men grundig for å generere en 25% iodixanol / kjerner suspensjon.</li>
		<li>Overfør 500 μL av 25% iodixanol / kjernesuspensjon til et forkjølt 2 ml rør inneholdende 500 μL 29% jodixanol fortynning. MERK: 500 μL av 25% iodixanol / kjernesuspensjonen skal avsettes forsiktig på toppen av 500 μL 29% jodixanoloppløsning slik at 25% / 29% jodixanolblandingene viser klar faseseparasjon. Bruk siden av rørveggen med pipettespissen plassert i 45° vinkel for å lage dette gradientgrensesnittet. Fra da av må røret håndteres forsiktig for ikke å forstyrre denne gradienten.</li>
		<li>Sentrifuge røret i en forkjølt svingende bøtte sentrifuge på 12.500 g i 20 min med bremsen satt til OFF.</li>
		<li>Like før sentrifugeringstrinnet er fullført, legg til RNAse-hemmerne i NSB-bufferen når du fortsetter til scRNA-seq-rørledningene (se tabell 1G).</li>
		<li>Etter sentrifugering aspirerer du supernatanten uten å forstyrre pelleten ved hjelp av en vakuumpumpe. MERK: Bruk av manuell pipettering vil kompromittere kvaliteten på den endelige kjerneopphenget.</li>
		<li>Bruk 1 ml pipettespiss med bred åpning, resuspender pelleten forsiktig i 100-300 μL NSB, og overfør kjernesuspensjonen til et rent, forkjølt 1,5 ml rør.</li>
		<li>Tell kjernene ved hjelp av trypanblå løsning (1: 1-forholdet mellom trypan og prøve) og et manuelt hemocytometer (bland f.eks. 10 μL trypanblått med 10 μL kjernesuspensjon, og bruk 10 μL av blandingen for telling; Figur 2D).</li>
		<li>Bruk den oppnådde kjernesuspensjonen umiddelbart for enkeltkjernegenomikkanalysen. MERK: Kjernesuspensjonen i NSB kan oppbevares nedkjølt ved 4 °C i opptil 1 uke for videre analyse ved flow- og/eller bildebehandlingsvæskecytometri, men ikke for snRNA-seq eller snATAC-seq.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kjernesortering for hepatocyttploidiprofilering eller velbaserte sekvenseringsmetoder
<ol><li>For flowcytometribasert cellesortering, filtrer kjernesuspensjonen gjennom et 50 μm filter i et forkjølt 5 ml FACS-rør.</li>
	<li>Bruk en flowcytometrisortering utstyrt med en 100 μm dyse. Legg FACS-røret på sorteringsmaskinen, og forhåndsvis prøven.</li>
	<li>Sett opp gating-strategien for kjernesorteringen, og start med en spredningsport ved å plotte det fremre spredningsområdet versus sidespredningsområdet (FSC-A/SSC-A), etterfulgt av Hoechst-Height versus Hoechst-Area (nuclei gate), og deretter Hoechst-Width versus Hoechst-Area (singlets gate). Visualiser kjerneploidiprofilen på histogrammet Hoechst-Area. MERK: For bedre toppoppløsning, visualiser Hoechst-kanalen (450/50) på den lineære skalaen (figur 3A).</li>
	<li>For sortering i 96-/384-brønnplater, sett dråpeforsinkelsen og optimaliser platejusteringen ved hjelp av kolorimetrisk metode med benzidinsubstrat-pepperrotperoksidase (TMB-HRP), som beskrevet tidligere6.</li>
	<li>Still inn både prøvekjøling og plateholder til å kjøles ned ved 4 °C, med prøverotasjonen slått på ved 300 o/min.</li>
	<li>Sorter enkeltkjernene ved en prøvekonsentrasjon på ~ 1 x 105 kjerner / ml og med strømningshastigheten ved 200-500 hendelser / s.</li>
</ol>4. Visuell inspeksjon og kvantifisering av nukleære parametere ved avbildning cytometri (valgfritt)
<ol><li>Last inn et 0,5 ml rør som inneholder 50 μL av kjernesuspensjonen i en konsentrasjon på 2 × 107 kjerner / ml.</li>
	<li>Sett opp en port for alle hendelser basert på sideforholdet versus Hoechst-fluorescenskanalen for å visualisere kjernens ploidiprofil (figur 3B).</li>
	<li>Skaff prøven ved en 40x forstørrelse ved hjelp av brightfield (BF) og Hoechst fluorescenskanal.</li>
	<li>Inspiser og kvantifiser 2n- og 4n-kjerner ved hjelp av brightfield-måling og Hoechst-fluorescensintensitet med programvare for avbildning av cytometri (figur 3C).</li>
</ol>5. Enkeltkjerne RNA-seq, ATAC-seq eller multiome bibliotekkonstruksjon og sekvensering
<ol><li>For dråpebaserte snRNA-seq-tilnærminger, last den rensede kjernesuspensjonen direkte inn i den mikrofluidiske enheten for automatisert parallell partisjonering og molekylær strekkoding17.</li>
	<li>Etter at den mikrofluidiske kjøringen er fullført i encellet partisjoneringsenhet, samler du gelperleinnkapslede kjerner, inkuberer og rengjør som beskrevet tidligere i produsentens retningslinjer17.</li>
	<li>Utfør 11 polymerasekjedereaksjonssykluser (PCR) for cDNA-forforsterkning ved bruk av følgende program: 3 minutter ved 98 °C, (15 s ved 98 °C, 20 s ved 63 °C og 1 min ved 72 °C) x 11, 1 min ved 72 °C, og hold ved 4 °C. Fortsett med en sluttreparasjon og A-haletrinn og adapterligering, som angitt av produsenten17. For den påfølgende endelige genuttrykksbibliotekkonstruksjonen, utfør 10 PCR-sykluser ved bruk av følgende program: 45 s ved 98 ° C, (20 s ved 98 ° C, 30 s ved 54 ° C, 20 s ved 72 ° C) x 10, 1 min ved 72 ° C, og hold ved 4 ° C.</li>
	<li>Sekvenser de oppnådde bibliotekene til en lesedybde på ~ 20,000-50,000 gjennomsnittlige leser per kjerne.</li>
	<li>For felles multiomics (RNA + ATAC) dråpebasert sekvensering, inkuber leverkjernene i lysisbuffer i 5 minutter, og merk dem deretter i 1 time, som beskrevet tidligere18.</li>
	<li>Legg de merkede kjernene direkte inn i en mikrofluidisk enhet for automatisert parallellpartisjonering og molekylær strekkoding.</li>
	<li>Etter at den mikrofluidiske kjøringen er fullført, samler du gelperleinnkapslede kjerner, inkuberer og rengjør som beskrevet av produsenten18.</li>
	<li>Utfør seks PCR-sykluser for cDNA-forforsterkningstrinnet ved hjelp av følgende program: 5 min ved 72 °C, 3 min ved 98 °C, (20 s ved 98 °C, 30 s ved 63 °C, 1 min ved 72 °C) x 6, 1 min ved 72 °C, og hold ved 4 °C.</li>
	<li>Ta 35 μL av den forsterkede prøven, og utfør en cDNA-amplifisering som følger: 3 min ved 98 °C, (15 s ved 98 °C, 20 s ved 63 °C, 1 min ved 72 °C) x 6, 1 min ved 72 °C, og hold ved 4 °C. Fortsett med sluttreparasjonen og A-haletrinnet og adapterligeringen, som angitt av produsenten18 . For den påfølgende endelige prøveindekserings-PCR, utfør 15 PCR-sykluser som følger: 45 s ved 98 °C, (20 s ved 98 °C, 30 s ved 54 °C, 20 s ved 72 °C) x 15, 1 min ved 72 °C, og hold ved 4 °C.</li>
	<li>For konstruksjon av ATAC-biblioteker, bruk 40 μL, og forsterk for seks PCR-sykluser for prøveindeksering ved hjelp av følgende program: 45 s ved 98 °C, (20 s ved 98 °C, 30 s ved 67 °C, 20 s ved 72 °C) x 6, 1 min ved 72 °C, og hold ved 4 °C.</li>
	<li>Sekvenser de oppnådde multiome genuttrykksbibliotekene til en minimum lesedybde på 20 000 lesepar per kjerne og multiome ATAC-bibliotekene til en minimum lesedybde på 25 000 lesepar per celle, som anbefalt av produsenten18.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kamies, R., Martinez-Jimenez, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+of+single-cell+genomics+and+epigenomics+in+human+disease:+where+are+we+now.">Advances of single-cell genomics and epigenomics in human disease: where are we now.</a> Mamm Genome. 31 (5-6), 170-180 (2020).</li><li>Ramachandran, P., Matchett, K. P., Dobie, R., Wilson-Kanamori, J. R., Henderson, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+in+hepatology:+New+insights+into+liver+biology+and+disease+pathogenesis.">Single-cell technologies in hepatology: New insights into liver biology and disease pathogenesis.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 17 (8), 457-472 (2020).</li><li>Ramachandran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+fibrotic+niche+of+human+liver+cirrhosis+at+single-cell+level.">Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level.</a> Nature. 575 (7783), 512-518 (2019).</li><li>Andrews, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+single-nucleus,+and+spatial+RNA+sequencing+of+the+human+liver+identifies+cholangiocyte+and+mesenchymal+heterogeneity.">Single-cell, single-nucleus, and spatial RNA sequencing of the human liver identifies cholangiocyte and mesenchymal heterogeneity.</a> Hepatology Communications. 6 (4), 821-840 (2022).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+intercellular+crosstalk+in+healthy+and+NASH+liver+revealed+by+single-cell+secretome+gene+analysis.">Landscape of intercellular crosstalk in healthy and NASH liver revealed by single-cell secretome gene analysis.</a> Molecular Cell. 75 (3), 644-660 (2019).