Name: isolation of nuclei from flash-frozen liver tissue for single-cell multiomics
Uploaded: 2022-12-09T14:40:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics at JoVE.com

Это исследование было поддержано Пионерским кампусом Гельмгольца (M.S., K.Y., C.P.M.-J.) и Институтом вычислительной биологии (C.T.-L.). Это исследование также было поддержано AMED под номером гранта JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). Мы благодарим Core Genomics в HMGU (I. de la Rosa) и Bioinformatics (T. Walzthoeni) поддержку, в частности Ксавье Пастора за обучение и руководство. Мы благодарим А. Фойхтингера, У. Бухгольца, Д. Буше и всех других сотрудников основного центра патологии и анализа тканей HMGU за их техническую и научную поддержку, а также Й. Цорна, Р. Эрделена, Д. Вюрцингера, сотрудников E-Streifen, а также основного объекта Laboratory Animal Services за их постоянную научную поддержку и обсуждение. Мы благодарны компании Core Facility Cell Analysis в TranslaTUM (Р. Мишра) и Luminex, A DiaSorin Company (P. Rein). Мы благодарим д-ра I Делиянниса за его техническую поддержку. Д-р М. Хартман, д-р А. Шредер и г-жа А. Барден (пионерский кампус Гельмгольца) имели основополагающее значение для своей юридической, управленческой и административной поддержки.

