Name: rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection
Uploaded: 2023-02-24T14:40:00
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Vorremmo ringraziare gli ex membri del Weiss Lab che hanno guidato o contribuito allo sviluppo del metodo della poli-trasfezione e alla sua applicazione ai classificatori cellulari: Jeremy Gam, Bre DiAndreth e Jin Huh; altri membri del laboratorio Weiss che hanno contribuito all'ulteriore sviluppo/ottimizzazione del metodo: Wenlong Xu, Lei Wang e Christian Cuba-Samaniego; Il Prof. Josh Leonard e i membri del gruppo, tra cui Patrick Donahue e Hailey Edelstein, per aver testato la poli-trasfezione e fornito feedback; e la Prof.ssa Nika Shakiba per aver invitato questo manoscritto e aver fornito feedback. Vorremmo anche ringraziare il National Institutes of Health [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; National Science Foundation [1745645]; Cancer Center Support (core) Grant [P30CCA14051, in parte] dal NCI e National Institutes of Health [P50GM098792] per il finanziamento di questo lavoro.

NOTA: la Tabella 1 e la Tabella 2 fungono da riferimenti significativi per questo protocollo. La Tabella 1 mostra il ridimensionamento del reagente per le reazioni, e la Tabella 2 mostra l'aritmetica del rapporto DNA per un esempio di poli-trasfezione descritta nel protocollo (metà superiore) e per un possibile esperimento di follow-up (metà inferiore).
1. Preparare le cellule per la trasfezione
<ol><li>As...

<ol>
	<li>Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+gene+circuits+and+cellular+decision-making+in+human+pluripotent+stem+cells.">Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells.</a> Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).</li><li>Sayeg, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+designed+microRNA-based+genetic+classifiers+target+specific+neurons+in+the+brain.">Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).</li><li>Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Input+RNAi-based+logic+circuit+for+identification+of+specific+cancer+cells.">Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells.</a> Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).</li><li>Nissim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+RNA-based+immunomodulatory+gene+circuits+for+cancer+immunotherapy.">Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy.</a> Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).</li><li>Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable+dual-promoter+integrator+for+targeting+of+cancer+cells.">A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells.</a> Molecular Systems Biology. 6, 444 (2010).</li><li>Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+regulatory+effect+size+of+cis-acting+genetic+variation+using+allelic+fold+change.">Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change.</a> Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).</li><li>Prochazka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete-to-analog+signal+pluripotent+stem+cells+conversion+in+human.">Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modularity,+context-dependence,+and+insulation+in+engineered+biological+circuits.">Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits.</a> Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).</li><li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design:+Engineering+the+mammalian+cell.">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li><li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+'poly-transfection'+method+for+rapid,+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems.">A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).</li><li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+tunable+signal+processing+in+mammalian+cells+via+engineered+covalent+modification+cycles.">Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles.</a> Nature Communications. 13 (1), 1720 (2022).</li><li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endoribonuclease-based+feedforward+controller+for+decoupling+resource-limited+genetic+modules+in+mammalian+cells.">An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).</li><li>DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERSIST+platform+provides+programmable+RNA+regulation+using+CRISPR+endoRNases.">PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases.</a> Nature Communications. 13 (1), 2582 (2022).</li><li>Frei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+mitigation+of+gene+expression+burden+in+mammalian+cells.">Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 4641 (2020).</li><li>Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+fast,+high-precision+characterization+of+synthetic+biology+devices.+Computer+Science+and+Artificial+Intelligence+Laboratory+Technical+Report.">A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report.</a> Massachusetts institute of technology. , (2012).</li><li>Beal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+measurement+precision+requirements+for+effective+engineering+of+genetic+regulatory+networks.">Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).</li><li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoflow:+A+Python+toolbox+for+flow+cytometry.">Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+gene+expression+with+synthetic+upstream+open+reading+frames).">Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).</li><li>Michaels, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+tuning+of+gene+expression+levels+in+mammalian+cells.">Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 818 (2019).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch.">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li><li>Wroblewska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+synthetic+circuits+with+RNA+binding+proteins+for+RNA-only+delivery.">Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).</li><li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells.">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).</li><li>Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21+as+a+key+regulator+of+oncogenic+processes.">miR-21 as a key regulator of oncogenic processes.</a> Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).</li><li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+mining+of+prokaryotic+repressors+for+orthogonal+logic+gates.">Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).</li><li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+transfer+of+prokaryotic+sensors+and+circuits+to+mammalian+cells.">Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).</li></ol>

I metodi di prototipazione rapida come la progettazione assistita da computer (CAD), il breadboard e la stampa 3D hanno rivoluzionato le discipline meccaniche, elettriche e di ingegneria civile. La capacità di cercare rapidamente tra molte possibili soluzioni a una determinata sfida accelera notevolmente i progressi in un campo. Riteniamo che la poli-trasfezione sia una tecnologia analoga per l'ingegneria biologica, che consente la prototipazione rapida dei circuiti genetici. Inoltre, altre tecnologie di prototipazione ...