</li><li>Richter, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+RNA-seq2+reveals+functional+crosstalk+between+liver+zonation+and+ploidy.">Single-nucleus RNA-seq2 reveals functional crosstalk between liver zonation and ploidy.</a> Nature Communications. 12 (1), 4264 (2021).</li><li>Matsumoto, T., Wakefield, L., Tarlow, B. D., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+lineage+tracing+of+polyploid+hepatocytes+reveals+extensive+proliferation+during+liver+regeneration.">In vivo lineage tracing of polyploid hepatocytes reveals extensive proliferation during liver regeneration.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 34-47 (2020).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+distribution+of+hepatocyte+proliferation+in+liver+homeostasis+and+regeneration.">Broad distribution of hepatocyte proliferation in liver homeostasis and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 27-33 (2020).</li><li>Donne, R., Saroul-Ainama, M., Cordier, P., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+in+liver+development,+homeostasis+and+disease.">Polyploidy in liver development, homeostasis and disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 17 (7), 391-405 (2020).</li><li>Lengefeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+is+a+determinant+of+stem+cell+potential+during+aging.">Cell size is a determinant of stem cell potential during aging.</a> Science Advances. 7 (46), 0271 (2021).</li><li>Lanz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+size+remodels+the+proteome+and+promotes+senescence.">Increasing cell size remodels the proteome and promotes senescence.</a> Mol Cell. 82 (17), 3255-3269 (2022).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIDDosome-SCAP+crosstalk+controls+high-fructose-diet-dependent+transition+from+simple+steatosis+to+steatohepatitis.">PIDDosome-SCAP crosstalk controls high-fructose-diet-dependent transition from simple steatosis to steatohepatitis.</a> Cell Metabolism. 34 (10), 1548-1560 (2022).</li><li>Padovan-Merhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+mammalian+cells+compensate+for+differences+in+cellular+volume+and+DNA+copy+number+through+independent+global+transcriptional+mechanisms.">Single mammalian cells compensate for differences in cellular volume and DNA copy number through independent global transcriptional mechanisms.</a> Molecular Cell. 58 (2), 339-352 (2015).</li><li>Miettinen, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+transcriptional+and+metabolic+programs+related+to+mammalian+cell+size.">Identification of transcriptional and metabolic programs related to mammalian cell size.</a> Current Biology. 24 (6), 598-608 (2014).</li><li>Vargas-Garcia, C. A., Ghusinga, K. R., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+control+and+gene+expression+homeostasis+in+single-cells.">Cell size control and gene expression homeostasis in single-cells.</a> Current Opinion in Systems Biology. 8, 109-116 (2018).</li><li>Knoblaugh, S. E., Randolph-Habecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Necropsy and histology. In Comparative Anatomy and Histology: A Mouse, Rat, and Human Atlas (Second Edition). , (2018).</li><li>Chromium Next GEM Single Cell 3 Reagent Kits v3.1 User Guide. Document number CG000204 (Rev D). 10x Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2019)</li><li>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide. Document number CG000338 (Rev D). 10x Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide</a> (2021)</li><li>MacParland, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+of+human+liver+reveals+distinct+intrahepatic+macrophage+populations.">Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations.</a> Nature Communications. 9 (1), 4383 (2018).</li><li>Martinez-Jimenez, C. P., Kyrmizi, I., Cardot, P., Gonzalez, F. J., Talianidis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+4alpha+coordinates+a+transcription+factor+network+regulating+hepatic+fatty+acid+metabolism.">Hepatocyte nuclear factor 4alpha coordinates a transcription factor network regulating hepatic fatty acid metabolism.</a> Molecular and Cell Biology. 30 (3), 565-577 (2010).</li><li>Schmidt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-vertebrate+ChIP-seq+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+transcription+factor+binding.">Five-vertebrate ChIP-seq reveals the evolutionary dynamics of transcription factor binding.</a> Science. 328 (5981), 1036-1040 (2010).</li><li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data.">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Madad, S., Lareau, C. A., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+state+analysis+with+Signac.">Single-cell chromatin state analysis with Signac.</a> Nature Methods. 18 (11), 1333-1341 (2021).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+organoids+can+repair+bile+ducts+after+transplantation+in+the+human+liver.">Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver.</a> Science. 371 (6531), 839-846 (2021).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+as+a+tool+for+studying+toxicity+and+drug+metabolism.">Human hepatocytes as a tool for studying toxicity and drug metabolism.</a> Current Drug Metabolism. 4 (4), 292-312 (2003).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+in+primary+culture:+The+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man.">Human hepatocytes in primary culture: The choice to investigate drug metabolism in man.</a> Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).</li><li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows.">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).</li><li>Nault, R., Fader, K. A., Bhattacharya, S., Zacharewski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nuclei+RNA+sequencing+assessment+of+the+hepatic+effects+of+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.">Single-nuclei RNA sequencing assessment of the hepatic effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (1), 147-159 (2021).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+as+a+mechanism+for+stress-induced+liver+adaptation.">Aneuploidy as a mechanism for stress-induced liver adaptation.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (9), 3307-3315 (2012).</li><li>Kreutz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+ploidy+is+a+diversity+factor+for+liver+homeostasis.">Hepatocyte ploidy is a diversity factor for liver homeostasis.</a> Frontiers in Physiology. 8, 862 (2017).</li><li>Hunt, N. J., Kang, S. W. S., Lockwood, G. P., Le Couteur, D. G., Cogger, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+aging+in+the+liver.">Hallmarks of aging in the liver.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 1151-1161 (2019).</li><li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+spectrum:+a+new+marker+in+HCC+classification.">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. 69 (2), 355-364 (2019).</li><li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li><li>Schwartz-Arad, D., Zajicek, G., Bartfeld, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+streaming+liver+IV:+DNA+content+of+the+hepatocyte+increases+with+its+age.">The streaming liver IV: DNA content of the hepatocyte increases with its age.</a> Liver. 9 (2), 93-99 (1989).</li><li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (6), 387-393 (1993).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Granja, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArchR+is+a+scalable+software+package+for+integrative+single-cell+chromatin+accessibility+analysis.">ArchR is a scalable software package for integrative single-cell chromatin accessibility analysis.</a> Nature Genetics. 53 (3), 403-411 (2021).</li><li>Bredikhin, D., Kats, I., Stegle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUON:+Multimodal+omics+analysis+framework.">MUON: Multimodal omics analysis framework.</a> Genome Biology. 23 (1), 42 (2022).</li><li>Velten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+temporal+and+spatial+patterns+of+variation+from+multimodal+data+using+MEFISTO.">Identifying temporal and spatial patterns of variation from multimodal data using MEFISTO.</a> Nature Methods. 19 (2), 179-186 (2022).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.