<ol>
	<li>Kamies, R., Martinez-Jimenez, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+of+single-cell+genomics+and+epigenomics+in+human+disease:+where+are+we+now.">Advances of single-cell genomics and epigenomics in human disease: where are we now.</a> Mamm Genome. 31 (5-6), 170-180 (2020).</li><li>Ramachandran, P., Matchett, K. P., Dobie, R., Wilson-Kanamori, J. R., Henderson, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+in+hepatology:+New+insights+into+liver+biology+and+disease+pathogenesis.">Single-cell technologies in hepatology: New insights into liver biology and disease pathogenesis.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 17 (8), 457-472 (2020).</li><li>Ramachandran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+fibrotic+niche+of+human+liver+cirrhosis+at+single-cell+level.">Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level.</a> Nature. 575 (7783), 512-518 (2019).</li><li>Andrews, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+single-nucleus,+and+spatial+RNA+sequencing+of+the+human+liver+identifies+cholangiocyte+and+mesenchymal+heterogeneity.">Single-cell, single-nucleus, and spatial RNA sequencing of the human liver identifies cholangiocyte and mesenchymal heterogeneity.</a> Hepatology Communications. 6 (4), 821-840 (2022).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+intercellular+crosstalk+in+healthy+and+NASH+liver+revealed+by+single-cell+secretome+gene+analysis.">Landscape of intercellular crosstalk in healthy and NASH liver revealed by single-cell secretome gene analysis.</a> Molecular Cell. 75 (3), 644-660 (2019).</li><li>Richter, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+RNA-seq2+reveals+functional+crosstalk+between+liver+zonation+and+ploidy.">Single-nucleus RNA-seq2 reveals functional crosstalk between liver zonation and ploidy.</a> Nature Communications. 12 (1), 4264 (2021).</li><li>Matsumoto, T., Wakefield, L., Tarlow, B. D., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+lineage+tracing+of+polyploid+hepatocytes+reveals+extensive+proliferation+during+liver+regeneration.">In vivo lineage tracing of polyploid hepatocytes reveals extensive proliferation during liver regeneration.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 34-47 (2020).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+distribution+of+hepatocyte+proliferation+in+liver+homeostasis+and+regeneration.">Broad distribution of hepatocyte proliferation in liver homeostasis and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 27-33 (2020).</li><li>Donne, R., Saroul-Ainama, M., Cordier, P., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+in+liver+development,+homeostasis+and+disease.">Polyploidy in liver development, homeostasis and disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 17 (7), 391-405 (2020).</li><li>Lengefeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+is+a+determinant+of+stem+cell+potential+during+aging.">Cell size is a determinant of stem cell potential during aging.</a> Science Advances. 7 (46), 0271 (2021).</li><li>Lanz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+size+remodels+the+proteome+and+promotes+senescence.">Increasing cell size remodels the proteome and promotes senescence.</a> Mol Cell. 82 (17), 3255-3269 (2022).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIDDosome-SCAP+crosstalk+controls+high-fructose-diet-dependent+transition+from+simple+steatosis+to+steatohepatitis.">PIDDosome-SCAP crosstalk controls high-fructose-diet-dependent transition from simple steatosis to steatohepatitis.</a> Cell Metabolism. 34 (10), 1548-1560 (2022).</li><li>Padovan-Merhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+mammalian+cells+compensate+for+differences+in+cellular+volume+and+DNA+copy+number+through+independent+global+transcriptional+mechanisms.">Single mammalian cells compensate for differences in cellular volume and DNA copy number through independent global transcriptional mechanisms.</a> Molecular Cell. 58 (2), 339-352 (2015).</li><li>Miettinen, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+transcriptional+and+metabolic+programs+related+to+mammalian+cell+size.">Identification of transcriptional and metabolic programs related to mammalian cell size.</a> Current Biology. 24 (6), 598-608 (2014).</li><li>Vargas-Garcia, C. A., Ghusinga, K. R., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+control+and+gene+expression+homeostasis+in+single-cells.">Cell size control and gene expression homeostasis in single-cells.</a> Current Opinion in Systems Biology. 8, 109-116 (2018).</li><li>Knoblaugh, S. E., Randolph-Habecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Necropsy and histology. In Comparative Anatomy and Histology: A Mouse, Rat, and Human Atlas (Second Edition). , (2018).</li><li>Chromium Next GEM Single Cell 3 Reagent Kits v3.1 User Guide. Document number CG000204 (Rev D). 10x Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2019)</li><li>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide. Document number CG000338 (Rev D). 10x Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide</a> (2021)</li><li>MacParland, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+of+human+liver+reveals+distinct+intrahepatic+macrophage+populations.">Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations.</a> Nature Communications. 9 (1), 4383 (2018).</li><li>Martinez-Jimenez, C. P., Kyrmizi, I., Cardot, P., Gonzalez, F. J., Talianidis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+nuclear+factor+4alpha+coordinates+a+transcription+factor+network+regulating+hepatic+fatty+acid+metabolism.">Hepatocyte nuclear factor 4alpha coordinates a transcription factor network regulating hepatic fatty acid metabolism.