Name: rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection
Uploaded: 2023-02-24T14:40:00
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Wir möchten uns bei ehemaligen Mitgliedern des Weiss Labs bedanken, die die Poly-Transfektionsmethode und ihre Anwendung auf Zellklassifikatoren geleitet oder dazu beigetragen haben: Jeremy Gam, Bre DiAndreth und Jin Huh; weitere Weiss-Labormitglieder, die zur weiteren Methodenentwicklung/-optimierung beigetragen haben: Wenlong Xu, Lei Wang und Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard und Gruppenmitglieder, darunter Patrick Donahue und Hailey Edelstein, für die Prüfung der Polytransfektion und die Bereitstellung von Feedback; und Prof. Nika Shakiba für die Einladung zu diesem Manuskript und das Feedback. Wir möchten uns auch bei den National Institutes of Health [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792] bedanken; Nationale Wissenschaftsstiftung [1745645]; Cancer Center Support (core) Grant [P30CCA14051, teilweise] vom NCI und den National Institutes of Health [P50GM098792] zur Finanzierung dieser Arbeit.

HINWEIS: Tabelle 1 und Tabelle 2 dienen als wichtige Referenzen für dieses Protokoll. Tabelle 1 zeigt die Skalierung der Reagenzien für Reaktionen und Tabelle 2 zeigt die Arithmetik des DNA-Verhältnisses für eine im Protokoll beschriebene Beispiel-Polytransfektion (obere Hälfte) und für ein mögliches Folgeexperiment (untere Hälfte).
1. Zellen für die Transfektion vorbereiten
<ol><li>Stellen Sie sich...

<ol>
	<li>Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+gene+circuits+and+cellular+decision-making+in+human+pluripotent+stem+cells.">Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells.</a> Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).</li><li>Sayeg, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+designed+microRNA-based+genetic+classifiers+target+specific+neurons+in+the+brain.">Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).</li><li>Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Input+RNAi-based+logic+circuit+for+identification+of+specific+cancer+cells.">Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells.</a> Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).</li><li>Nissim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+RNA-based+immunomodulatory+gene+circuits+for+cancer+immunotherapy.">Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy.</a> Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).</li><li>Nissim, L., Bar-Ziv, R. 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A., Lappalainen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+regulatory+effect+size+of+cis-acting+genetic+variation+using+allelic+fold+change.">Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change.</a> Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).</li><li>Prochazka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete-to-analog+signal+pluripotent+stem+cells+conversion+in+human.">Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modularity,+context-dependence,+and+insulation+in+engineered+biological+circuits.">Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits.</a> Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).</li><li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design:+Engineering+the+mammalian+cell.">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li><li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+'poly-transfection'+method+for+rapid,+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems.">A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).</li><li>Jones, R. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endoribonuclease-based+feedforward+controller+for+decoupling+resource-limited+genetic+modules+in+mammalian+cells.">An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).</li><li>DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERSIST+platform+provides+programmable+RNA+regulation+using+CRISPR+endoRNases.">PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases.</a> Nature Communications. 13 (1), 2582 (2022).</li><li>Frei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+mitigation+of+gene+expression+burden+in+mammalian+cells.">Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 4641 (2020).</li><li>Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+fast,+high-precision+characterization+of+synthetic+biology+devices.+Computer+Science+and+Artificial+Intelligence+Laboratory+Technical+Report.">A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report.</a> Massachusetts institute of technology. , (2012).</li><li>Beal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+measurement+precision+requirements+for+effective+engineering+of+genetic+regulatory+networks.">Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).</li><li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoflow:+A+Python+toolbox+for+flow+cytometry.">Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+gene+expression+with+synthetic+upstream+open+reading+frames).">Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).</li><li>Michaels, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+tuning+of+gene+expression+levels+in+mammalian+cells.">Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 818 (2019).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch.">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li><li>Wroblewska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+synthetic+circuits+with+RNA+binding+proteins+for+RNA-only+delivery.">Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).</li><li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells.">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).</li><li>Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21+as+a+key+regulator+of+oncogenic+processes.">miR-21 as a key regulator of oncogenic processes.</a> Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).</li><li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+mining+of+prokaryotic+repressors+for+orthogonal+logic+gates.">Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).</li><li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+transfer+of+prokaryotic+sensors+and+circuits+to+mammalian+cells.">Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).</li></ol>

Rapid-Prototyping-Methoden wie Computer-Aided Design (CAD), Breadboarding und 3D-Druck haben die Disziplinen des Maschinenbaus, der Elektrotechnik und des Bauingenieurwesens revolutioniert. Die Fähigkeit, schnell nach vielen möglichen Lösungen für eine bestimmte Herausforderung zu suchen, beschleunigt den Fortschritt in einem Bereich erheblich. Wir glauben, dass die Polytransfektion eine analoge Technologie für die Biotechnik ist, die ein schnelles Prototyping genetischer Schaltkreise ermöglicht. Darüber hinaus er...