Dissekering av leverens cellulære sammensetning ved encellet eller enkeltkjerne RNA-seq gir en dypere forståelse av leversykdomsutvikling og progresjon 3,4,5,24. Encellet isolasjon fra lever er tidkrevende og krever protokoller som involverer hard mekanisk eller enzymatisk dissosiasjon25,26,27. Det er allment akseptert at hvert vev krever en systematisk evaluering for å bestemme den optimale vevsdissosiasjonsprotokollen, samt en egnet lagringsmetode for å fange skjøre celletyper eller kjerner28. Avhengig av vevstilgjengelighet, sykdom av interesse, utviklingsstadium eller modellorganisme, kan fremstilling av en enkeltkjernesuspensjon for nedstrømsbehandling være en mer egnet metode enn å bruke encellede suspensjoner. Det er viktig at i leveren har scRNA-seq og snRNA-seq vist en høy korrelasjon mellom nukleært og cytoplasmatisk mRNA, noe som tyder på at begge tilnærmingene presenterer komplementær informasjon 2,3,4,6,29.
Dette papiret gir en standardisert, robust og reproduserbar enkeltkjerneisolasjon fra frosne, arkiverte leverprøver fra mus og andre arter, inkludert mennesker og makaker. Denne metoden kan brukes til villtypemus matet med chow og et fettfattig kosthold (HFD) og for musemodeller av leverfibrose ved bruk av både brønnplatebaserte og dråpebaserte enkeltkjernegenomiske tilnærminger6. Denne metoden er avhengig av protokollen beskrevet opprinnelig for hjernevev av Krishnaswami et al.30 med ytterligere modifikasjoner skreddersydd for flashfrosset lever. Optimal homogenisering frigjør de fleste kjernene fra vevet uten å påvirke kjernemembranintegriteten negativt. Overdouncing kan imidlertid skade de skjøre kjernene og redusere deres generelle kvalitet. Unge og / eller fettlever krever vanligvis bare 5 slag med pestle A og 10 slag med pestle B, mens gamle og / eller fibrotiske lever kan kreve 15 slag med pestle B, men ikke mer. Det anbefales derfor ikke å utføre flere slag utover tallene som er angitt her. Overdouncing kan negativt påvirke kvaliteten på enkeltkjernesuspensjonen og øke mengden omgivende RNA. Deretter kan dette føre til behov for å utføre ytterligere beregningsfiltreringstrinn under nedstrøms dataanalyser.
Protokollen som presenteres her er allsidig og kan justeres til forskjellige leverforhold hos unge (3 måneder) og gamle (24 måneder) mus. Siden vi fant at en større del av leveren er nødvendig for gamle, HFD og fibrotiske vev, kan størrelsen på vevet som er tilgjengelig for behandling, utgjøre en begrensning for noen brukere med mindre mengder startende biologisk materiale. Imidlertid anbefales gradientrensing sterkt for umiddelbar prøvebehandling med dråpebaserte genomiske analyser. Hvis kjernene må facs sorteres i 96-/384-brønnplater for brønnbaserte analyser, kan gradientrensing utelates. Vi oppfordrer brukere som fortsatt utfører gradientrensingen hvis det er nok vevsprøve til å oppnå den anbefalte kjernekonsentrasjonen for FACS-sortering (dvs. ~ 1 × 105 kjerner / ml).
Leveren er preget av den polyploide naturen til hepatocytter9, men rollen som hepatocyttpoidi i normal fysiologi og sykdom er ennå ikke klar. Det er en økende mengde bevis som indikerer at ploidi gir genomisk variabilitet31, og det er velkjent at ploidi øker med alderen32,33. Anrikningen av mononukleerte tetraploide hepatocytter er imidlertid også klinisk forbundet med dårlig prognose ved humant hepatocellulært karsinom (HCC)34. På samme måte er endringer i hepatocyttploidinivåer knyttet til aldringsrelaterte kroniske leversykdommer som ikke-alkoholholdig fettleversykdom (NAFLD)35,36,37. Ploidi er tilstanden for å ha mer enn to kopier av genomet, som kan utforskes ved å fargelegge genominnholdet med et DNA-fargestoff som Hoechst38. Hoechst-fargestoff, som tilsettes HB før ekstraksjon, merker alle kjernene under isolasjonsprotokollen. Dette gjør det mulig å skille mellom diploide og polyploide kjerner basert på deres DNA-innhold når de er eksitert av en UV (350 nm) eller fiolett (450 nm) laser på et flowcytometriinstrument. Med den viste gating-strategien kan 2n, 4n, 8n og høyere nivåer av hepatocyttpoidi undersøkes i frosne, arkiverte lever for bedre å forstå rollen som cellulær heterogenitet i vevsfunksjon1 (figur 3A). Videre kan kjernemorfologien, inkludert størrelse og volum, kvantifiseres ved hjelp av imaging flow cytometri for å korrelere endringer i kjernestørrelsen med endringer i totalt antall tellinger eller antall gener avhengig av ploidinivået (figur 3B, C).
Multimodal omics måling gir mulighet til å undersøke flere lag av genomisk organisasjon samtidig. Den felles RNA + ATAC multiomics-tilnærmingen tillater undersøkelse av oppstrøms regulatorer og nedstrøms metabolske gener, og gir en omfattende tilnærming for å studere transkripsjonsnettverk og kromatinarkitekturen assosiert med leverfunksjon ved enkeltcelleoppløsningen. Videre, med fremskritt innen beregningsmetoder som kan redegjøre for datamangel og reduksjon i sekvenseringskostnader, er enkeltcelle multiomikk banebrytende for vurderingen av flere modaliteter fra samme celle. Denne enkeltkjerneisolasjonsprotokollen er kompatibel med den individuelle og felles vurderingen av ekspresjons- og kromatindatasett. Vi har brukt standard rørledninger etablert av Stuart et al.23 (Signac-pakken) for å illustrere kvaliteten på dataene, mens flere tilgjengelige og alternative beregningsmetoder enkelt kan tas i bruk for nedstrømsanalyser23,39,40,41.
Samlet sett tillater enkeltkjerne multiomikk undersøkelse av bioarkivert, FF-mus, humant og ikke-humant primatlevervev ved bruk av en svært liten mengde startprøvemateriale ved å implementere kjerneekstraksjonsprotokollen som presenteres her. Dette uvurderlige verktøyet vil gi leverbiologer mulighet til å forhøre både genuttrykk og kromatintilgjengelighet i sammenheng med ulike leverpatologier. I tillegg kan ulike nivåer av hepatocytt ploidi og den resulterende justeringen av genuttrykk avhengig av deres plassering i leveren lobule avsløre deres rolle i leveren patologier. Derfor forventer vi at undersøkelsen av cellulær heterogenitet vil gi nye muligheter for utvikling av presisjonsmedisin og målrettede tiltak mot sykdommer som HCC og NAFLD.