</a> Molecular and Cell Biology. 30 (3), 565-577 (2010).</li><li>Schmidt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-vertebrate+ChIP-seq+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+transcription+factor+binding.">Five-vertebrate ChIP-seq reveals the evolutionary dynamics of transcription factor binding.</a> Science. 328 (5981), 1036-1040 (2010).</li><li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data.">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Madad, S., Lareau, C. A., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+state+analysis+with+Signac.">Single-cell chromatin state analysis with Signac.</a> Nature Methods. 18 (11), 1333-1341 (2021).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+organoids+can+repair+bile+ducts+after+transplantation+in+the+human+liver.">Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver.</a> Science. 371 (6531), 839-846 (2021).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+as+a+tool+for+studying+toxicity+and+drug+metabolism.">Human hepatocytes as a tool for studying toxicity and drug metabolism.</a> Current Drug Metabolism. 4 (4), 292-312 (2003).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+in+primary+culture:+The+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man.">Human hepatocytes in primary culture: The choice to investigate drug metabolism in man.</a> Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).</li><li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows.">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).</li><li>Nault, R., Fader, K. A., Bhattacharya, S., Zacharewski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nuclei+RNA+sequencing+assessment+of+the+hepatic+effects+of+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.">Single-nuclei RNA sequencing assessment of the hepatic effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (1), 147-159 (2021).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+as+a+mechanism+for+stress-induced+liver+adaptation.">Aneuploidy as a mechanism for stress-induced liver adaptation.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (9), 3307-3315 (2012).</li><li>Kreutz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+ploidy+is+a+diversity+factor+for+liver+homeostasis.">Hepatocyte ploidy is a diversity factor for liver homeostasis.</a> Frontiers in Physiology. 8, 862 (2017).</li><li>Hunt, N. J., Kang, S. W. S., Lockwood, G. P., Le Couteur, D. G., Cogger, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+aging+in+the+liver.">Hallmarks of aging in the liver.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 1151-1161 (2019).</li><li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+spectrum:+a+new+marker+in+HCC+classification.">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. 69 (2), 355-364 (2019).</li><li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li><li>Schwartz-Arad, D., Zajicek, G., Bartfeld, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+streaming+liver+IV:+DNA+content+of+the+hepatocyte+increases+with+its+age.">The streaming liver IV: DNA content of the hepatocyte increases with its age.</a> Liver. 9 (2), 93-99 (1989).</li><li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (6), 387-393 (1993).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Granja, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArchR+is+a+scalable+software+package+for+integrative+single-cell+chromatin+accessibility+analysis.">ArchR is a scalable software package for integrative single-cell chromatin accessibility analysis.</a> Nature Genetics. 53 (3), 403-411 (2021).</li><li>Bredikhin, D., Kats, I., Stegle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUON:+Multimodal+omics+analysis+framework.">MUON: Multimodal omics analysis framework.</a> Genome Biology. 23 (1), 42 (2022).</li><li>Velten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+temporal+and+spatial+patterns+of+variation+from+multimodal+data+using+MEFISTO.">Identifying temporal and spatial patterns of variation from multimodal data using MEFISTO.</a> Nature Methods. 19 (2), 179-186 (2022).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Рассечение клеточного состава печени одноклеточными или одноядерными РНК-сек обеспечивает более глубокое понимание развития и прогрессирования заболеваний печени 3,4,5,24. Изоляция одной клетки от печени отнимает много времени и требует протоколов, которые включают жесткую механическую или ферментативную диссоциацию 25,26,27. Широко признано, что каждая ткань требует систематической оценки для определения оптимального протокола диссоциации тканей, а также подходящего метода хранения для захвата хрупких типов клеток или ядер28. В зависимости от доступности ткани, заболевания, представляющего интерес, стадии развития или модельного организма, приготовление одноядерной суспензии для последующей обработки может быть более подходящей методологией, чем использование одноклеточных суспензий. Важно отметить, что в печени scRNA-seq и snRNA-seq показали высокую корреляцию между ядерной и цитоплазматической мРНК, предполагая, что оба подхода представляют комплементарную информацию 2,3,4,6,29.