Das Gebiet der synthetischen Biologie von Säugetieren hat sich rasant weiterentwickelt, von der Entwicklung einfacher Sense-and-Response-Teile in kultivierten Zelllinien bis hin zur Optimierung komplexer Netzwerke von Genen, um reale Herausforderungen in der Diagnostik und Therapie anzugehen1. Diese ausgeklügelten Schaltkreise sind in der Lage, biologische Eingaben von microRNA-Profilen über Zytokine bis hin zu niedermolekularen Medikamenten zu erfassen und logische Verarbeitungsschaltkreise wie Transistoren, Bandpassfilter, Kippschalter und Oszillatoren zu implementieren. Sie haben auch vielversprechende Ergebnisse in Tiermodellen für Krankheiten wie Krebs, Arthritis, Diabetes und viele mehr gezeigt 1,2,3,4,5. Mit zunehmender Komplexität einer Schaltung wird es jedoch immer schwieriger, die Pegel der einzelnen Komponenten zu optimieren.
Eine besonders nützliche Art von genetischem Schaltkreis ist ein Zellklassifikator, der so programmiert werden kann, dass er zelluläre Zustände erkennt und darauf reagiert. Die selektive Produktion von Protein- oder RNA-Outputs in bestimmten zellulären Zuständen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Differenzierung von Zellen und Organoiden zu steuern und zu programmieren, kranke Zellen und/oder unerwünschte Zelltypen zu identifizieren und zu zerstören und die Funktion therapeutischer Zellen zu regulieren 1,2,3,4,5 . Die Schaffung von Schaltkreisen in Säugetierzellen, die Zellzustände aus mehreren zellulären RNA- und/oder Proteinspezies genau klassifizieren können, war jedoch eine große Herausforderung.
Einer der zeitaufwändigsten Schritte bei der Entwicklung eines Zellklassifizierungsschaltkreises besteht darin, die relativen Expressionsniveaus einzelner Komponentengene, wie z. B. Sensoren und Verarbeitungsfaktoren, innerhalb des Schaltkreises zu optimieren. Um die Schaltungsoptimierung zu beschleunigen und den Aufbau anspruchsvollerer Schaltkreise zu ermöglichen, wurde in neueren Arbeiten die mathematische Modellierung von Zellklassifikatorschaltungen und deren Komponenten verwendet, um optimale Zusammensetzungen und Topologien vorherzusagen 6,7. Während dies bisher starke Ergebnisse gezeigt hat, ist die mathematische Analyse durch die Notwendigkeit begrenzt, das Input-Output-Verhalten von Komponentengenen in der Schaltung systematisch zu charakterisieren, was zeitaufwändig ist. Darüber hinaus kann in komplexen genetischen Schaltkreisen eine Vielzahl von kontextabhängigen Problemen auftreten, die dazu führen, dass sich das Verhalten eines vollständigen Schaltkreises Vorhersagen widersetzt, die auf der Charakterisierung einzelner Teile basieren 8,9.
Um komplexe Säugetierschaltkreise wie Zellzustandsklassifikatoren schneller zu entwickeln und zu testen, entwickelte unser Labor eine Technik namens Poly-Transfection10, eine Weiterentwicklung von Plasmid-Co-Transfektionsprotokollen. Bei der Co-Transfektion werden mehrere Plasmid-DNA-Spezies mit einem positiv geladenen Lipid- oder Polymerreagenz komplexiert und dann korreliert an die Zellen abgegeben (Abbildung 1A). Bei der Polytransfektion werden die Plasmide separat mit dem Reagenz komplexiert, so dass die DNA aus jedem Transfektionskomplex dekorreliert an die Zellen abgegeben wird (Abbildung 1B). Bei dieser Methode werden Zellen innerhalb der transfizierten Population zahlreichen Kombinationen von Verhältnissen von zwei oder mehr DNA-Nutzlasten ausgesetzt, die unterschiedliche Schaltkreiskomponenten tragen.
Um die Verhältnisse der Schaltungskomponenten zu messen, die an jede Zelle abgegeben werden, enthält jeder Transfektionskomplex innerhalb einer Polytransfektion einen konstitutiv exprimierten Fluoreszenzreporter, der als Proxy für die zelluläre Aufnahme des Komplexes dient. Füllstoff-DNA, die keine Elemente enthält, die in einer Säugetierzelle aktiv sind, wird verwendet, um die relative Menge der fluoreszierenden Reporter- und Schaltkreiskomponenten einzustellen, die in einem einzigen Transfektionskomplex an eine Zelle abgegeben werden, und wird in der Diskussion ausführlicher diskutiert. Ein Beispiel für Füllstoff-DNA, die im Weiss-Labor verwendet wird, ist ein Plasmid, das eine Terminatorsequenz enthält, aber keinen Promotor, keine kodierende Sequenz usw. Zellen mit unterschiedlichen Verhältnissen der Schaltkreiskomponenten können dann verglichen werden, um optimale Verhältnisse für die Funktion der Genschaltkreise zu finden. Dies wiederum liefert nützliche Vorhersagen für die Auswahl von Promotoren und anderen Schaltkreiselementen, um optimale Genexpressionsniveaus zu erreichen, wenn Schaltkreiskomponenten zu einem einzigen Vektor für die genetische Integration kombiniert werden (z. B. ein Lentivirus, ein Transposon oder ein Landeplatz). Anstatt also die Verhältnisse zwischen den Schaltungskomponenten auf der Grundlage von Intuition oder über einen zeitaufwändigen Trial-and-Error-Prozess zu wählen, wertet die Polytransfektion eine Vielzahl von Stöchiometrien zwischen genetischen Teilen in einer Eintopfreaktion aus.
In unserem Labor hat die Polytransfektion die Optimierung vieler genetischer Schaltkreise ermöglicht, darunter Zellklassifikatoren, Feedback- und Feedforward-Controller sowie bistabile Motive. Diese einfache, aber wirkungsvolle Methode beschleunigt die Designzyklen komplexer genetischer Schaltkreise in Säugetierzellen erheblich. Seitdem wurde die Polytransfektion verwendet, um mehrere genetische Schaltkreise zu charakterisieren, um ihre mehrdimensionalen Input-Output-Übertragungsfunktionen mit hoher Auflösungaufzudecken 10, eine alternative Schaltkreistopologie für die Zellzustandsklassifizierung 11 zu optimieren und verschiedene veröffentlichte12,13 und laufende Projekte zu beschleunigen.
Hier beschreiben und beschreiben wir den Arbeitsablauf für den Einsatz der Polytransfektion zur schnellen Optimierung eines genetischen Schaltkreises (Abbildung 2). Das Protokoll zeigt, wie qualitativ hochwertige Poly-Transfektionsdaten generiert und mehrere häufige Fehler im Poly-Transfektionsprotokoll und in der Datenanalyse vermieden werden können (Abbildung 3). Anschließend wird demonstriert, wie die Polytransfektion zur Charakterisierung einfacher Schaltungskomponenten eingesetzt werden kann und dabei die Ergebnisse der Polytransfektion mit der Co-Transfektion verglichen werden können (Abbildung 4). Schließlich zeigen die Ergebnisse der Polytransfektion eine Optimierung des Krebsklassifikatorschaltkreises (Abbildung 5).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15mL Corning Falcon conical tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well petri dish</td>
			<td>Any company of choice</td>
			<td></td>
			<td>(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any company of choice</td>
			<td></td>
			<td>Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMQAX2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoflow</td>
			<td>Non-commercial software package</td>
			<td></td>
			<td>https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Use the correct media for your cell type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12401</td>
			<td>Use the relevant cell type for your experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td>Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Any company of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow calibration beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URCP-100-2H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection

Genetische Schaltkreise von Säugetieren haben gezeigt, dass sie das Potenzial haben, eine Vielzahl von Krankheitszuständen zu erkennen und zu behandeln, aber die Optimierung der Ebenen von Schaltkreiskomponenten bleibt herausfordernd und arbeitsintensiv. Um diesen Prozess zu beschleunigen, hat unser Labor die Poly-Transfektion entwickelt, eine Hochdurchsatz-Erweiterung der traditionellen Transfektion von Säugetieren. Bei der Polytransfektion führt jede Zelle in der transfizierten Population im Wesentlichen ein anderes Experiment durch, bei dem das Verhalten des Schaltkreises bei unterschiedlichen DNA-Kopienzahlen getestet wird und die Benutzer eine große Anzahl von Stöchiometrien in einer Eintopfreaktion analysieren können. Bisher wurden Poly-Transfektionen demonstriert, die das Verhältnis von Drei-Komponenten-Schaltkreisen in einem einzigen Zelltopf optimieren. Prinzipiell kann die gleiche Methode für die Entwicklung noch größerer Schaltungen verwendet werden. Die Ergebnisse der Polytransfektion können leicht angewendet werden, um optimale Verhältnisse von DNA zu Co-Transfektion für transiente Schaltkreise zu finden oder um Expressionsniveaus für Schaltkreiskomponenten für die Erzeugung stabiler Zelllinien zu wählen.
Hier demonstrieren wir den Einsatz von Poly-Transfektion zur Optimierung einer Drei-Komponenten-Schaltung. Das Protokoll beginnt mit experimentellen Designprinzipien und erklärt, wie die Poly-Transfektion auf traditionellen Co-Transfektionsmethoden aufbaut. Als nächstes wird die Polytransfektion der Zellen durchgeführt und einige Tage später eine Durchflusszytometrie durchgeführt. Schließlich werden die Daten analysiert, indem Schichten der Einzelzell-Durchflusszytometriedaten untersucht werden, die Teilmengen von Zellen mit bestimmten Komponentenverhältnissen entsprechen. Im Labor wurde die Polytransfektion zur Optimierung von Zellklassifikatoren, Rückkopplungs- und Feedforward-Controllern, bistabilen Motiven und vielem mehr eingesetzt. Diese einfache, aber wirkungsvolle Methode beschleunigt Designzyklen für komplexe genetische Schaltkreise in Säugetierzellen.