Encellet genomikk blir raskt en viktig metodikk for å studere leverfunksjon og vurdere virkningen av cellulær heterogenitet i helse- ogsykdomstilstander 1. Den raske utviklingen av "multiomics" for samtidig måling av forskjellige lag med informasjon og den parallelle utvidelsen av robuste beregningsrørledninger baner vei for oppdagelsen av tidligere ukjente celletyper og subtyper i normal og syk lever2.
Muligheten for å utforske biobanker og arkiverte frosne prøver har betydelig økt mulighetene for å revidere og oppdage rollen som ikke-parenkymale celler 3,4,5 og undersøke rollen som polyploide hepatocytter under aldring og i kroniske sykdommer 6,7,8,9 . Derfor beskriver dette papiret en robust og reproduserbar enkeltkjerneisolasjonsprotokoll for flashfrosne (FF) arkiverte lever som er kompatible med nedstrøms enkeltkjerne RNA-sekvensering og ATAC-sekvensering, samt med multimodale omics (felles RNA-seq og ATAC-seq) (figur 1).
Denne arbeidsflyten tillater undersøkelse av transkriptomet og kromatintilgjengeligheten til alle celletyper i leveren, uavhengig av cellestørrelse eller skjørhet, i enzymatiske dissosiasjonsprotokoller. Det kan utføres med små vevsseksjoner (15-30 mg eller 5-10 mm3) fra dyrebare menneskelige prøver eller transgene mus. Bestemmelse av den høye renheten av kjerneisolasjonen inkluderer kvantifisering og måling av kjernestørrelsen, som kan korrelere med økt cellestørrelse og senescens 10,11, og denne renheten er relevant for analysen av både hepatocyttploidi12 og cellestørrelsesavhengige transkripsjonsmekanismer 11,13,14,15 . I tillegg beholder kjerner isolert fra frosne lever verdifull informasjon om leverzonering. Arbeidsflyten og vevsinnsamlingen tillater validering av enkeltcellegenomikkdata eller ytterligere komplementære analyser, for eksempel immunhistokjemi eller romlig transkriptomikk fra samme vev og samme individ. Derfor kan denne tilnærmingen brukes på flere leversykdomstilstander og modellere organismer systematisk og pålitelig.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20 - 5 mL</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive PCR film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Sorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000619</td>
			<td>Use chilled at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Kit v3.1, 4 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) 1 M solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td>Make 1 mM stock solution and use at 1 &#181;M final concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA AWAY Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10223471</td>
			<td>Wipe surfaces and pipettes before start of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16628742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16638742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (EB) - 250 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13527550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13518470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade - 100 mL&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10517694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters 50 &#181;m, sterile&#160;&#160;</td>
			<td>SYSMEX PARTEC - CELLTRICS</td>
			<td>04-004-2327</td>
			<td>Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) - 1 L</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP3905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herenz Heinz ABS Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen TE Buffer - 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11568846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2 M), RNase-free, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M), 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10209104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10733087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#246;rser 2 mL DOUNCE</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH</td>
			<td>9651632</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td>Or any other strip and tube mini centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Hemocytometer</td>
			<td>OMNILAB&#160; LABORZENTRUM</td>
			<td>5435293</td>
			<td>Visualize and count nuclei under microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips RT LTS 1000 &#181;L, Wide-O</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30389218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pistill &#34;A&#34; 2 mL</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH&#160;</td>
			<td>9651621</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pistill &#34;B&#34; 2 mL</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH</td>
			<td>9651627</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10579691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10634141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10100151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector RNase inhibitor - 2,000 U</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3335399001</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-based RNase Inhibitor SUPERase&#8226;In (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Clontech Takara</td>
			<td>2313B</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free microfuge tubes - 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Wipe surfaces and pipettes before start of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIselect - 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318</td>
			<td>Aliquot and store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, 500 g</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td>Make a 1 M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11798343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI (1M), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10671652</td>
			<td>Make 10% stock solution. Keep at 4 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11538886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex- Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-1372</td>
			<td>Or any other type of vortex</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of nuclei from flash-frozen liver tissue for single-cell multiomics