Эта статья обеспечивает стандартизированную, надежную и воспроизводимую изоляцию одного ядра из замороженных, архивных образцов печени мышей и других видов, включая людей и макак. Этот метод может быть использован для мышей дикого типа, которых кормили чау и диетой с высоким содержанием жиров (HFD), а также для мышиных моделей фиброза печени с использованием как хорошо пластинчатых, так и капельных одноядерных геномных подходов6. Этот метод основан на протоколе, первоначально описанном для мозговой ткани Кришнасвами и др.30 с дополнительными модификациями, предназначенными для замороженной печенью. Оптимальная гомогенизация высвобождает большую часть ядер из ткани, не оказывая негативного влияния на целостность ядерной мембраны. Перепрыгивание, однако, может повредить хрупкие ядра и снизить их общее качество. Молодая и / или жировая печень обычно требует только 5 ударов с пестиком А и 10 ударов с пестиком В, в то время как старая и / или фиброзная печень может потребовать 15 ударов с пестиком В , но не более. Поэтому не рекомендуется выполнять больше штрихов сверх указанных здесь чисел. Перепрыгивание может негативно повлиять на качество одноядерной суспензии и увеличить количество окружающей РНК. Впоследствии это может привести к необходимости выполнения дополнительных этапов вычислительной фильтрации во время последующего анализа данных.
Протокол, представленный здесь, является универсальным и может быть адаптирован к различным заболеваниям печени у молодых (3 месяца) и старых (24 месяца) мышей. Поскольку мы обнаружили, что больший участок печени необходим для старых, HFD и фиброзных тканей, размер ткани, доступной для обработки, может представлять ограничение для некоторых пользователей с меньшим количеством исходного биологического материала. Тем не менее, градиентная очистка настоятельно рекомендуется для немедленной обработки образцов с помощью геномных анализов на основе капель. Если ядра необходимо отсортировать по 96-/384-луночным пластинам для хорошо обоснованных анализов, градиентная очистка может быть опущена. Мы рекомендуем пользователям по-прежнему выполнять градиентную очистку, если есть достаточно образца ткани для получения рекомендуемой концентрации ядер для сортировки FACS (т. Е. ~ 1 × 105 ядер / мл).
Печень характеризуется полиплоидной природой гепатоцитов9, но роль плоидности гепатоцитов в нормальной физиологии и заболевании пока не ясна. Существует все больше доказательств, указывающих на то, что плоидность обеспечивает геномную изменчивость31, и хорошо известно, что плоидия увеличивается с возрастом 32,33 года. Обогащение мононуклеированных тетраплоидных гепатоцитов, однако, также клинически связано с плохим прогнозом при гепатоцеллюлярной карциноме человека (ГЦК)34. Аналогичным образом, изменения в уровнях плоидности гепатоцитов связаны со связанными со старением хроническими заболеваниями печени, такими как неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП)35,36,37. Плоидия — это условие обладания более чем двумя копиями генома, которые могут быть исследованы путем окрашивания содержимого генома красителем ДНК, таким как Hoechst38. Краситель Hoechst, который добавляется в HB перед извлечением, маркирует все ядра во время протокола изоляции. Это позволяет проводить различие между диплоидными и полиплоидными ядрами на основе их содержания ДНК при возбуждении ультрафиолетовым (350 нм) или фиолетовым (450 нм) лазером на приборе проточной цитометрии. С помощью продемонстрированной стратегии 2n, 4n, 8n и более высокие уровни плоидии гепатоцитов могут быть исследованы в замороженной, архивированной печени, чтобы лучше понять роль клеточной гетерогенности в функциитканей 1 (рисунок 3A). Кроме того, ядерная морфология, включая размер и объем, может быть количественно определена с помощью визуализационной проточной цитометрии для корреляции изменений размера ядра с изменениями общего числа подсчетов или количества генов в зависимости от уровня плоидности (рисунок 3B, C).
Мультимодальное измерение омики дает возможность исследовать несколько слоев геномной организации одновременно. Совместный мультиомический подход РНК + ATAC позволяет исследовать регуляторы восходящего потока и нисходящие метаболические гены, обеспечивая комплексный подход к изучению транскрипционных сетей и архитектуры хроматина, связанной с функцией печени при одноклеточном разрешении. Кроме того, благодаря достижениям в вычислительных методах, которые могут учитывать разреженность данных и снижение затрат на секвенирование, одноклеточная мультиомика является пионером в оценке нескольких модальностей из одной и той же ячейки. Этот протокол изоляции одного ядра совместим с индивидуальной и совместной оценкой экспрессии и наборов данных хроматина. Мы использовали стандартные конвейеры, установленные Stuart et al.23 (пакет Signac), чтобы проиллюстрировать качество данных, в то время как несколько доступных и альтернативных вычислительных методов могут быть легко приняты для последующего анализа 23,39,40,41.
В целом, одноядерная мультиомика позволяет исследовать биоархивные, FF мышиные, человеческие и нечеловеческие ткани печени приматов с использованием очень небольшого количества исходного образца материала путем реализации протокола извлечения ядра, представленного здесь. Этот бесценный инструмент позволит биологам печени исследовать как экспрессию генов, так и доступность хроматина в контексте различных патологий печени. Кроме того, различные уровни плоидии гепатоцитов и результирующая корректировка экспрессии генов в зависимости от их расположения в дольке печени могут выявить их роль в патологиях печени. Поэтому мы ожидаем, что исследование клеточной гетерогенности предоставит новые возможности для развития прецизионной медицины и целенаправленных вмешательств против таких заболеваний, как ГЦК и НАЖБП.