Il campo della biologia sintetica dei mammiferi è progredito rapidamente, dallo sviluppo di semplici parti senso-e-risposta in linee cellulari in coltura all'ottimizzazione di reti complesse di geni per affrontare le sfide del mondo reale nella diagnostica e nella terapia1. Questi sofisticati circuiti sono in grado di rilevare input biologici dai profili di microRNA alle citochine ai farmaci a piccole molecole e di implementare circuiti di elaborazione logica tra cui transistor, filtri passa-banda, interruttori a levetta e oscillatori. Hanno anche mostrato risultati promettenti in modelli animali di malattie come cancro, artrite, diabete e molti altri 1,2,3,4,5. Tuttavia, man mano che la complessità di un circuito cresce, l'ottimizzazione dei livelli di ciascuno dei suoi componenti diventa sempre più impegnativa.
Un tipo particolarmente utile di circuito genetico è un classificatore cellulare, che può essere programmato per rilevare e rispondere agli stati cellulari. La produzione selettiva di proteine o RNA in specifici stati cellulari è un potente strumento per guidare e programmare la differenziazione di cellule e organoidi, identificare e distruggere le cellule malate e/o i tipi di cellule indesiderabili e regolare la funzione delle cellule terapeutiche 1,2,3,4,5 . Tuttavia, la creazione di circuiti nelle cellule di mammifero in grado di classificare con precisione gli stati cellulari da più RNA cellulare e / o specie proteiche è stata molto impegnativa.
Uno dei passaggi più dispendiosi in termini di tempo per lo sviluppo di un circuito di classificazione cellulare è ottimizzare i livelli di espressione relativi dei singoli geni componenti, come sensori e fattori di elaborazione, all'interno del circuito. Per accelerare l'ottimizzazione dei circuiti e consentire la costruzione di circuiti più sofisticati, recenti lavori hanno utilizzato la modellazione matematica dei circuiti classificatori di celle e dei loro componenti per prevedere composizioni e topologie ottimali 6,7. Mentre questo ha mostrato risultati potenti finora, l'analisi matematica è limitata dalla necessità di caratterizzare sistematicamente il comportamento input-output dei geni componenti nel circuito, che richiede tempo. Inoltre, una miriade di problemi dipendenti dal contesto possono emergere in circuiti genetici complessi, facendo sì che il comportamento di un circuito completo sfidi le previsioni basate sulle caratterizzazioni delle singole parti 8,9.
Per sviluppare e testare più rapidamente circuiti complessi di mammiferi come i classificatori di stato cellulare, il nostro laboratorio ha sviluppato una tecnica chiamata poli-trasfezione10, un'evoluzione dei protocolli di co-trasfezione plasmidica. Nella co-trasfezione, più specie di DNA plasmidico sono complessate insieme con un reagente lipidico o polimerico caricato positivamente, quindi consegnate alle cellule in modo correlato (Figura 1A). Nella poli-trasfezione, i plasmidi sono complessati separatamente con il reagente, in modo tale che il DNA di ciascun complesso di trasfezione venga consegnato alle cellule in modo de-correlato (Figura 1B). Utilizzando questo metodo, le cellule all'interno della popolazione trasfettata sono esposte a numerose combinazioni di rapporti di due o più carichi utili di DNA che trasportano diversi componenti del circuito.
Per misurare i rapporti dei componenti del circuito consegnati a ciascuna cellula, ogni complesso di trasfezione all'interno di una poli-trasfezione contiene un reporter fluorescente costitutivamente espresso che funge da proxy per l'assorbimento cellulare del complesso. Il DNA di riempimento che non contiene alcun elemento attivo all'interno di una cellula di mammifero viene utilizzato per sintonizzare la quantità relativa del reporter fluorescente e dei componenti del circuito consegnati a una cellula in un singolo complesso di trasfezione e viene discusso più dettagliatamente nella discussione. Un esempio di DNA di riempimento utilizzato nel laboratorio Weiss è un plasmide contenente una sequenza di terminazione, ma nessun promotore, sequenza codificante, ecc. Le cellule con diversi rapporti di componenti del circuito possono quindi essere confrontate per trovare rapporti ottimali per la funzione del circuito genico. Questo a sua volta produce previsioni utili per la scelta di promotori e altri elementi del circuito per raggiungere livelli ottimali di espressione genica quando si combinano componenti del circuito in un singolo vettore per l'integrazione genetica (ad esempio, un lentivirus, un trasposone o una piattaforma di atterraggio). Pertanto, invece di scegliere i rapporti tra i componenti del circuito in base all'intuizione o tramite un processo di prova ed errore che richiede tempo, la poli-trasfezione valuta un'ampia gamma di stechiometrie tra le parti genetiche in una reazione a singolo piatto.
Nel nostro laboratorio, la poli-trasfezione ha permesso l'ottimizzazione di molti circuiti genetici, tra cui classificatori cellulari, controller di feedback e feedforward e motivi bistabili. Questo metodo semplice ma potente accelera significativamente i cicli di progettazione per circuiti genetici complessi nelle cellule di mammifero. Da allora la poli-trasfezione è stata utilizzata per caratterizzare diversi circuiti genetici per rivelare le loro funzioni di trasferimento input-output multidimensionale ad alta risoluzione 10, ottimizzare una topologia circuitale alternativa per la classificazione dello stato cellulare11 e accelerare vari progetti pubblicati12,13 e in corso.
Qui descriviamo e rappresentiamo il flusso di lavoro per l'utilizzo della poli-trasfezione per ottimizzare rapidamente un circuito genetico (Figura 2). Il protocollo mostra come generare dati di poli-trasfezione di alta qualità ed evitare diversi errori comuni nel protocollo di poli-trasfezione e nell'analisi dei dati (Figura 3). Viene quindi illustrato come utilizzare la poli-trasfezione per caratterizzare semplici componenti del circuito e, nel processo, confrontare i risultati della poli-trasfezione con la co-trasfezione (Figura 4). Infine, i risultati della poli-trasfezione mostrano l'ottimizzazione del circuito del classificatore del cancro (Figura 5).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15mL Corning Falcon conical tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well petri dish</td>
			<td>Any company of choice</td>
			<td></td>
			<td>(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any company of choice</td>
			<td></td>
			<td>Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMQAX2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoflow</td>
			<td>Non-commercial software package</td>
			<td></td>
			<td>https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Use the correct media for your cell type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12401</td>
			<td>Use the relevant cell type for your experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td>Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Any company of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow calibration beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URCP-100-2H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection

I circuiti genetici dei mammiferi hanno dimostrato il potenziale per rilevare e trattare una vasta gamma di stati patologici, ma l'ottimizzazione dei livelli dei componenti del circuito rimane impegnativa e laboriosa. Per accelerare questo processo, il nostro laboratorio ha sviluppato la poli-trasfezione, un'estensione ad alto rendimento della trasfezione tradizionale dei mammiferi. Nella poli-trasfezione, ogni cellula della popolazione trasfettata esegue essenzialmente un esperimento diverso, testando il comportamento del circuito a diversi numeri di copie del DNA e consentendo agli utenti di analizzare un gran numero di stechiometrie in una reazione single-pot. Finora sono state dimostrate poli-trasfezioni che ottimizzano i rapporti di circuiti a tre componenti in un singolo pozzetto di cellule; In linea di principio, lo stesso metodo può essere utilizzato per lo sviluppo di circuiti ancora più grandi. I risultati della poli-trasfezione possono essere facilmente applicati per trovare rapporti ottimali tra DNA e co-transfettazione per circuiti transitori o per scegliere livelli di espressione per componenti circuitali per la generazione di linee cellulari stabili.
Qui, dimostriamo l'uso della poli-trasfezione per ottimizzare un circuito a tre componenti. Il protocollo inizia con i principi di progettazione sperimentale e spiega come la poli-trasfezione si basa sui tradizionali metodi di co-trasfezione. Successivamente, viene eseguita la poli-trasfezione delle cellule e seguita dalla citometria a flusso pochi giorni dopo. Infine, i dati vengono analizzati esaminando fette dei dati di citometria a flusso a singola cellula che corrispondono a sottoinsiemi di cellule con determinati rapporti componenti. In laboratorio, la poli-trasfezione è stata utilizzata per ottimizzare classificatori cellulari, controller di feedback e feedforward, motivi bistabili e molti altri. Questo metodo semplice ma potente accelera i cicli di progettazione per circuiti genetici complessi nelle cellule di mammifero.