Leveren er et komplekst og heterogent vev som er ansvarlig for å utføre mange kritiske fysiologiske funksjoner, for eksempel vedlikehold av energihomeostase og metabolisme av xenobiotika, blant andre. Disse oppgavene utføres gjennom tett koordinering mellom hepatiske parenkymale og ikke-parenkymale celler. I tillegg er ulike metabolske aktiviteter begrenset til bestemte områder av leveren lobule-et fenomen som kalles lever sonering. Nylige fremskritt innen enkeltcellesekvenseringsteknologier har gitt forskere mulighet til å undersøke vevs heterogenitet ved encellet oppløsning. I mange komplekse vev, inkludert leveren, kan sterke enzymatiske og / eller mekaniske dissosiasjonsprotokoller negativt påvirke levedyktigheten eller kvaliteten på enkeltcellesuspensjonene som trengs for å karakterisere dette organet i helse og sykdom.
Dette papiret beskriver en robust og reproduserbar protokoll for å isolere kjerner fra frosne, arkiverte levervev. Denne metoden gir kjerner av høy kvalitet som er kompatible med nedstrøms, enkeltcellede omics-tilnærminger, inkludert enkeltkjerne RNA-seq, analyse for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering (ATAC-seq), samt multimodale omics (felles RNA-seq og ATAC-seq). Denne metoden har blitt vellykket brukt til isolering av kjerner fra friske og syke humane, mus og ikke-menneskelige primatfrosne leverprøver. Denne tilnærmingen tillater upartisk isolasjon av alle de store celletyper i leveren, og tilbyr derfor en robust metodikk for å studere leveren ved encellet oppløsning.