Одноклеточная геномика быстро становится важной методологией для изучения функции печени и оценки влияния клеточной гетерогенности на здоровье и заболевания1. Быстрое развитие «мультиомики» для одновременного измерения различных слоев информации и параллельное расширение надежных вычислительных конвейеров прокладывает путь к открытию ранее неизвестных типов и подтипов клеток в нормальной и больной печени2.
Возможность изучения биобанков и архивных замороженных образцов значительно расширила возможности для пересмотра и открытия роли непаренхимальных клеток 3,4,5 и исследования роли полиплоидных гепатоцитов при старении и при хронических заболеваниях 6,7,8,9 . Таким образом, в данной работе описывается надежный и воспроизводимый протокол изоляции одного ядра для замороженных во вспышках (FF) архивных печени, который совместим с последующим секвенированием одноядерной РНК и секвенированием ATAC, а также с мультимодальными омиками (совместные RNA-seq и ATAC-seq) (рисунок 1).
Этот рабочий процесс позволяет исследовать транскриптом и доступность хроматина для всех типов клеток в печени, независимо от размера или хрупкости клеток, в протоколах ферментативной диссоциации. Он может быть выполнен с небольшими срезами тканей (15-30 мг или 5-10 мм3) из драгоценных образцов человека или трансгенных мышей. Определение высокой чистоты выделения ядер включает в себя количественную оценку и измерение размера ядра, который может коррелировать с увеличением размера клеток и старением10,11, и эта чистота актуальна для анализа как плоидии гепатоцитов12, так и клеточных размер-зависимых транскрипционных механизмов 11,13,14,15 . Кроме того, ядра, выделенные из замороженной печени, сохраняют ценную информацию о зонировании печени. Рабочий процесс и сбор тканей позволяют валидировать данные одноклеточной геномики или дальнейшие дополнительные анализы, такие как иммуногистохимия или пространственная транскриптомика из одной и той же ткани и одного и того же человека. Таким образом, этот подход может быть применен к множественным заболеваниям печени и моделировать организмы систематически и надежно.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20 - 5 mL</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive PCR film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Sorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000619</td>
			<td>Use chilled at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Kit v3.1, 4 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) 1 M solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td>Make 1 mM stock solution and use at 1 &#181;M final concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA AWAY Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10223471</td>
			<td>Wipe surfaces and pipettes before start of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16628742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16638742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (EB) - 250 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13527550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13518470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade - 100 mL&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10517694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters 50 &#181;m, sterile&#160;&#160;</td>
			<td>SYSMEX PARTEC - CELLTRICS</td>
			<td>04-004-2327</td>
			<td>Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) - 1 L</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP3905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herenz Heinz ABS Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen TE Buffer - 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11568846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2 M), RNase-free, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M), 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10209104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10733087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#246;rser 2 mL DOUNCE</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH</td>
			<td>9651632</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td>Or any other strip and tube mini centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Hemocytometer</td>
			<td>OMNILAB&#160; LABORZENTRUM</td>
			<td>5435293</td>
			<td>Visualize and count nuclei under microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips RT LTS 1000 &#181;L, Wide-O</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30389218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pistill &#34;A&#34; 2 mL</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH&#160;</td>
			<td>9651621</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pistill &#34;B&#34; 2 mL</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH</td>
			<td>9651627</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10579691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10634141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10100151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector RNase inhibitor - 2,000 U</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3335399001</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-based RNase Inhibitor SUPERase&#8226;In (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Clontech Takara</td>
			<td>2313B</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free microfuge tubes - 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Wipe surfaces and pipettes before start of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIselect - 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318</td>
			<td>Aliquot and store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, 500 g</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td>Make a 1 M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11798343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI (1M), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10671652</td>
			<td>Make 10% stock solution. Keep at 4 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11538886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex- Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-1372</td>
			<td>Or any other type of vortex</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of nuclei from flash-frozen liver tissue for single-cell multiomics

