Name: isolation of nuclei from flash-frozen liver tissue for single-cell multiomics
Uploaded: 2022-12-09T14:40:00
Duration: 9 min 9 s
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Esta investigación fue apoyada por el Helmholtz Pioneer Campus (M.S., K.Y., C.P.M.-J.) y el Instituto de Biología Computacional (C. T.-L.). Esta investigación también fue apoyada por AMED bajo el número de subvención JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). Agradecemos el apoyo de Core Genomics en HMGU (I. de la Rosa) y Bioinformatics (T. Walzthoeni), en particular Xavier Pastor por su capacitación y orientación. Agradecemos a A. Feuchtinger, U. Buchholz, J. Bushe y a todos los demás miembros del personal de la instalación central de Patología y Análisis de Tejidos de HMGU por su apoyo técnico y científico, así como a J. Zorn, R. Erdelen, D. Würzinger, miembros del personal de E-Streifen, así como a la instalación central de Servicios para Animales de Laboratorio por su apoyo científico y discusión en curso. Estamos agradecidos con Core Facility Cell Analysis en TranslaTUM (R. Mishra) y Luminex, A DiaSorin Company (P. Rein). Agradecemos al Dr. I Deligiannis por su apoyo técnico. El Dr. M. Hartman, el Dr. A. Schröder y la Sra. A. Barden (Helmholtz Pioneer Campus) fueron fundamentales para su apoyo legal, administrativo y administrativo.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con la legislación alemana de bienestar animal y las regulaciones del Gobierno de Alta Baviera. El alojamiento de los animales fue aprobado de acuerdo con el §11 de la Ley alemana de bienestar animal y realizado de acuerdo con la Directiva 2010/63 / UE.
1. Preparación del tejido
<ol><li>Sacrificar un ratón macho C57BL / 6J de 3 meses a 22 meses de edad por dislocación cervical. Coloque al animal en una tabla de disección, asegure las extremidades con alfileres y desinfecte el abdomen con etanol al 70%.</li>
	<li>Realizar necropsia según lo recomendado por Treuting et al.16.<ol><li>Abra el abdomen hasta la caja torácica, visualice el hígado y use fórceps para extraer cuidadosamente el hígado sin perforar los lóbulos.</li>
		<li>Extraiga el hígado intacto sosteniendo el diafragma con fórceps y retirando el tejido de conexión con tijeras.</li>
	</ol></li>
	<li>Lave el órgano en solución salina tamponada con fosfato frío (PBS), séquelo con una toalla de papel limpia y corte los lóbulos hepáticos en varios pedazos para diferentes propósitos: FF para aislamiento de un solo núcleo y multiómica; fijación de paraformaldehído (PFA al 10%) para la incorporación de parafina; y/o incrustado en un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) para análisis histológicos adicionales (Figura 1A).</li>
	<li>Alícuota las piezas hepáticas en crioviales o tubos de tapón de rosca de 5 ml, e inmediatamente congelar rápidamente en nitrógeno líquido. Almacene las muestras de hígado congeladas a -80 °C para experimentos multiómicos de núcleo único aguas abajo (Figura 1B, C). NOTA: El tejido criopreservado se puede almacenar de forma segura a -80 °C durante varios años y siempre debe transportarse en hielo seco a -80 °C antes de su uso.</li>
</ol>2. Aislamiento de núcleos
<ol><li>Limpieza de sobremesa y preparación de los buffers y consumibles<ol><li>Limpie los bancos de trabajo y las pipetas con una solución de descontaminación de etanol y RNasa al 70%, o utilice mesas y materiales dedicados libres de RNasa.</li>
		<li>Preenfríe tanto el cucharón oscilante como las centrífugas de ángulo fijo, los tubos de 1,5 ml/2 ml y las placas de pocillos múltiples a 4 °C, como se detalla a continuación.</li>
		<li>Preenfríe las pinzas de un solo uso sin RNasa utilizadas para la manipulación de tejidos, un bisturí estéril desechable y una placa de Petri en hielo seco (-60 °C).</li>
		<li>Enfriar previamente el homogeneizador de vidrio Dounce y los morteros sobre hielo (4 °C). Coloque cada mortero (A y B) en un tubo de 5 ml para evitar el contacto directo con el hielo y la posible contaminación por RNasa.</li>
		<li>Prepare una solución diluyente de medio de iodixanol (IDM) (Tabla 1A) y úsela para hacer diluciones al 50% y 29% del medio de gradiente de densidad de material de iodixanol al 60% (Tabla 1B y Tabla 1C, respectivamente).</li>
		<li>Preenfríe todos los tubos. Para cada muestra que se va a procesar, prepare los siguientes tubos:<ol><li>Prepare tres tubos de unión de ADN bajo de 1,5 ml (uno para el homogeneizado de tejido filtrado, un segundo que contenga 250 μL de una dilución al 50% de solución de iodixanol y un tercero para la suspensión de núcleos limpios).</li>
			<li>Prepare un tubo de fondo redondo de 2 ml que contenga 500 μL de una dilución al 29% de solución de iodixanol para la separación por gradiente de densidad.</li>
			<li>Preparar un tubo cónico de 15 ml para el medio de aislamiento de núcleos-2 (NIM-2) y el tampón de homogeneización (HB).</li>
		</ol></li>
		<li>Preparar el aislamiento de núcleos medio-1 (NIM-1) (Tabla 1D), y utilizarlo para realizar el NIM-2 (Tabla 1E) y, posteriormente, el HB (Tabla 1F). Agregue ambos inhibidores de la ARNasa justo antes de usar, como se describe a continuación en el protocolo.</li>
		<li>Prepare el tampón de almacenamiento de núcleos (NSB) como se describe en la Tabla 1G. Agregue un inhibidor de la ARNasa recombinante justo antes de usar. Agregue un inhibidor de ARNasa basado en proteínas en el NSB antes de usarlo para la clasificación de FACS (opcional).</li>