Denne arbeidsflyten for enkeltkjerneisolering fra frosne leverprøver er skreddersydd for enkeltkjernemultiomikk og er avhengig av tre hovedtrinn, som kan oppsummeres som i) prøveinnsamling for parallell analyse av cellulær heterogenitet og vevsarkitektur, ii) enkeltkjernesuspensjon og iii) enkeltkjernemultiomikk (figur 1 ). De ekstraherte leverene blir dissekert fra euthaniserte mus og kuttet i stykker for histologisk inspeksjon for enten parafininnbygging, kryoseksjonering eller begge deler. Andre kuttstykker blir umiddelbart flashfrosset i flytende nitrogen for nedstrøms, enkeltkjerneisolasjon for multiomikkanalyser. Dette systemet for vevsinnsamling gjør det mulig for brukeren å ytterligere validere enkeltkjerne-omics-dataene på vevsseksjoner fra samme individ, og dermed komplementere datasettet med romlig transkriptomikk eller med immunhistokjemianalyser, om nødvendig.
Den mikroskopiske undersøkelsen av kjernene ekstrahert fra frosne lever med metoden beskrevet her viser at tetthetsgradientsentrifugeringstrinnet i stor grad letter fjerningen av uønsket cellulært og vevsavfall (figur 2C, D). Videre bevarer denne metodikken alle nivåer av ploidi, som kan valideres og kvantifiseres ved cytometriske analyser (figur 3).
For ytterligere å validere ytelsen til denne protokollen, gjennomførte vi dråpebasert snRNA-seq på usorterte og FACS-sorterte kjerner og analyserte dataene etter Seurat-rørledningen. Kort fortalt ble de ekstraherte enkeltkjernene fremstilt for dråpebasert snRNA-seq som beskrevet tidligere19. For snRNA-seq av 2n og 4n kjerner eller høyere nivåer av ploidi ble 11 sykluser brukt til cDNA-amplifikasjonstrinnet og 10 sykluser for den endelige genuttrykksbibliotekkonstruksjonen. De resulterende bibliotekene ble sekvensert til en lesedybde på ~ 25.000-39.000 gjennomsnittlige avlesninger per kjerne. De oppnådde enkeltkjerneavlesningene ble kartlagt til GRCm39 / mm39 musegenomet. Når du kjørte forbehandlingsrørledningen, ble kommandoen -- include-intron lagt til for å fastslå inkluderingen og kvantifiseringen av det ikke-spleisede messenger-RNA (mRNA) som er tilstede i kjernene. EmptyDrops-algoritmen innlemmet i reguleringen filtrerte ut og fjernet de tomme dråpene.
R-pakken Seurat (versjon 4.1.1) ble brukt til å beregne kvalitetskontrollberegninger (QC) ved hjelp av den unike molekylidentifikatoren (UMI) tellematrise som ble sendt ut av snRNA-seq-analysepipelinen. Tellinger med mindre enn 100 egenskaper (gener) og mindre enn 10 celler ble fjernet. Kjernene ble filtrert i henhold til identifiserte QC-terskler: minimum antall gener = 200 og maksimalt antall gener = 8000, mitokondriell fraksjon <1% og ribosomal fraksjon <2%. De 3000 mest variable genene (HVGs) ble brukt til hovedkomponentanalysen (PCA), som implementert i Seurat. Grafbasert clustering ble utført etter å ha lagt inn de 15 beste PC-dimensjonene som følge av PCA-analysen. For å gruppere cellene brukte vi modularitetsoptimaliseringsteknikken (Louvain-algoritmen) med en oppløsningsparameter satt til 0,5. For å visualisere og utforske dette datasettet kjørte vi ikke-lineær dimensjonal reduksjon, nemlig Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). Identiteten til hver klynge ble tildelt basert på forkunnskaper om markørgenene 6,20,21.
Figur 4A viser beregninger av høy kvalitet fra dataene oppnådd ved hjelp av denne metoden for kjerneutvinning. UMAP representerer antall tellinger over alle kjernene og de viktigste celletypene som trygt kan identifiseres bare med nukleær transkriptom og relativt grunne sekvensering (~ 25.000-40.000 gjennomsnittlige avlesninger per celle) (figur 4B). Denne tilnærmingen tillater undersøkelse av leverspesifikke transkripsjonsfaktorer som Hnf4a, Mlxipl og Ppara, samt nedstrøms målgener involvert i metabolismen av xenobiotika (dvs. Cyp2e1 og Cyp2f2) (figur 4C). Merk at de ekstraherte kjernene beholdt kritisk informasjon om leverzonering, som vist ved det komplementære mønsteret av kjennetegngener som pericentral Cyp2e1 og periportal Cyp2f2 (figur 4C).
Vi vurderte videre kompatibiliteten til de usorterte kjernene ekstrahert ved hjelp av denne metoden med nyere multiomics-analyser for samtidig profilering av det epigenomiske landskapet (ATAC) og genuttrykk (RNA) i samme enkeltkjerner18. Vi optimaliserte nuclei lysis inkubasjonstiden til 5 minutter før transponering. Sekvenseringsbibliotekene ble konstruert ved å kjøre seks PCR-sykluser for cDNA-forforsterkningen. Fra den forsterkede prøven ble 35 μL tatt og ytterligere forsterket med 15 PCR-sykluser for prøveindeksering for å konstruere genuttrykksbiblioteket. Et representativt elektroferogram av cDNA-sporet er vist i figur 5A (øverst). For konstruksjonen av ATAC-bibliotekene ble 40 μL forsterkede prøver brukt og kjørt i ytterligere seks PCR-sykluser for prøveindeksering, med det representative elektropherogrammet av DNA-sporet vist i figur 5A (nederst). Det resulterende genuttrykksbiblioteket (RNA) ble sekvensert til en dybde på 44 600 avlesninger per kjerne og ATAC-biblioteket til en dybde på 43 500 avlesninger per kjerne (figur 5B).
I likhet med den ovenfor beskrevne, enkeltmodalisitet, dråpebaserte sekvenseringsprotokollen, ble lesekartlegging, justering, fjerning av tomme dråper og fragmenttelling utført etter standard retningslinjer, som beskrevet tidligere, ved bruk av GRCm39 / mm39 referansegenom18. Ved hjelp av Seurat- og Signac-pakkene22 utførte vi en "vektet nærmeste nabo" (WNN) analyse for flere målinger av begge modaliteter (RNA + ATAC) (figur 5C), som tillot oss å identifisere og kommentere både de store og mindre levercelletypene uten fremtredende skjevheter på grunn av cellestørrelse eller nukleær sårbarhet (figur 5D). Rørledningen, som publisert av Satija-laboratoriet22,23, inkluderer standard QC-trinn-forbehandling og dimensjonsreduksjon utført på begge analysene uavhengig av hverandre. For å få en god representasjon av den vektede kombinasjonen av RNA-seq og ATAC-seq modaliteter, ble WNN-grafen plottet og brukt til UMAP-visualisering, clustering og merknad basert på tidligere identifiserte markørgener 6,20,21. I likhet med analysene ved hjelp av enkeltmodalitet, oppdaget vi også oppstrøms transkripsjonsregulatorer (Hnf4a, Ppara, Mlxipl) og kjennetegngener for leversonering (Hamp, Cyp2e1 og Cyp2f2) (figur 5E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig01.jpg"> Figur 1: Eksperimentell oversikt, arbeidsflyt og encellede genomiske applikasjoner. (A) Illustrerende representasjon av vevsprøvetaking for histologi (til venstre, tre seksjoner er valgt for parafininnbygging og/eller kryoseksjonering), flashfrosset vevssamling for encellet genomikk (midten) og representative immunhistokjemi- og immunfluorescensanalyser (høyre); skala bar = 100 μm. (B) Kritiske trinn for høykvalitets enkeltkjernefjæringer. (C) Kjerneopphengene kan lastes på en 10x krombrikke eller brukes til FACS-sortering og platebaserte tilnærminger. Forkortelser: H&E = hematoxylin og eosin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; FACS = fluorescensaktivert cellesortering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig02.jpg"> Figur 2: Leverdisseksjon og dounseglassvevshomogenisering. (A) Representativ murine lever fra en 3 måneder gammel C57BL6 / J mus (venstre); leverseksjonen som brukes til enkeltkjerneisolasjonene før (midten) og etter hakking av vevet med skalpellen (høyre). Skalastenger = 1 cm. (B) Illustrerende bilder av 2 ml Douglass-glass homogenisering før slag med "løs" pestle A (venstre) og etter "tett" pestle B (høyre). Overvåking