Печень представляет собой сложную и гетерогенную ткань, ответственную за выполнение многих критических физиологических функций, таких как поддержание энергетического гомеостаза и метаболизм ксенобиотиков, среди прочих. Эти задачи выполняются за счет тесной координации между печеночными паренхиматозными и непаренхиматозными клетками. Кроме того, различные метаболические активности ограничены определенными областями печеночной дольки - явление, называемое зонацией печени. Последние достижения в технологиях секвенирования одной клетки позволили исследователям исследовать гетерогенность тканей при разрешении одной клетки. Во многих сложных тканях, включая печень, жесткие ферментативные и /или механические протоколы диссоциации могут негативно повлиять на жизнеспособность или качество одноклеточных суспензий, необходимых для всесторонней характеристики этого органа в здоровье и заболевании.
В этой статье описывается надежный и воспроизводимый протокол выделения ядер из замороженных, архивных тканей печени. Этот метод дает высококачественные ядра, совместимые с последующими одноклеточными омическими подходами, включая одноядерную РНК-seq, анализ на транспозазно-доступный хроматин с высокопроизводительным секвенированием (ATAC-seq), а также мультимодальные омики (совместные RNA-seq и ATAC-seq). Этот метод был успешно использован для выделения ядер из здоровых и больных образцов замороженной печени человека, мыши и нечеловека приматов. Этот подход позволяет объективно выделить все основные типы клеток в печени и, следовательно, предлагает надежную методологию изучения печени с одноклеточным разрешением.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics at JoVE.com