In Abbildung 1 vergleichen wir die Co-Transfektion mit der Poly-Transfektion. Bei einer Co-Transfektion werden alle Plasmide in der gleichen Transfektionsmischung abgegeben, was zu einer hohen Korrelation zwischen der Menge jedes einzelnen Plasmids führt, die eine einzelne Zelle erhält (Abbildung 1A). Während die Anzahl der gesamten Plasmide, die an jede Zelle abgegeben werden, erheblich variiert, ist die Fluoreszenz der beiden Reporterproteine in den einzeln...

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Komplexe genetische Schaltkreise sind zeitaufwändig zu entwerfen, zu testen und zu optimieren. Um diesen Prozess zu erleichtern, werden Säugetierzellen so transfiziert, dass mehrere Stöchiometrien von Schaltungskomponenten in einem einzigen Well getestet werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte für die experimentelle Planung, Transfektion und Datenanalyse.

Schnelle Entwicklung von Schaltkreisen zur Identifizierung von Zellzuständen mit Poly-Transfektion

Mammalian genetic circuits have demonstrated the potential to sense and treat a wide range of disease states, but optimization of the levels of circuit ...

Unser Protokoll macht es einfacher und schneller, Beziehungen zwischen biologischen Teilen zu verstehen. Wir können das Verhalten vieler ratiometrischer Kombinationen von Teilen in einer einzigen Vertiefung testen. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, die komplexen Beziehungen zwischen Schaltungskomponenten umfassender und experimenteller effizienter zu charakterisieren als herkömmliche Ansätze.Diese Methode ist für die synthetische Biologie und für alle biologischen Fragestellungen anwendbar, um Verhaltensänderungen in einer Zelle als Reaktion auf verschiedene Konzentrationen transfizierter Gene zu untersuchen, wobei der Output mittels Durchflusszytometrie gemessen werden kann. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Röhrchen für jedes DNA-Aggregat, indem Sie 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen beiseite legen, die als keine Farbkontrolle, mKO2-Kontrolle, TagBFP-Kontrolle, Neongrün-Kontrolle, alle Farbkontrolle, Poly-Transfektionsmischung eins und Poly-Transfektionsmischung zwei gekennzeichnet sind. Geben Sie 36 Mikroliter reduziertes Serummedium in die No-Color-Control-, mKO2-Control-, TagBFP-Control-, Neongrün-Control- und alle Color-Control-Röhrchen und geben Sie dann 18 Mikroliter reduziertes Serummedium zu jeder Poly-Transfektionsmischung und jeder Poly-Transfektionsmischung zu zwei Röhrchen.Als nächstes geben Sie 600 Nanogramm Füllstoffplasmid in das Farbkontrollröhrchen ohne Farbe, 300 Nanogramm mKO2 und 300 Nanogramm Füllstoffplasmid in das mKO2-Farbkontrollröhrchen und geben Sie 300 Nanogramm TagBFP und 300 Nanogramm Füllstoffplasmid in das TagBFP-Farbkontrollröhrchen. Fügen Sie dem neongrünen Farbkontrollröhrchen 300 Nanogramm konstitutives Neongrün und 300 Nanogramm Füllstoffplasmid hinzu, dann fügen Sie 100 Nanogramm jedes mKO2, TagBFP, konstitutiven Neongrün und 300 Nanogramm Füllstoffplasmid in das Vollfarbkontrollröhrchen hinzu. Fügen Sie der Polytransfektionsmischung ein Röhrchen hinzu, fügen Sie 150 Nanogramm mKO2, 75 Nanogramm Reporter-Neongrün-Plasmid und 75 Nanogramm Füllstoffplasmid hinzu.Fügen Sie der Polytransfektionsmischung zwei Röhrchen 150 Nanogramm TagBFP, 75 Nanogramm L7Ae-Plasmid und 75 Nanogramm Füllstoffplasmid hinzu. Sobald Sie fertig sind, stellen Sie die Transfektions-Mastermischung in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen her, indem Sie 216 Mikroliter reduziertes Serummedium mit 9,48 Mikrolitern Transfektionsreagenz kombinieren. Mischen Sie gut, indem Sie es auf und ab pipettieren, bevor Sie es beiseite stellen.Fügen Sie 1,58 Mikroliter Enhancer-Reagenz zu No-Color-Control-, Single-Color-Control- und allen Color-Control-Röhrchen hinzu und fügen Sie 79 Mikroliter Enhancer-Reagenz zu jedem Poly-Transfektions-Mix-Röhrchen hinzu. Mischen Sie jedes Röhrchen einzeln, indem Sie kräftig pipettieren. Geben Sie 37,58 Mikroliter Transfektions-Mastermix in die No-Color-Control-, Single-Color-Control- und All-Color-Control-Röhrchen und mischen Sie sie durch kräftiges Pipettieren.Als nächstes geben Sie 18,79 Mikroliter Transfektions-Mastermix in jedes Poly-Transfektions-Mix-Röhrchen und mischen Sie jedes Röhrchen gut mit kräftigem Pipettieren. Dosieren Sie die Transfektionsmischungen in die Vertiefungen, indem Sie 65,97 Mikroliter jeder Transfektionsmischung für die