		<li>Prepare un vaso de precipitados de 500 ml con agua estéril para remojar los homogeneizadores y morteros Dounce después de la homogeneización del tejido para la limpieza y mantenimiento óptimos de los homogeneizadores.</li>
	</ol></li>
	<li>Homogeneización tisular<ol><li>Corte una pieza de tejido de 20-30 mg (o 5 mm3) con un bisturí preenfriado dentro de la placa de Petri en hielo seco. A continuación, transfiera inmediatamente la placa de Petri a hielo húmedo (4 °C). Agregue 1 ml de HB y, con el bisturí frío, pique el tejido tanto como sea posible para permitir que se aspire fácilmente con una punta de orificio ancho de 1 ml. NOTA: Utilice siempre puntas de orificio ancho para todas las transferencias de tejido/núcleo. Como alternativa, se pueden cortar puntas de 1 ml con un bisturí estéril sobre una cubierta de plástico estéril para generar orificios anchos (Figura 2A).</li>
		<li>Recoja la suspensión de tejido y transfiérala a un homogeneizador de vidrio de 2 ml preenfriado (Figura 2B).</li>
		<li>Lave la placa de Petri con 0.5-1 ml adicionales de HB y recoja todas las piezas de tejido restantes mientras mantiene todo en hielo.</li>
		<li>Lentamente y con cuidado, haz cinco golpes con el mortero suelto A sobre hielo. Evite crear burbujas usando movimientos de torsión de la mano de mortero al tirar de ella hacia arriba y hacia abajo. Asegúrese de que el mortero se mueva cuidadosamente de la parte superior a la inferior del homogeneizador con cada golpe.</li>
		<li>Posteriormente, realice 10-15 movimientos lentos con mortero B apretado sobre hielo . Evita crear burbujas. NOTA: Se recomienda inspeccionar visualmente los núcleos bajo el microscopio después de 10 golpes con mortero B para determinar si se necesitan más golpes. Para ello, utilice tinción con azul de tripano (proporción 1:1 de tripano a muestra) y un hemocitómetro manual (p. ej., mezcle 10 μL de azul de tripano con 10 μL de suspensión de núcleos y use 10 μL de la mezcla para examinarla bajo el microscopio; Figura 2C).</li>
		<li>Filtre el homogeneizado a través de un filtro celular de 50 μm mientras lo transfiere a un tubo preenfriado de 1,5 ml. Use más de un filtro y/o tubo para homogeneizados que contengan una gran cantidad de grumos de tejido conectivo.</li>
		<li>Enjuague el homogeneizador y los filtros utilizados con 0.5-1 ml adicionales de HB para recoger completamente todo el homogeneizado del tejido. Proceda a la centrifugación por gradiente de densidad.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugación por gradiente de densidad<ol><li>Centrifugar el homogeneizado filtrado en una centrífuga preenfriada de ángulo fijo a 1.000 × g durante 8 min a 4 °C.</li>
		<li>Mientras la muestra está girando, prepare un tubo de 1,5 ml que contenga 250 μL de dilución de iodixanol al 50% y un tubo de 2 ml que contenga 500 μL de dilución de iodixanol al 29%. Mantenga ambos tubos en hielo.</li>
		<li>Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante sin alterar el pellet con una bomba de vacío. NOTA: El uso de pipeteo manual comprometerá la calidad de la suspensión final de los núcleos.</li>
		<li>Añadir 250 μL de HB al pellet utilizando la punta de pipeta de orificio ancho de 1 ml y resuspender muy lentamente.</li>
		<li>Transfiera 250 μL de la suspensión de núcleos a un tubo preenfriado de 1,5 ml que contenga 250 μL de dilución de iodixanol al 50%, y mezcle suave pero completamente para generar una suspensión de iodixanol/núcleos al 25%.</li>
		<li>Transfiera 500 μL de la suspensión de yododinaxanol/núcleos al 25% a un tubo preenfriado de 2 ml que contenga 500 μL de dilución de iodixanol al 29%. NOTA: Los 500 μL de la suspensión de iodixanol/núcleos al 25% deben depositarse suavemente sobre los 500 μL de solución de iodixanol al 29%, de modo que las mezclas de iodixanol al 25%/29% muestren una clara separación de fases. Utilice el lado de la pared del tubo con la punta de la pipeta colocada en un ángulo de 45° para crear esta interfaz de degradado. A partir de entonces, el tubo debe manipularse suavemente para no alterar este gradiente.</li>
		<li>Centrifugar el tubo en una centrífuga de cucharón oscilante preenfriada a 12.500 g durante 20 minutos con el freno apagado.</li>
		<li>Justo antes de completar el paso de centrifugación, agregue los inhibidores de ARNasa al tampón NSB cuando proceda a las tuberías scRNA-seq (consulte la Tabla 1G).</li>
		<li>Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante sin alterar el pellet con una bomba de vacío. NOTA: El uso de pipeteo manual comprometerá la calidad de la suspensión final de los núcleos.</li>
		<li>Con la punta de la pipeta de orificio ancho de 1 ml, resuspenda suavemente el pellet en 100-300 μL de NSB y transfiera la suspensión de núcleos a un tubo limpio y preenfriado de 1,5 ml.</li>
		<li>Contar los núcleos usando solución de azul de tripano (proporción 1:1 de tripano a muestra) y un hemocitómetro manual (p. ej., mezclar 10 μL de azul de tripano con 10 μL de suspensión de núcleos, y usar 10 μL de la mezcla para el recuento; Figura 2D).</li>
		<li>Utilice inmediatamente la suspensión de núcleos obtenida para el ensayo genómico de núcleo único. NOTA: La suspensión de núcleos en NSB se puede almacenar refrigerada a 4 °C durante un máximo de 1 semana para su posterior análisis por citometría de flujo y/o flujo de imágenes, pero no para snRNA-seq o snATAC-seq.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Clasificación de núcleos para el perfil de ploidía de hepatocitos o enfoques de secuenciación bien basados