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

Здесь мы представляем протокол выделения ядер из замороженных, архивных тканей печени для одноядерной РНК-seq, ATAC-seq и совместной мультиомики (RNA-seq и ATAC-seq).

Выделение ядер из замороженной ткани печени для одноклеточной мультиомики

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Этот простой и воспроизводимый протокол был успешно использован для выделения высококачественных ядер из здоровой и больной мышиной модели печени, а также печени человеческих и нечеловеческих приматов. Этот метод требует лишь небольшого количества замороженного тканевого материала. Кроме того, стимуляция по уровню плотности дает очень чистую ядерную суспензию со всеми основными типами клеток в печени, сохраненными в окончательной ядерной подготовке.Этот метод экстракции ядер может быть использован в биоархивных образцах печени человека, которые хранятся в биобанках. Начните гомогенизацию ткани, вырезав кусок куба размером 2230 миллиграммов или пять миллиметров из ткани печени, помещенной в чашку Петри на сухом льду с помощью предварительно охлажденного скальпеля. Немедленно переложите чашку Петри на влажный лед и добавьте один миллилитр буфера гомогенизации.Используя холодный скальпель, измельчите ткань как можно больше, позволяя ей аспирироваться с одним миллилитровым широким наконечником отверстия. Соберите тканевую суспензию и перенесите ее в предварительно охлажденный двухмиллилитровой стеклянный гомогенизатор. Вымойте чашку Петри дополнительным 0,521 миллилитра буфера гомогенизации и соберите все оставшиеся кусочки ткани, сохраняя все на льду.Медленно и осторожно выполните пять ударов рыхлым пестиком А по льду, не создавая пузырьков. Убедитесь, что пестик осторожно перемещается сверху вниз гомогенизатора с каждым ударом. Впоследствии выполните от 10 до 15 медленных ударов тугой пестикой В по льду без образования пузырьков.После этого отфильтруйте гомогенат через 50-микрометровый клеточный сетчатый фильтр, переместив его в предварительно охлажденную трубку объемом 1,5 миллилитра. Используйте более одного фильтра или трубки для гомогенатов, содержащих большое количество соединительнотканных сгустков. Промойте гомогенизатор и фильтры дополнительным 0,521 миллилитра буфера гомогенизации, чтобы тщательно собрать все гомогенаты тканей перед центрифугированием градиента плотности.Для центрифугирования градиента плотности центрифугируют отфильтрованный гомогенат в предварительно охлажденной центрифуге с фиксированным углом при 1000 G в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия. Пока образец центрифугируется, подготовьте 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 250 микролитров 50%-годиксанолового разведения и одну двухмиллилитровую трубку, содержащую 500 микролитров 29%-годиксанолового разведения. Поместите обе трубки на лед.Затем из суспензии центрифуги аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу с помощью вакуумного насоса. Повторно суспендируйте гранулу в 250 микролитрах буфера гомогенизации, используя наконечник пипетки шириной в один миллилитр. Затем переложите 250 микролитров суспензии ядер в предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 250 микролитров 50% йодиксанола, и аккуратно и тщательно перемешайте ее для получения 25%-ной суспензии ядер йодиксанола.Далее перекладывают 500 микролитров 25%-ной суспензии ядер йодиксанола в предварительно охлажденную трубку миллилитра, содержащую 500 микролитров 29%-гоодиксанолового разведения. Центрифугируйте трубку в предварительно охлажденной центрифуге с качающимся ведром при 12 500 Г в течение 20 минут с выключением перерыва. Непосредственно перед завершением стадии центрифугирования добавьте ингибиторы РНК в буфер хранения ядер или NSB, приступая к конвейерам секвенирования РНК с одним ядром.После завершения центрифугирования аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу с помощью вакуумного насоса. Осторожно повторно суспендируйте гранулу в 100-300 микролитрах NSB, используя наконечник отверстия шириной в один миллилитр, и перенесите суспензию ядер в чистую предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую трубку. Подсчитайте ядра с помощью раствора трипан-синего с помощью ручного гемоцитометра и сразу же используйте полученную суспензию ядер для анализа геномики одного ядра.Для сортировки клеток на основе проточной цитометрии фильтруйте суспензию ядер через 50-микрометровый фильтр в предварительно охлажденную пятимиллилитровую флуоресцентную активированную сортировку клеток или факсимильную трубку. Используйте сортировщик проточной цитометрии, оснащенный 100-микрометровым соплом, и загрузите факсимильную трубку на сортировщик перед предварительным просмотром образца. Настройте стратегию гатинга для сортировки ядер, начиная с затвора рассеяния, отображая прямую область рассеяния против области бокового рассеяния, затем мистификационную высоту против мистификационной области, а затем мистификационную ширину против мистификационной области.Визуализируйте профиль плоидности ядер на гистограмме искаженной области. Для сортировки на 96 или 384 скважинные пластины установите задержку капель и оптимизируйте выравнивание пластин колорметрическим методом. Установите охлаждение образца и держатель пластины на четыре градуса Цельсия с включенным вращением образца при 300 оборотах в минуту.Сортируйте одиночные ядра с концентрацией образца примерно в один раз от 10 до пятого ядра на миллилитр со скоростью потока от 200 до 500 событий в секунду. Микроскопическое исследование ядер, извлеченных из замороженной печени, показало, что стадия центрифугирования градиента плотности значительно облегчала удаление нежелательных клеточных и тканевых обломков. Эта методология сохранила все уровни плоидности, которая была подтверждена и количественно определена цитометрическим анализом.Показатели высокого качества наблюдались на основе данных, полученных с помощью экстракции ядер. Равномерное многообразное приближение и проекция представляли собой количество подсчетов по всем ядрам и основным типам клеток, которые можно уверенно идентифицировать только с ядерным транскриптомом и относительно неглубоким секвенированием. Этот подход позволил исследовать специфические для печени факторы транскрипции и гены-мишени, участвующие в метаболизме ксенобиотиков.Дополнительный паттерн отличительных генов, таких как процентральный CYP2E1 и перипортальный CYP2F2, показал, что извлеченные ядра сохраняют критическую информацию о донорстве печени. Библиотека экспрессии генов РНК была секвенирована на глубину 44 600 считываний на ядро, а библиотека ATAC на глубину 43 500 считываний на ядро. Взвешенный анализ ближайшего соседа, выполненный для нескольких измерений обеих модальностей, РНК плюс ATAC, с использованием пакетов Seurat и Signac, позволил идентифицировать и аннотировать основные и второстепенные типы клеток печени без заметных смещений из-за размера клеток или ядерной хрупкости.В этом методе также были обнаружены регуляторы транскрипции и отличительные гены донорства печени. Важно избегать создания слишком большого количества пузырьков во время гомогенизации пуха при перемещении пестиков вверх и вниз и придерживаться количества штрихов, указанных в протоколе.

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Изоляция нейронов ядра из человеческих тканей мозга Посмертные

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Генерация одноклеточных суспензий от мыши нервной ткани

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity основе Выделение Tagged ядер от<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Ткани для анализа экспрессии генов

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Изоляция ядер от цельного ткани с помощью метода для детей, свободных от ферментов,

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Экстракция хроматина из замороженной химерной ткани печени для анализа иммунопреципитации хроматина

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Выделение ядер из почек взрослой мыши для секвенирования одноядерной РНК

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Выделение, характеристика и терапевтическое применение внеклеточных везикул из культивируемых мезенхимальных стволовых клеток человека

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Препарат одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии для секвенирования одноклеточных клеток

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Выделение и транскриптомный анализ типов растительных клеток

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...