av vevshomogenisering ved hjelp av et hemocytometer (C) før gradient sentrifugering og (D) etter gradient sentrifugering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig03.jpg"> Figur 3: Fluorescensaktivert cellesortering og avbildning av flowcytometri for kjernekarakterisering med høy gjennomstrømning . (A) Gating-strategi for enkeltkjerne FACS-sortering i en plate for avhør av forskjellige nivåer av ploidi. Spredningsporten basert på det fremre spredningsområdet kontra sidespredningsområdet som er satt til å ekskludere rusk; kjerneport basert på Hoechst-Height versus Hoechst-Area som omfatter flere kjernepopulasjoner; singlets gate basert på Hoechst-Width versus Hoechst-A satt for doublet diskriminering; Hoechst-A-histogrammet tillater visualisering av kjernens ploidiprofil. (B) Representativ avbildningscytometrikvantifisering av alle hendelsene (venstre) og enkle (høyre) hendelser, som viser diploide og tetraploide kjerner. (C) Brightfield og Hoechst bilder av 2n og 4n kjerner og deres kvantifisering ved hjelp av imaging cytometri. Forkortelser: FACS = fluorescensaktivert cellesortering; FSC-A = fremover spredningsområde; SSC-A = sidespredningsområde; Hoechst-H = Hoechst-høyde; Hoechst-A = Hoechst-området; Hoechst-W = Hoechst-bredde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig04.jpg"> Figur 4: Dyp karakterisering av hepatocyttpoidi med snRNA-seq . (A) Fiolinplott som viser antall gener, tellinger, prosentandel mitokondrielle gener og prosentandel av ribosomale gener oppdaget. (B) UMAP som demonstrerer celletypene oppdaget ved hjelp av snRNA-seq (venstre), med kvantifiseringen uttrykt i prosentandel av kjerner (høyre). (C) UMAP illustrerer antall tellinger og indikerte uttrykket av hepatocyttspesifikke gener. Alle kjernene (øverste rad), 2n kjerner (midtre rad) og 4n kjerner (nederste rad). Forkortelser: snRNA-seq = enkeltkjerne RNA-seq; UMAP = Uniform Manifold tilnærming og projeksjon; mitoc. = mitokondrielle gener; Ribos. = ribosomale gener. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64792/64792fig05.jpg"> Figur 5: Kvalitetskontroll og analyse av multiomikk (felles RNA-seq og ATAC-seq) fra frosne, arkiverte unge lever. (A) Representative automatiske elektroforetiske spor oppnådd etter den multiomiske rørledningen som viser molekylvektproduktet etter cDNA-syntese og ATAC. (B) Fiolinplott som demonstrerer antall tellinger for ATAC-seq, RNA-seq, prosentandelen mitokondrielle gener og prosentandelen ribosomale gener før og etter filtrering. (C) UMAP viser genuttrykket fra RNA-seq (venstre), ATAC-seq (midten) og leddmodaliteter-RNA-seq og ATAC-seq (høyre). (D) Ulike celletyper er kommentert i forskjellige farger, med uttrykk for indikerte hepatocyttspesifikke gener. (E) Funksjonsplott som viser det klyngespesifikke uttrykket av de angitte genene i de angitte celletypene. Forkortelser: ATAC-seq = analyse for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering; Mid Hep = mid-zonal hepatocytter; Endo = endotelceller; PV Hep = periportal hepatocytter; Ikke-z Hep = ikke-sonerte hepatocytter; CV Hep = pericentral hepatocytter; Kup & DC = Kupffer & dendrittiske celler; SC = stellatceller, Neu = nøytrofiler; Chol = kolangiocytter; mitoc. = mitokondrielle gener; Ribos. = ribosomale gener. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64792/64792fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Reagent</td>
			<td>Lager</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>15 ml</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">(A ) Iodixanol Medium (IDM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">250 mM sukrose</td>
			<td>1M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">150 mM KCl</td>
			<td>2M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3,75 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">30 mM MgCl2</td>
			<td>1M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">60 mM Tris buffer pH 8,0</td>
			<td>1M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Ultrarent RNase-fritt vann</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>29,25 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">(B) 50 % IDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Iodixanol</td>
			<td>60%</td>
			<td></td>
			<td>12,5 ml</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">IDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,5 ml</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">(C) 29 % IDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Iodixanol</td>
			<td>60%</td>
			<td></td>
			<td>7,25 ml</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">IDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7,75 ml</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">(D ) Kjerneisolering Medium-1 (NIM-1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">250 mM sukrose</td>
			<td>1M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">25 mM KCl</td>
			<td>2M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0,625 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5 mM MgCl2</td>
			<td>1M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0,25 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 mM Tris buffer pH 8,0</td>
			<td>1M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Ultrarent Rnase-fritt vann</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>36,125 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">(e ) Kjerneisolering Medium-2 (NIM-2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">NIM-1-buffer</td>
			<td></td>
			<td>9,99 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>0,01 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Proteasehemmer tablett (EDTA-fri)</td>
			<td>1</td>
			<td>1 Nettbrett</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">(F ) Homogeniseringsbuffer (HB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">NIM-2-buffer</td>
			<td></td>
			<td>9,697 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Rekombinant RNase-hemmer</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Proteinbasert RNAsehemmer (SUPERase•IN)</td>
			<td>20 U/μL</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">0,1 % Triton-X</td>
			<td>10%</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">3 μg/ml Hoechst 33342</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>0,003 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">(G ) Kjernelagringsbuffer (NSB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">166,5 mM sukrose</td>
			<td>1M</td>
			<td>1,665 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">5 mM MgCl2</td>
			<td>1M</td>
			<td>0,05 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 mM Tris pH 8,0</td>
			<td>1M</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Rekombinant RNase-hemmer</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Proteinbasert RNase-hemmer (SUPERase•IN) *</td>
			<td>20 U/μL</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Ultrarent RNase-fritt vann</td>
			<td></td>
			<td>8,085 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">* Valgfritt (kun for FACS-sortering)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Løsningsoppskrifter. (A) Fremstilling av iodixanol medium (IDM); (B) 50% fortynning av iodixanoloppløsning; (C) 29% fortynning av iodixanoloppløsning. (D) Fremstilling av kjerneisolering medium-1 (NIM-1). (E) Fremstilling av kjerneisolering medium-2 (NIM-2). (F) Fremstilling av homogeniseringsbuffer (HB). (G) Fremstilling av kjernelagringsbuffer (NSB).