<ol><li>Para la clasificación celular basada en citometría de flujo, filtrar la suspensión de núcleos a través de un filtro de 50 μm en un tubo FACS preenfriado de 5 ml.</li>
	<li>Utilice un clasificador de citometría de flujo equipado con una boquilla de 100 μm. Cargue el tubo FACS en el clasificador y obtenga una vista previa de la muestra.</li>
	<li>Configure la estrategia de compuerta para la clasificación de núcleos, comenzando con una puerta de dispersión trazando el área de dispersión hacia adelante frente al área de dispersión lateral (FSC-A / SSC-A), seguida de Hoechst-Height versus Hoechst-Area (puerta de núcleos), y luego Hoechst-Width versus Hoechst-Area (puerta singlets). Visualice el perfil de ploidía de los núcleos en el histograma del área de Hoechst. NOTA: Para una mejor resolución máxima, visualice el canal de Hoechst (450/50) en la escala lineal (Figura 3A).</li>
	<li>Para clasificar en placas de 96/384 pocillos, ajuste el retardo de gotas y optimice la alineación de la placa utilizando el método colorimétrico con sustrato de bencidina peroxidasa de rábano picante (TMB-HRP), como se describió anteriormente6.</li>
	<li>Ajuste tanto el enfriamiento de la muestra como el soporte de la placa para que se enfríen a 4 °C, con la rotación de la muestra encendida a 300 rpm.</li>
	<li>Ordenar los núcleos individuales a una concentración de muestra de ~1 x 105 núcleos/ml y con un caudal de 200-500 eventos/s.</li>
</ol>4. Inspección visual y cuantificación de parámetros nucleares mediante citometría de imagen (opcional)
<ol><li>Cargue un tubo de 0,5 ml que contenga 50 μL de la suspensión de núcleos a una concentración de 2 × 107 núcleos/ml.</li>
	<li>Configure una puerta de todos los eventos basada en la relación de aspecto frente al canal de fluorescencia de Hoechst para visualizar el perfil de ploidía de los núcleos (Figura 3B).</li>
	<li>Adquiera la muestra con un aumento de 40x utilizando campo claro (BF) y el canal de fluorescencia de Hoechst.</li>
	<li>Inspeccione y cuantifique núcleos 2n y 4n utilizando la medición de campo claro y la intensidad de fluorescencia de Hoechst con software de citometría de imágenes (Figura 3C).</li>
</ol>5. Construcción y secuenciación de bibliotecas de ARN-seq, ATAC-seq o multioma de un solo núcleo
<ol><li>Para enfoques snRNA-seq basados en gotas, cargue la suspensión de núcleos purificados directamente en el dispositivo microfluídico para la partición paralela automatizada y el código de barras molecular17.</li>
	<li>Después de completar la ejecución microfluídica en el dispositivo de partición de una sola célula, recoja los núcleos encapsulados en perlas de gel, incube y limpie como se describe anteriormente en las pautas del fabricante17.</li>
	<li>Realice 11 ciclos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la preamplificación del ADNc utilizando el siguiente programa: 3 min a 98 °C, (15 s a 98 °C, 20 s a 63 °C y 1 min a 72 °C) x 11, 1 min a 72 °C y mantener a 4 °C. Continúe con una reparación final y un paso de cola en A y la ligadura del adaptador, según lo indicado por el fabricante17. Para la posterior construcción final de la biblioteca de expresión génica, realice 10 ciclos de PCR utilizando el siguiente programa: 45 s a 98 °C, (20 s a 98 °C, 30 s a 54 °C, 20 s a 72 °C) x 10, 1 min a 72 °C y mantener a 4 °C.</li>
	<li>Secuencie las bibliotecas obtenidas a una profundidad de lectura de ~20,000-50,000 lecturas medias por núcleo.</li>
	<li>Para la secuenciación basada en gotitas de multiómica articular (ARN + ATAC), incubar los núcleos hepáticos en tampón de lisis durante 5 minutos y luego etiquetarlos durante 1 h, como se describió anteriormente18.</li>
	<li>Cargue los núcleos etiquetados directamente en un dispositivo microfluídico para la partición paralela automatizada y el código de barras molecular.</li>
	<li>Una vez completada la ejecución microfluídica, recoja los núcleos encapsulados en perlas de gel, incube y limpie como lo describe el fabricante18.</li>
	<li>Realice seis ciclos de PCR para el paso de preamplificación del ADNc utilizando el siguiente programa: 5 min a 72 °C, 3 min a 98 °C, (20 s a 98 °C, 30 s a 63 °C, 1 min a 72 °C) x 6, 1 min a 72 °C y mantener a 4 °C.</li>
	<li>Tomar 35 μL de la muestra preamplificada y realizar una amplificación de ADNc de la siguiente manera: 3 min a 98 °C, (15 s a 98 °C, 20 s a 63 °C, 1 min a 72 °C) x 6, 1 min a 72 °C y mantener a 4 °C. Continúe con la reparación final y el paso de cola en A y la ligadura del adaptador, según lo indicado por el fabricante18 . Para la posterior PCR de indexación final de la muestra, realice 15 ciclos de PCR de la siguiente manera: 45 s a 98 °C, (20 s a 98 °C, 30 s a 54 °C, 20 s a 72 °C) x 15, 1 min a 72 °C y mantener a 4 °C.</li>
	<li>Para la construcción de bibliotecas ATAC, use 40 μL y amplíe durante seis ciclos de PCR para la indexación de muestras utilizando el siguiente programa: 45 s a 98 °C, (20 s a 98 °C, 30 s a 67 °C, 20 s a 72 °C) x 6, 1 min a 72 °C y mantener a 4 °C.</li>
	<li>Secuenciar las bibliotecas de expresión génica multioma obtenidas a una profundidad de lectura mínima de 20.000 pares de lectura por núcleo y las bibliotecas ATAC multiome a una profundidad de lectura mínima de 25.000 pares de lectura por celda, según lo recomendado por el fabricante18.</li>
</ol>