farblose, einfarbige und alle Farbkontrollen in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren, dann 32,98 Mikroliter der Polytransfektionsmischung eins in die Polytransfektionsvertiefung geben und die Komplexe effektiv verteilen, indem die Platte schnell, aber schonend in einer dichten, Bilden Sie ein Muster entlang einer ebenen Oberfläche, pipettieren Sie dann 32,98 Mikroliter der Poly-Transfektionsmischung in dieselbe Poly-Transfektionsvertiefung und schwenken Sie die Platte auf die gleiche Weise. Inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang.Führen Sie eine Durchflusszytometrie durch, um die Fluoreszenz der Transfektionsmarker auszulesen und den Reporter für jede Zelle auszugeben. Eine gut durchgeführte Co-Transfektion, die sich von der im Video gezeigten Poly-Transfektion unterscheidet, zeigt eine enge Korrelation zwischen TagBFP und EYFP, wobei Plasmide exprimiert werden, die gemeinsam abgegeben wurden. Im Gegensatz dazu zeigt eine schlecht durchgeführte Co-Transfektion eine schlechte Korrelation zwischen den beiden Plasmiden.Die gut durchgeführte Polytransfektion zeigte eine gute Abdeckung des zweidimensionalen Raums und eine gute Kompensation des spektralen Durchschlagens zwischen fluoreszierenden Proteinen. Polytransfektionsdaten mit einer geringen Anzahl lebender Zellen ließen sich nur schwer in genügend Bins mit einer ausreichenden Anzahl von Zellen in jedem Bins für die Analyse unterteilen. Eine Polytransfektion mit schlechter Transfektionseffizienz führte zu einer spärlichen Abdeckung des zweidimensionalen Raums für die Analyse.Das effektive DNA-Verhältnis bei der Output-Expression wurde getestet, indem ein Repressorprotein, L7Ae mit mKO2, und ein Output-Protein, neongrün mit TagBFP, in separate Transfektionsmischungen platziert wurden. Die neongrüne Expression wurde dann in verschiedenen Konzentrationen von mKO2 und TagBFP überwacht. Die Ergebnisse der Co-Transfektion und der Poly-Transfektion wurden für diese Schaltung verglichen.Die Ergebnisse von 11 einzelnen Co-Transfektionen, die die zuvor gezeigten DNA-Teile kombinierten, wurden in einem einzigen Datensatz zusammengefasst und mit den Poly-Transfektionsdaten verglichen. Der Vergleich der Dosis-Wirkungs-Kurven von L7Ae unter Unterdrückung des Output-Reporters zeigte, dass der mediane Output-Pegel pro Bin zwischen den Co-Transfektions- und Poly-Transfektionsdaten sehr ähnlich war. Eine erfolgreiche Anwendung der Polytransfektion zur Optimierung eines Zelltypklassifikators wurde demonstriert.Die Mikro-RNA-21, die in HeLa-Zellen und Nicht-HEK-Zellen vorhanden ist, unterdrückt die Expression von BM3R1, da BM3R1 die Produktion des Schaltkreisausgangs mKO2 unterdrückt. Wenn micro RNA 21 in einer Zelle vorhanden ist, wird die mKO2-Expression aktiviert. Die Menge an Gal4-VP16 stimmt die mKO2-Expression bei niedrigen Pegeln von BM3R1 ab.Jede Schaltungskomponente wurde mit einem anderen Fluoreszenzmarker geliefert. Diese Polytransfektion quantifiziert, wie viel von jeder Schaltungskomponente jede Zelle erhalten hat. mKO2 wird in MIR21 produziert und produziert HeLa-Zellen, aber nicht in HEK-Zellen.Die mKO2-Ausgabe wurde analysiert, nachdem diese Schaltungskomponenten in separaten Transfektionsmischungen mit unterschiedlichen Fluoreszenzreportern geliefert wurden, um die Menge jeder Schaltungskomponente anzugeben, die von einer bestimmten Zelle empfangen wurde. Diese Teilprobenahme prognostizierte, dass der co-transfizierte Schaltkreis bei diesem Verhältnis eine Spezifität von 91 %, eine Sensitivität von 62 % und eine Genauigkeit von 77 % bei der Klassifizierung von HEK293 im Vergleich zu HeLa-Zellen aufwies. Der häufigste Schmerzpunkt in diesem Protokoll ist das Fehlen einer engen Korrelation innerhalb jeder Transfektionsmischung.Denken Sie also daran, die Transfektionsröhrchen direkt nach der Zugabe des Enhancer-Reagenzes kräftig zu mischen und dann vorsichtig mit dem Mischen und Pipettieren der Transfektionsröhrchen umzugehen, nachdem die lipidhaltige Transfektionsmischung hinzugefügt wurde. Die genetischen Komponenten in diesem Verfahren können durch andere genetische Komponenten ersetzt werden, um Fragen zu ihrer Funktionsfähigkeit in verschiedenen Umgebungen zu beantworten. Diese Methode hat schnell genetische Schaltkreise entwickelt, wie z.B. Zellklassifikatoren, Rückkopplungs- und Feedforward-Controller, bistabile Motive und vieles mehr.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores (Video) | JoVE 

Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

Forschung

Biotechnik

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells (Video) | JoVE 

Ratiometric Biosensors, dass die mitochondriale Redox Staats-und ATP in lebenden Hefezellen Messen

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor (Video) | JoVE 

Erkundung der Barrier Gewebestörung mit einem organischen Transistor Elektro

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling Video (Video) | JoVE

In-vitro-Modell von physiologischen und pathologischen Blutfluss mit Anwendung auf Untersuchungen der Gefäßzell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry Video (Video) | JoVE

Qualitative Charakterisierung der wässrigen Fraktion von hydrothermale Verflüssigung von Algen mit Hilfe von 2D-Gaschromatographie mit Time-of-Flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe Video (Video) | JoVE

Schnelle Subtraktive Patterning von Live Cell-Schichten mit einer Mikrofluidik-Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering Video (Video) | JoVE

Eine schnelle und Chemiefreie Hämoglobin-Assay mit Photothermische Winkellichtstreuung

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures Video (Video) | JoVE

Synthese von biokompatiblen Liquid Crystal Elastomerschäume als Zellgerüste für 3D Spatial Zellkulturen

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library Video (Video) | JoVE

Screening und Identifizierung von kleinen Peptiden Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 mit einem Phage Display Peptid Bibliothek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning Video (Video) | JoVE

Schnelle Montage von Multi-Gen-Konstrukten mit modularem Golden Gate Klonen

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...