Nella Figura 1, confrontiamo la co-trasfezione con la poli-trasfezione. In una co-trasfezione, tutti i plasmidi vengono consegnati nello stesso mix di trasfezione, con conseguente alta correlazione tra la quantità di ciascun plasmide che ogni singola cellula riceve (Figura 1A). Mentre il numero di plasmidi totali consegnati a ciascuna cellula varia in modo significativo, la fluorescenza delle due proteine reporter nelle singole cellule in tutta la popolazione ?...

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Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection

I circuiti genetici complessi richiedono molto tempo per progettare, testare e ottimizzare. Per facilitare questo processo, le cellule di mammifero vengono trasfettate in modo da consentire il test di più stechiometrie di componenti del circuito in un singolo pozzetto. Questo protocollo delinea le fasi per la pianificazione sperimentale, la trasfezione e l'analisi dei dati.

Rapido sviluppo di circuiti di identificazione dello stato cellulare con poli-trasfezione

Mammalian genetic circuits have demonstrated the potential to sense and treat a wide range of disease states, but optimization of the levels of circuit ...

Il nostro protocollo rende più facile e veloce comprendere le relazioni tra le parti biologiche. Possiamo testare il comportamento di molte combinazioni metriche di rapporto di parti in un singolo pozzetto. Questa tecnica consente ai ricercatori di caratterizzare le complesse relazioni tra i componenti del circuito in modo più completo con una maggiore efficienza sperimentale rispetto agli approcci convenzionali.Questo metodo è applicabile per la biologia sintetica e per qualsiasi questione biologica, sondando i cambiamenti comportamentali in una cellula in risposta a diversi livelli di geni trasfettati in cui l'output può essere misurato tramite citometria a flusso. Inizia a preparare i tubi per ogni aggregato di DNA mettendo da parte le provette da micro centrifuga da 1,5 millilitri etichettate come nessun controllo del colore, controllo mKO2, controllo TagBFP, controllo verde neon, controllo di tutti i colori, mix di poli-trasfezione uno e mix di poli-trasfezione due. Aggiungere 36 microlitri di mezzo sierico ridotto al controllo senza colore, al controllo mKO2, al controllo TagBFP, al controllo verde neon e a tutti i tubi di controllo del colore, quindi aggiungere 18 microlitri di mezzo sierico ridotto a ciascun mix di poli-trasfezione uno e il mix di poli-trasfezione due tubi.Quindi, aggiungere 600 nanogrammi di plasmide di riempimento al tubo di controllo senza colore, 300 nanogrammi di mKO2 e 300 nanogrammi di plasmide di riempimento al tubo di controllo del colore mKO2 e aggiungere 300 nanogrammi di TagBFP e 300 nanogrammi di plasmide di riempimento al tubo di controllo del colore TagBFP. Al tubo di controllo del colore verde neon, aggiungere 300 nanogrammi di verde neon costitutivo e 300 nanogrammi di plasmide di riempimento, quindi aggiungere 100 nanogrammi di ogni mKO2, TagBFP, verde neon costitutivo e 300 nanogrammi di plasmide di riempimento al tubo di controllo di tutti i colori. Alla miscela di poli-trasfezione un tubo, aggiungere 150 nanogrammi di mKO2, 75 nanogrammi di plasmide verde neon reporter e 75 nanogrammi di plasmide di riempimento.Al mix di poli-trasfezione due tubi, aggiungere 150 nanogrammi di TagBFP, 75 nanogrammi di plasmide L7Ae e 75 nanogrammi di plasmide di riempitivo. Una volta fatto, creare la miscela master di trasfezione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri combinando 216 microlitri di mezzo sierico ridotto con 9,48 microlitri di reagente di trasfezione. Mescolare bene pipettando su e giù prima di metterlo da parte.Aggiungere 1,58 microlitri di reagente enhancer a nessun controllo del colore, controllo del colore singolo e tutti i tubi di controllo del colore e aggiungere 79 microlitri di reagente enhancer a ciascun tubo di mix di poli-trasfezione. Mescolare ogni tubo singolarmente pipettando energicamente. Aggiungere 37,58 microlitri di master mix di trasfezione al controllo del colore, al controllo del colore singolo e a tutti i tubi di controllo del colore e mescolare mediante pipettaggio vigoroso.Quindi, aggiungere 18,79 microlitri di master mix di trasfezione a ciascun tubo di mix di poli-trasfezione e mescolare bene ogni tubo con un pipettaggio