<ol>
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Document number CG000338 (Rev D). 10x Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide</a> (2021)</li><li>MacParland, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA+sequencing+of+human+liver+reveals+distinct+intrahepatic+macrophage+populations.">Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations.</a> Nature Communications. 9 (1), 4383 (2018).</li><li>Martinez-Jimenez, C. P., Kyrmizi, I., Cardot, P., Gonzalez, F. 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A., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+state+analysis+with+Signac.">Single-cell chromatin state analysis with Signac.</a> Nature Methods. 18 (11), 1333-1341 (2021).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+organoids+can+repair+bile+ducts+after+transplantation+in+the+human+liver.">Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver.</a> Science. 371 (6531), 839-846 (2021).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows.">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).</li><li>Nault, R., Fader, K. A., Bhattacharya, S., Zacharewski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nuclei+RNA+sequencing+assessment+of+the+hepatic+effects+of+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.">Single-nuclei RNA sequencing assessment of the hepatic effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (1), 147-159 (2021).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+as+a+mechanism+for+stress-induced+liver+adaptation.">Aneuploidy as a mechanism for stress-induced liver adaptation.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (9), 3307-3315 (2012).</li><li>Kreutz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+ploidy+is+a+diversity+factor+for+liver+homeostasis.">Hepatocyte ploidy is a diversity factor for liver homeostasis.</a> Frontiers in Physiology. 8, 862 (2017).</li><li>Hunt, N. J., Kang, S. W. S., Lockwood, G. P., Le Couteur, D. G., Cogger, V. 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N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (6), 387-393 (1993).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Granja, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArchR+is+a+scalable+software+package+for+integrative+single-cell+chromatin+accessibility+analysis.">ArchR is a scalable software package for integrative single-cell chromatin accessibility analysis.</a> Nature Genetics. 53 (3), 403-411 (2021).</li><li>Bredikhin, D., Kats, I., Stegle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUON:+Multimodal+omics+analysis+framework.">MUON: Multimodal omics analysis framework.</a> Genome Biology. 23 (1), 42 (2022).</li><li>Velten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+temporal+and+spatial+patterns+of+variation+from+multimodal+data+using+MEFISTO.">Identifying temporal and spatial patterns of variation from multimodal data using MEFISTO.</a> Nature Methods. 19 (2), 179-186 (2022).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