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics at JoVE.com

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

Her presenterer vi en protokoll for å isolere kjerner fra flashfrosset, arkivert levervev for enkeltkjerne RNA-seq, ATAC-seq og felles multiomikk (RNA-seq og ATAC-seq).

Isolering av kjerner fra flashfrosset levervev for encellet multiomikk

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Denne enkle og reproduserbare protokollen ble vellykket brukt til å isolere kjerner av høy kvalitet fra sunne og syke musemodelllever, samt lever fra menneskelige og ikke-menneskelige primater. Denne metoden krever bare en liten mengde frosset vevsmateriale. Tetthetsgradincentivisering gir også en veldig ren kjernefysisk suspensjon med alle de store celletypene i leveren bevart i den endelige kjernefysiske forberedelsen.Denne metoden for kjerneutvinning kan brukes i bioarkiverte humane leverprøver som er lagret i biobanker. Begynn vevshomogeniseringen ved å kutte et kubestykke på 2230 milligram eller fem millimeter fra et levervev plassert i petriskålen på tørris ved hjelp av en forkjølt skalpell. Overfør umiddelbart petriskålen til våt is og tilsett en milliliter homogeniseringsbuffer.Bruk den kalde skalpellen, hakk vevet så mye som mulig, slik at det kan aspirere med en milliliter bred åpningsspiss. Samle vevsuspensjonen og overfør den til en forkjølt to milliliter glass dounce Homogenizer. Vask petriskålen med ytterligere 0,521 milliliter homogeniseringsbuffer og samle alle de resterende vevsbitene mens du holder alt på is.Utfør sakte og forsiktig fem slag med løs pistill A på is uten å skape bobler. Sørg for at pestelen beveger seg forsiktig fra toppen til bunnen av homogenisatoren med hvert slag. Utfør deretter 10 til 15 langsomme slag med tett pestle B på is uten å skape bobler.Når du er ferdig, filtrer homogenatet gjennom en 50 mikrometer cellesil mens du overfører den til et forkjølt 1,5 milliliter rør. Bruk mer enn ett filter eller rør for homogenater som inneholder en høy mengde bindevevsklumper. Skyll homogenisatoren og filtrene med ytterligere 0, 521 milliliter homogeniseringsbuffer for å samle alle vevshomogenatene grundig før tetthetsgradientsentrifugeringen.For sentrifugering av tetthetsgradient sentrifugerer sentrifugerer det filtrerte homogenatet i en forkjølt fast vinkelsentrifuge ved 1000 G i åtte minutter ved fire grader Celsius. Mens prøven blir sentrifugert, lag et 1,5 milliliter rør som inneholder 250 mikroliter 50% jodixanolfortynning og ett to milliliter rør som inneholder 500 mikroliter 29% jodixanol fortynning. Legg begge rørene på is.Deretter aspirerer du supernatanten fra sentrifugesuspensjonen uten å forstyrre pelleten ved hjelp av en vakuumpumpe. Heng pelleten på nytt i 250 mikroliter homogeniseringsbuffer ved hjelp av pipettespissen på en milliliter bred åpning. Overfør deretter 250 mikroliter av kjernesuspensjonen til et forkjølt 1, 5 milliliter rør som inneholder 250 mikroliter 50% jodixanol og bland det forsiktig og grundig for å generere en 25% jodixanol kjerner suspensjon.Deretter overfører du 500 mikroliter av 25% iodixanol kjerner suspensjon til et forkjølt rør milliliter rør som inneholder 500 mikroliter 29% jodixanol fortynning. Sentrifuger røret i en forkjølt svingende bøtte sentrifuge ved 12.500 G i 20 minutter, med pause satt til av. Like før sentrifugeringstrinnet er fullført, legg til RNA-hemmerne til kjernelagringsbufferen, eller NSB mens du fortsetter til enkeltkjernens RNA-sekvenseringsrørledninger.Etter ferdigstillelse av sentrifugeringen, aspirer supernatanten uten å forstyrre pelleten ved hjelp av en vakuumpumpe. Suspender pelleten forsiktig i 100 til 300 mikroliter NSB ved hjelp av den ene milliliter brede åpningspippetspissen og overfør kjernesuspensjonen til et rent forkjølt 1,5 milliliter rør. Tell kjernene ved hjelp av trypanblå løsning med et manuelt hemocytometer og bruk umiddelbart den oppnådde kjernesuspensjonen for enkeltkjernegenomikkanalysen.For flowcytometribasert cellesortering, filtrer kjernesuspensjonen gjennom et 50 mikrometer filter i et forkjølt fem milliliter fluorescensaktivert cellesorterings- eller faksrør. Bruk en flowcytometrisorterer utstyrt med en 100 mikrometer dyse og legg faksrøret på sorteringsmaskinen før du forhåndsviser prøven. Sett opp gating-strategien for kjernesorteringen, og start med en spredningsport ved å plotte det fremre spredningsområdet mot sidespredningsområdet, etterfulgt av hoaxed høyde mot hoaxed område, og deretter hoaxed bredde versus hoaxed område.Visualiser kjerneploidprofilen på det hoaxede områdehistogrammet. For sortering i 96 eller 384 brønnplater, still dråpeforsinkelsen og optimaliser platejusteringen ved hjelp av den kolormetriske metoden. Sett prøvekjølingen og plateholderen til fire grader Celsius med prøverotasjonen slått på ved 300 o / min.Sorter enkeltkjernene ved en prøvekonsentrasjon på omtrent en ganger 10 til den femte kjernen per milliliter med en strømningshastighet på 200 til 500 hendelser per sekund. Den mikroskopiske undersøkelsen av kjernene ekstrahert fra frosne lever viste at tetthetsgradientsentrifugeringstrinnet i stor grad lettet fjerning av uønsket cellulært og vevsavfall. Denne metoden bevarte alle nivåer av ploidi, som ble validert og kvantifisert ved cytometrisk analyse.Beregninger av høy kvalitet ble observert fra dataene oppnådd ved bruk av kjerneutvinning. Ensartet manifoldtilnærming og projeksjon representerte antall tellinger på tvers av alle kjernene og de store celletypene, som trygt bare kan identifiseres med det nukleære transkriptomet og relativt grunne sekvensering. Denne tilnærmingen tillot undersøkelse av leverspesifikke transkripsjonsfaktorer og nedstrøms målgener involvert i metabolismen av xenobiotika.Det komplementære mønsteret av kjennetegngener som percentral CYP2E1 og periportal CYP2F2 viste at de ekstraherte kjernene beholdt kritisk informasjon om leverdonasjon. Genuttrykksbiblioteket til RNA ble sekvensert til en dybde på 44.600 leser per kjerne og ATAC-biblioteket til en dybde på 43.500 leser per kjerne. En vektet nærmeste nabo-analyse utført for flere målinger av begge modaliteter, RNA pluss ATAC, ved bruk av Seurat- og Signac-pakkene, tillot identifisering og merknad av de store og mindre levercelletypene uten fremtredende skjevheter på grunn av cellestørrelse eller nukleær skjørhet.Oppstrøms transkripsjonsregulatorer og kjennetegnene til leverdonasjon ble også påvist i denne metoden. Det er viktig å unngå å skape for mange bobler under nedhomogeniseringen når du beveger pestlene opp og ned, og å holde seg til antall slag som er angitt i protokollen.

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity basert Isolering av Tagged Nuclei fra<em&gt; Drosophila</em&gt; Vev for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Nuclei Isolation fra hele vevet ved hjelp av et vaskemiddel og enzymfri metode

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Kromatinekstraksjon fra frosset kimært levervev for analyse av kromatinimmunoutfelling

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Kjerneisolasjon fra voksen musnyre for RNA-sekvensering med en kjerne

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, karakterisering og terapeutisk anvendelse av ekstracellulære vesikler fra dyrkede humane mesenkymale stamceller

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Enkeltcelle suspensjonsforberedelse fra Nilen tilapia tarm for enkeltcellesekvensering

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Isolering og transkriptomanalyse av plantecelletyper

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...