vigoroso. Erogare le miscele di trasfezione nei pozzetti pipettando 65,97 microlitri di ciascuna miscela di trasfezione per i controlli senza colore, colore singolo e tutti i colori nei pozzetti corrispondenti, quindi trasferire 32,98 microlitri del mix di politrasfezione uno nel pozzetto di politrasfezione e distribuire efficacemente i complessi ruotando la piastra rapidamente ma delicatamente in un stretto, Figurare lungo una superficie piana, quindi pipettare 32,98 microlitri di poli-trasfezione mescolare due nello stesso pozzo di poli-trasfezione e ruotare la piastra nello stesso modo. Incubare le cellule per due giorni.Eseguire la citometria a flusso per leggere la fluorescenza dei marcatori di trasfezione e del reporter di uscita per ogni cellula. Una co-trasfezione ben eseguita, distinta dalla poli-trasfezione mostrata nel video, mostra una stretta correlazione tra TagBFP e EYFP, esprimendo plasmidi che sono stati co-consegnati. Al contrario, una co-trasfezione mal eseguita mostra una scarsa correlazione tra i due plasmidi.La poli-trasfezione ben eseguita ha mostrato una buona copertura dello spazio bidimensionale e una buona compensazione di qualsiasi sanguinamento spettrale tra proteine fluorescenti. I dati di poli-trasfezione con un basso numero di cellule vive erano difficili da suddividere in un numero sufficiente di contenitori con un numero sufficiente di cellule in ciascun contenitore per l'analisi. Una poli-trasfezione con scarsa efficienza di trasfezione ha portato a una scarsa copertura dello spazio bidimensionale per l'analisi.L'efficace rapporto del DNA sull'espressione in uscita è stato testato posizionando una proteina repressore, L7Ae con mKO2, e una proteina di output, verde neon con TagBFP, in miscele di trasfezione separate. L'espressione verde neon è stata quindi monitorata a diversi livelli di mKO2 e TagBFP. I risultati della co-trasfezione e della poli-trasfezione sono stati confrontati per questo circuito.I risultati di 11 singole co-trasfezioni che hanno combinato le parti del DNA mostrate in precedenza sono stati raccolti in un singolo set di dati e confrontati con i dati di poli-trasfezione. Il confronto delle curve dose-risposta di L7Ae che reprime il reporter di output ha mostrato che il livello mediano di output per contenitore era molto simile tra i dati di co-trasfezione e poli-trasfezione. È stata dimostrata un'applicazione di successo della poli-trasfezione per ottimizzare un classificatore di tipi di cellule.Il micro RNA-21 presente nelle cellule HeLa e nelle cellule non-HEK agisce per abbattere l'espressione di BM3R1 perché BM3R1 reprime la produzione dell'uscita del circuito mKO2. Quando il micro RNA 21 è presente in una cellula, l'espressione di mKO2 sarà attivata. La quantità di Gal4-VP16 sintonizza l'espressione di mKO2 a bassi livelli di BM3R1.Ogni componente del circuito è stato co-consegnato con un marcatore fluorescente diverso. Questa poli-trasfezione quantifica la quantità di ogni componente del circuito ricevuta da ogni cellula. mKO2 è prodotto in MIR21, producendo cellule HeLa ma non in cellule HEK.L'uscita di mKO2 è stata analizzata dopo aver consegnato questi componenti del circuito in miscele di trasfezione separate con distinti reporter fluorescenti per indicare la quantità di ciascun componente del circuito ricevuto da una particolare cella. Questo sottocampionamento ha previsto che a questo rapporto, il circuito co-trasfettato aveva una specificità del 91%, una sensibilità del 62% e un'accuratezza del 77%, quando si classificava le celle HEK293 rispetto alle celle HeLa. Il punto dolente più comune in questo protocollo è la mancanza di una stretta correlazione all'interno di ogni mix di trasfezione.Quindi ricorda di mescolare vigorosamente i tubi di trasfezione subito dopo aver aggiunto il reagente enhancer e poi sii delicatamente mescolando e pipettando i tubi di trasfezione dopo aver aggiunto il mix di trasfezione contenente lipidi I componenti genetici in questa procedura potrebbero essere sostituiti con qualsiasi altro componente genetico per rispondere alle domande sulle loro prestazioni di funzionamento in vari ambienti. Questo metodo ha rapidamente sviluppato circuiti genetici, come classificatori cellulari, controller di feedback e feedforward, motivi bistabili e molti altri.

Research

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