La disección de la composición celular del hígado por RNA-seq de una sola célula o de un solo núcleo proporciona una comprensión más profunda del desarrollo y la progresión de la enfermedad hepática 3,4,5,24. El aislamiento unicelular de hígados consume mucho tiempo y requiere protocolos que involucran disociación mecánica o enzimática severa25,26,27. Es ampliamente aceptado que cada tejido requiere una evaluación sistemática para determinar el protocolo óptimo de disociación tisular, así como un método de almacenamiento adecuado para capturar tipos de células frágiles o núcleos28. Dependiendo de la disponibilidad de tejido, la enfermedad de interés, la etapa de desarrollo o el organismo modelo, la preparación de una suspensión de un solo núcleo para el procesamiento posterior podría ser una metodología más adecuada que el uso de suspensiones unicelulares. Es importante destacar que, en el hígado, scRNA-seq y snRNA-seq han mostrado una alta correlación entre el ARNm nuclear y citoplasmático, sugiriendo que ambos enfoques presentan información complementaria 2,3,4,6,29.
Este documento proporciona un aislamiento estandarizado, robusto y reproducible de un solo núcleo a partir de muestras de hígado congeladas y archivadas de ratones y otras especies, incluidos humanos y macacos. Este método se puede utilizar para ratones de tipo salvaje alimentados con comida y una dieta alta en grasas (HFD) y para modelos de fibrosis hepática en ratones utilizando enfoques genómicos de núcleo único basados en placas y gotitas6. Este método se basa en el protocolo descrito originalmente para el tejido cerebral por Krishnaswami et al.30 con modificaciones adicionales adaptadas para el hígado congelado rápidamente. La homogeneización óptima libera la mayoría de los núcleos del tejido sin afectar negativamente la integridad de la membrana nuclear. Sin embargo, la sobreduplicación puede dañar los núcleos frágiles y disminuir su calidad general. Los hígados jóvenes y / o grasos generalmente requieren solo 5 golpes con mortero A y 10 golpes con mortero B, mientras que los hígados viejos y / o fibróticos pueden requerir 15 golpes con mortero B pero no más. No se recomienda, por lo tanto, realizar más trazos más allá de los números aquí indicados. La sobreduplicación podría afectar negativamente la calidad de la suspensión de un solo núcleo y aumentar la cantidad de ARN ambiental. Posteriormente, esto podría llevar a la necesidad de realizar pasos adicionales de filtrado computacional durante los análisis de datos posteriores.
El protocolo presentado aquí es versátil y se puede ajustar a diferentes afecciones hepáticas en ratones jóvenes (3 meses) y viejos (24 meses). Dado que encontramos que una sección más grande del hígado es necesaria para los tejidos viejos, HFD y fibróticos, el tamaño del tejido disponible para el procesamiento puede representar una limitación para algunos usuarios con cantidades más pequeñas de material biológico inicial. Sin embargo, la purificación por gradiente es muy recomendable para el procesamiento inmediato de muestras con ensayos genómicos basados en gotas. Si los núcleos necesitan ser FACS ordenados en placas de 96/384 pocillos para ensayos bien basados, se puede omitir la purificación por gradiente. Alentamos a los usuarios a realizar la purificación del gradiente si hay suficiente muestra de tejido para obtener la concentración de núcleos recomendada para la clasificación de FACS (es decir, ~ 1 × 105 núcleos / ml).
El hígado se caracteriza por la naturaleza poliploide de los hepatocitos9, pero el papel de la ploidía de los hepatocitos en la fisiología normal y la enfermedad aún no está claro. Existe un creciente cuerpo de evidencia que indica que la ploidía proporciona variabilidad genómica31, y es bien sabido que la ploidía aumenta con la edad 32,33. Sin embargo, el enriquecimiento de los hepatocitos tetraploides mononucleados también se asocia clínicamente con un mal pronóstico en el carcinoma hepatocelular humano (CHC)34. Del mismo modo, los cambios en los niveles de ploidía de hepatocitos están relacionados con enfermedades hepáticas crónicas relacionadas con el envejecimiento, como la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD)35,36,37. La ploidía es la condición de poseer más de dos copias del genoma, que se puede explorar teñiendo el contenido del genoma con un tinte de ADN como Hoechst38. El colorante Hoechst, que se agrega al HB antes de la extracción, etiqueta todos los núcleos durante el protocolo de aislamiento. Esto permite la distinción entre núcleos diploides y poliploides en función de su contenido de ADN cuando son excitados por un láser UV (350 nm) o violeta (450 nm) en un instrumento de citometría de flujo. Con la estrategia de compuerta mostrada, se pueden investigar niveles 2n, 4n, 8n y más altos de ploidía de hepatocitos en hígados congelados y archivados para comprender mejor el papel de la heterogeneidad celular en la función tisular1 (Figura 3A). Además, la morfología nuclear, incluyendo el tamaño y el volumen, se puede cuantificar utilizando citometría de flujo de imágenes para correlacionar los cambios en el tamaño del núcleo con los cambios en el número total de recuentos o el número de genes dependiendo del nivel de ploidía (Figura 3B, C).
La medición ómica multimodal ofrece la oportunidad de investigar varias capas de organización genómica simultáneamente. El enfoque multiómico conjunto ARN + ATAC permite la investigación de reguladores aguas arriba y genes metabólicos aguas abajo, proporcionando un enfoque integral para estudiar las redes transcripcionales y la arquitectura de la cromatina asociada con la función hepática a la resolución de una sola célula. Además, con los avances en los métodos computacionales que pueden explicar la escasez de datos y la reducción en los costos de secuenciación, la multiómica de una sola célula es pionera en la evaluación de múltiples modalidades de la misma célula. Este protocolo de aislamiento de núcleo único es compatible con la evaluación individual y conjunta de conjuntos de datos de expresión y cromatina. Hemos utilizado pipelines estándar establecidos por Stuart et al.23 (paquete Signac) para ilustrar la calidad de los datos, mientras que varios métodos computacionales disponibles y alternativos pueden ser fácilmente adoptados para análisis posteriores23,39,40,41.
En general, la multiómica de un solo núcleo permite la investigación de tejidos hepáticos de primates bioarchivados, de ratón FF, humanos y no humanos utilizando una cantidad muy pequeña de material de muestra inicial mediante la implementación del protocolo de extracción de núcleos presentado aquí. Esta herramienta invaluable permitirá a los biólogos hepáticos interrogar tanto la expresión génica como la accesibilidad a la cromatina en el contexto de diversas patologías hepáticas. Además, varios niveles de ploidía de hepatocitos y el ajuste resultante de la expresión génica dependiendo de su ubicación en el lóbulo hepático podrían revelar su papel en las patologías hepáticas. Por lo tanto, anticipamos que la investigación de la heterogeneidad celular proporcionará nuevas oportunidades para el desarrollo de la medicina de precisión y las intervenciones dirigidas contra enfermedades como el CHC y la NAFLD.

La genómica unicelular se está convirtiendo rápidamente en una metodología esencial para estudiar la función hepática y evaluar el impacto de la heterogeneidad celular en condiciones de salud y enfermedad1. El rápido desarrollo de la "multiómica" para la medición simultánea de diferentes capas de información y la expansión paralela de tuberías computacionales robustas está allanando el camino para el descubrimiento de tipos y subtipos celulares previamente desconocidos en el hígado normal y enfermo2.
La posibilidad de explorar biobancos y muestras congeladas archivadas ha aumentado significativamente las oportunidades para revisar y descubrir el papel de las células no parenquimatosas 3,4,5 e investigar el papel de los hepatocitos poliploides durante el envejecimiento y en enfermedades crónicas 6,7,8,9 . Por lo tanto, este documento describe un protocolo de aislamiento de núcleo único robusto y reproducible para hígados archivados congelados (FF) que es compatible con la secuenciación de ARN de núcleo único aguas abajo y la secuenciación ATAC, así como con ómicas multimodales (ARN-seq conjunto y ATAC-seq) (Figura 1).
Este flujo de trabajo permite la investigación del transcriptoma y la accesibilidad a la cromatina de todos los tipos celulares en el hígado, independientemente del tamaño o la fragilidad celular, en protocolos de disociación enzimática. Se puede realizar con pequeñas secciones de tejido (15-30 mg o 5-10 mm3) de muestras humanas preciosas o ratones transgénicos. La determinación de la alta pureza del aislamiento de los núcleos incluye la cuantificación y medición del tamaño nuclear, que podría correlacionarse con el aumento del tamaño celular y la senescencia 10,11, y esta pureza es relevante para el análisis tanto de la ploidía de hepatocitos 12 como de los mecanismos transcripcionales dependientes del tamaño celular11,13,14,15 . Además, los núcleos aislados de hígados congelados retienen información valiosa sobre la zonificación hepática. El flujo de trabajo y la recolección de tejidos permiten la validación de datos genómicos unicelulares o análisis complementarios adicionales, como inmunohistoquímica o transcriptómica espacial del mismo tejido y del mismo individuo. Por lo tanto, este enfoque se puede aplicar a múltiples afecciones de enfermedad hepática y organismos modelo de manera sistemática y confiable.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween 20 - 5 mL</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive PCR film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Sorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000619</td>
			<td>Use chilled at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Kit v3.1, 4 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) 1 M solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td>Make 1 mM stock solution and use at 1 &#181;M final concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA AWAY Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10223471</td>
			<td>Wipe surfaces and pipettes before start of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16628742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16638742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (EB) - 250 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13527550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13518470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade - 100 mL&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10517694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters 50 &#181;m, sterile&#160;&#160;</td>
			<td>SYSMEX PARTEC - CELLTRICS</td>
			<td>04-004-2327</td>
			<td>Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) - 1 L</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP3905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herenz Heinz ABS Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen TE Buffer - 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11568846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2 M), RNase-free, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M), 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10209104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10733087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#246;rser 2 mL DOUNCE</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH</td>
			<td>9651632</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td>Or any other strip and tube mini centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Hemocytometer</td>
			<td>OMNILAB&#160; LABORZENTRUM</td>
			<td>5435293</td>
			<td>Visualize and count nuclei under microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips RT LTS 1000 &#181;L, Wide-O</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30389218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pistill &#34;A&#34; 2 mL</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH&#160;</td>
			<td>9651621</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pistill &#34;B&#34; 2 mL</td>
			<td>Wagner &#38; Munz GmbH</td>
			<td>9651627</td>
			<td>RNase zap and rinse with MillQ before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10579691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10634141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10100151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector RNase inhibitor - 2,000 U</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3335399001</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-based RNase Inhibitor SUPERase&#8226;In (20 U/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2696</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Clontech Takara</td>
			<td>2313B</td>
			<td>Keep in -20 &#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free microfuge tubes - 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Wipe surfaces and pipettes before start of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIselect - 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318</td>
			<td>Aliquot and store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, 500 g</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td>Make a 1 M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11798343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI (1M), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100, 98%, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10671652</td>
			<td>Make 10% stock solution. Keep at 4 &#176;C and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11538886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex- Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-1372</td>
			<td>Or any other type of vortex</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of nuclei from flash-frozen liver tissue for single-cell multiomics

El hígado es un tejido complejo y heterogéneo responsable de llevar a cabo muchas funciones fisiológicas críticas, como el mantenimiento de la homeostasis energética y el metabolismo de los xenobióticos, entre otras. Estas tareas se realizan a través de una estrecha coordinación entre las células hepáticas parenquimatosas y no parenquimatosas. Además, varias actividades metabólicas se limitan a áreas específicas del lóbulo hepático, un fenómeno llamado zonificación hepática. Los avances recientes en las tecnologías de secuenciación de células individuales han permitido a los investigadores investigar la heterogeneidad tisular a una resolución de una sola célula. En muchos tejidos complejos, incluido el hígado, los protocolos de disociación enzimática y/o mecánica severa pueden afectar negativamente la viabilidad o la calidad de las suspensiones unicelulares necesarias para caracterizar exhaustivamente este órgano en salud y enfermedad.
Este documento describe un protocolo robusto y reproducible para aislar núcleos de tejidos hepáticos congelados y archivados. Este método produce núcleos de alta calidad que son compatibles con los enfoques ómicos de una sola célula aguas abajo, incluido el ARN-seq de un solo núcleo, el ensayo para la cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq), así como las ómicas multimodales (ARN-seq conjunto y ATAC-seq). Este método se ha utilizado con éxito para el aislamiento de núcleos de muestras de hígado congelado de humanos y no humanos sanos y enfermos. Este enfoque permite el aislamiento imparcial de todos los principales tipos de células en el hígado y, por lo tanto, ofrece una metodología sólida para estudiar el hígado a la resolución de una sola célula.

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Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

Aquí, presentamos un protocolo para aislar núcleos de tejidos hepáticos archivados congelados por flash para RNA-seq de núcleo único, ATAC-seq y multiómica articular (RNA-seq y ATAC-seq).

Aislamiento de núcleos de tejido hepático congelado rápidamente para multiómica unicelular

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Este protocolo fácil y reproducible se utilizó con éxito para aislar núcleos de alta calidad de hígados modelo de ratón sanos y enfermos, así como hígados de primates humanos y no humanos. Este método requiere solo una pequeña cantidad de material de tejido congelado. Además, la incentivación de grado de densidad proporciona una suspensión nuclear muy limpia con todos los tipos de células principales en el hígado conservados en la preparación nuclear final.Este método de extracción de núcleos se puede utilizar en muestras de hígado humano bioarchivadas que se almacenan en biobancos. Comience la homogeneización del tejido cortando una pieza cúbica de 2230 miligramos o cinco milímetros de un tejido hepático colocado en la placa de Petri en hielo seco con un bisturí preenfriado. Transfiera inmediatamente la placa de Petri al hielo húmedo y agregue un mililitro de tampón de homogeneización.Usando el bisturí frío, pica el tejido tanto como sea posible, permitiendo que aspire con una punta de orificio de un mililitro de ancho. Recoja la suspensión de tejido y transfiérala a un homogeneizador de vidrio de dos mililitros preenfriado. Lave la placa de Petri con 0,521 mililitros adicionales de tampón de homogeneización y recoja todas las piezas de tejido restantes mientras mantiene todo en hielo.Realice lenta y cuidadosamente cinco golpes con mortero suelto A sobre hielo sin crear burbujas. Asegúrese de que el mortero se mueva cuidadosamente de la parte superior a la inferior del homogeneizador con cada golpe. Posteriormente, realice de 10 a 15 movimientos lentos con mortero B apretado sobre hielo sin crear burbujas.Una vez hecho esto, filtre el homogeneizado a través de un filtro celular de 50 micrómetros mientras lo transfiere a un tubo de 1,5 mililitros preenfriado. Use más de un filtro o tubo para homogeneizados que contengan una gran cantidad de grupos de tejido conectivo. Enjuague el homogeneizador y los filtros con un tampón de homogeneización adicional de 0,521 mililitros para recoger completamente todos los homogeneizados de tejido antes de la centrifugación por gradiente de densidad.Para la centrifugación por gradiente de densidad, centrifugar el homogeneizado filtrado en una centrífuga de ángulo fijo preenfriada a 1000 G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados. Mientras la muestra se centrifuga, prepare un tubo de 1.5 mililitros que contenga 250 microlitros de dilución de iodixanol al 50% y un tubo de dos mililitros que contenga 500 microlitros de dilución de iodixanol al 29%. Coloque ambos tubos sobre hielo.Luego, desde la suspensión de la centrífuga, aspire el sobrenadante sin alterar el pellet con una bomba de vacío. Vuelva a suspender el pellet en 250 microlitros de tampón de homogeneización utilizando la punta de pipeta de orificio de un mililitro de ancho. Luego transfiera 250 microlitros de la suspensión de núcleos a un tubo preenfriado de 1.5 mililitros que contenga 250 microlitros de 50% de iodixanol y mezcle suave y completamente para generar una suspensión de núcleos de yodoxanol al 25%.A continuación, transfiera 500 microlitros de la suspensión de núcleos de iodixanol al 25% en un tubo de mililitro preenfriado que contenga 500 microlitros de dilución de iodixanol al 29%. Centrifugar el tubo en una centrífuga de cucharón oscilante preenfriada a 12, 500 G durante 20 minutos, con la pausa apagada. Justo antes de completar el paso de centrifugación, agregue los inhibidores de ARN al búfer de almacenamiento de núcleos, o NSB, mientras continúa con las tuberías de secuenciación de ARN de núcleo único.Después de completar la centrifugación, aspirar el sobrenadante sin alterar el pellet con una bomba de vacío. Vuelva a suspender suavemente el pellet en 100 a 300 microlitros de NSB usando la punta de pipeta de orificio de un mililitro de ancho y transfiera la suspensión de núcleos a un tubo limpio de 1.5 mililitros preenfriado. Contar los núcleos usando solución de azul de tripano con un hemocitómetro manual e inmediatamente usar la suspensión de núcleos obtenida para el ensayo de genómica de núcleo único.Para la clasificación celular basada en citometría de flujo, filtre la suspensión de núcleos a través de un filtro de 50 micrómetros en un tubo de fax o clasificación celular activada por fluorescencia de cinco mililitros preenfriada. Utilice un clasificador de citometría de flujo equipado con una boquilla de 100 micrómetros y cargue el tubo de fax en el clasificador antes de obtener una vista previa de la muestra. Configure la estrategia de compuerta para la clasificación de núcleos, comenzando con una puerta de dispersión trazando el área de dispersión hacia adelante frente al área de dispersión lateral, seguida de altura falsa frente a área falsa, y luego ancho falso versus área falsa.Visualice el perfil de ploidía de los núcleos en el histograma del área falsa. Para clasificar en placas de 96 o 384 pocillos, ajuste el retardo de gotas y optimice la alineación de la placa utilizando el método colormétrico. Ajuste el enfriamiento de la muestra y el soporte de la placa a cuatro grados centígrados con la rotación de la muestra activada a 300 RPM.Ordene los núcleos individuales a una concentración de muestra de aproximadamente una vez de 10 a cinco núcleos por mililitro con un caudal de 200 a 500 eventos por segundo. El examen microscópico de los núcleos extraídos de hígados congelados mostró que el paso de centrifugación del gradiente de densidad facilitó enormemente la eliminación de restos celulares y tisulares no deseados. Esta metodología preservó todos los niveles de ploidía, que fue validada y cuantificada por análisis citométrico.Se observaron métricas de alta calidad a partir de los datos obtenidos mediante extracción de núcleos. La aproximación y proyección uniforme de la variedad representó el número de recuentos en todos los núcleos y los principales tipos de células, que solo pueden identificarse con confianza con el transcriptoma nuclear y la secuenciación relativamente superficial. Este enfoque permitió la investigación de factores de transcripción específicos del hígado y genes diana posteriores implicados en el metabolismo de los xenobióticos.El patrón complementario de genes distintivos como el CYP2E1 percentral y el periportal CYP2F2 mostró que los núcleos extraídos retenían información crítica sobre la donación de hígado. La biblioteca de expresión génica del ARN se secuenció a una profundidad de 44.600 lecturas por núcleo y la biblioteca ATAC a una profundidad de 43.500 lecturas por núcleo. Un análisis ponderado del vecino más cercano realizado para múltiples mediciones de ambas modalidades, ARN más ATAC, utilizando los paquetes Seurat y Signac permitió la identificación y anotación de los tipos de células hepáticas mayores y menores sin sesgos prominentes debido al tamaño de la célula o la fragilidad nuclear.Los reguladores transcripcionales aguas arriba y los genes distintivos de la donación hepática también se detectaron en este método. Es importante evitar crear demasiadas burbujas durante la homogeneización del plumón al mover los morteros hacia arriba y hacia abajo, y atenerse al número de golpes indicado en el protocolo.

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Aislamiento de los núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post-mortem

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Investigación

Biología

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Generación de un solo suspensiones de células de tejido de ratón Neural

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Aislamiento a base de afinidad de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos para análisis de expresión génica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Aislamiento de núcleos de tejido entero utilizando un método de detergente y libre de enzimas

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Extracción de cromatina del tejido hepático quimérico congelado para el análisis de inmunoprecipitación de la cromatina

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Aislamiento de núcleos de riñón de ratón adulto para secuenciación de ARN de un solo núcleo

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Aislamiento, caracterización y aplicación terapéutica de vesículas extracelulares a partir de células madre mesenquimales humanas cultivadas

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Preparación de suspensión unicelular del intestino de tilapia del Nilo para secuenciación unicelular

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Análisis de aislamiento y transcriptoma de tipos de células vegetales

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Isolation and Profiling of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

Enhancing Drug Discovery - Development of Automated, Standardized Protocols for Nuclei Extraction from Frozen Tissues (Video) | JoVE

Un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para el aislamiento de núcleos individuales de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación de núcleos únicos