Name: rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection
Uploaded: 2023-02-24T14:40:00
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Gostaríamos de agradecer aos ex-membros do Weiss Lab que lideraram ou contribuíram para o desenvolvimento do método de politransfecção e sua aplicação em classificadores celulares: Jeremy Gam, Bre DiAndreth e Jin Huh; outros membros do laboratório Weiss que contribuíram para o desenvolvimento/otimização de métodos: Wenlong Xu, Lei Wang e Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard e membros do grupo, incluindo Patrick Donahue e Hailey Edelstein, por testar a politransfecção e fornecer feedback; e ao Prof. Nika Shakiba por convidar este manuscrito e fornecer feedback. Também gostaríamos de agradecer aos Institutos Nacionais de Saúde [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; Fundação Nacional de Ciência [1745645]; Cancer Center Support (core) Grant [P30CCA14051, em parte] do NCI e National Institutes of Health [P50GM098792] para financiar este trabalho.

NOTA: A Tabela 1 e a Tabela 2 servem como referências significativas para este protocolo. A Tabela 1 mostra a escala de reagentes para as reações, e a Tabela 2 mostra a aritmética da razão de DNA para um exemplo de politransfecção descrito no protocolo (metade superior) e para um possível experimento de seguimento (metade inferior).
1. Preparação das células para transfecção
<ol><li>Certifique-s...

<ol>
	<li>Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+gene+circuits+and+cellular+decision-making+in+human+pluripotent+stem+cells.">Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells.</a> Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).</li><li>Sayeg, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+designed+microRNA-based+genetic+classifiers+target+specific+neurons+in+the+brain.">Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).</li><li>Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Input+RNAi-based+logic+circuit+for+identification+of+specific+cancer+cells.">Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells.</a> Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).</li><li>Nissim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+RNA-based+immunomodulatory+gene+circuits+for+cancer+immunotherapy.">Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy.</a> Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).</li><li>Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable+dual-promoter+integrator+for+targeting+of+cancer+cells.">A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells.</a> Molecular Systems Biology. 6, 444 (2010).</li><li>Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+regulatory+effect+size+of+cis-acting+genetic+variation+using+allelic+fold+change.">Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change.</a> Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).</li><li>Prochazka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete-to-analog+signal+pluripotent+stem+cells+conversion+in+human.">Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modularity,+context-dependence,+and+insulation+in+engineered+biological+circuits.">Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits.</a> Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).</li><li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design:+Engineering+the+mammalian+cell.">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li><li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+'poly-transfection'+method+for+rapid,+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems.">A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).</li><li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+tunable+signal+processing+in+mammalian+cells+via+engineered+covalent+modification+cycles.">Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles.</a> Nature Communications. 13 (1), 1720 (2022).</li><li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endoribonuclease-based+feedforward+controller+for+decoupling+resource-limited+genetic+modules+in+mammalian+cells.">An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).</li><li>DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERSIST+platform+provides+programmable+RNA+regulation+using+CRISPR+endoRNases.">PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases.</a> Nature Communications. 13 (1), 2582 (2022).</li><li>Frei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+mitigation+of+gene+expression+burden+in+mammalian+cells.">Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 4641 (2020).</li><li>Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+fast,+high-precision+characterization+of+synthetic+biology+devices.+Computer+Science+and+Artificial+Intelligence+Laboratory+Technical+Report.">A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report.</a> Massachusetts institute of technology. , (2012).</li><li>Beal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+measurement+precision+requirements+for+effective+engineering+of+genetic+regulatory+networks.">Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).</li><li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoflow:+A+Python+toolbox+for+flow+cytometry.">Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+gene+expression+with+synthetic+upstream+open+reading+frames).">Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).</li><li>Michaels, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+tuning+of+gene+expression+levels+in+mammalian+cells.">Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 818 (2019).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch.">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li><li>Wroblewska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+synthetic+circuits+with+RNA+binding+proteins+for+RNA-only+delivery.">Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).</li><li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells.">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).</li><li>Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21+as+a+key+regulator+of+oncogenic+processes.">miR-21 as a key regulator of oncogenic processes.</a> Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).</li><li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+mining+of+prokaryotic+repressors+for+orthogonal+logic+gates.">Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).</li><li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+transfer+of+prokaryotic+sensors+and+circuits+to+mammalian+cells.">Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).</li></ol>

Métodos de prototipagem rápida, como CAD (computer-aided design), protoboard e impressão 3D, revolucionaram as disciplinas de engenharia mecânica, elétrica e civil. A capacidade de pesquisar rapidamente muitas soluções possíveis para um determinado desafio acelera muito o progresso em um campo. Acreditamos que a politransfecção é uma tecnologia análoga para a engenharia biológica, permitindo a prototipagem rápida de circuitos genéticos. Além disso, outras tecnologias de prototipagem rápida requerem itera...

O campo da biologia sintética de mamíferos progrediu rapidamente, desde o desenvolvimento de partes simples de sentido e resposta em linhagens celulares cultivadas até a otimização de redes complexas de genes para enfrentar desafios do mundo real em diagnóstico e terapêutica1. Esses circuitos sofisticados são capazes de detectar entradas biológicas de perfis de microRNA a citocinas e pequenas moléculas de fármacos, e implementar circuitos de processamento lógico, incluindo transistores, filtros passa-banda, chaves de alternância e osciladores. Também têm mostrado resultados promissores em modelos animais de doenças como câncer, artrite, diabetes e muitas outras 1,2,3,4,5. No entanto, à medida que a complexidade de um circuito cresce, otimizar os níveis de cada um de seus componentes torna-se cada vez mais desafiador.
Um tipo particularmente útil de circuito genético é um classificador celular, que pode ser programado para detectar e responder a estados celulares. A produção seletiva de proteínas ou RNA em estados celulares específicos é uma ferramenta poderosa para orientar e programar a diferenciação de células e organoides, identificar e destruir células doentes e/ou tipos celulares indesejáveis e regular a função de células terapêuticas 1,2,3,4,5 . No entanto, a criação de circuitos em células de mamíferos que possam classificar com precisão os estados celulares de várias espécies de RNA e/ou proteínas celulares tem sido altamente desafiadora.
Uma das etapas mais demoradas do desenvolvimento de um circuito de classificação celular é otimizar os níveis de expressão relativa de genes de componentes individuais, como sensores e fatores de processamento, dentro do circuito. Para acelerar a otimização de circuitos e permitir a construção de circuitos mais sofisticados, trabalhos recentes têm utilizado a modelagem matemática de circuitos classificadores de células e seus componentes para prever composições e topologias ótimas 6,7. Embora isso tenha mostrado resultados poderosos até agora, a análise matemática é limitada pela necessidade de caracterizar sistematicamente o comportamento de entrada-saída de genes componentes no circuito, o que é demorado. Além disso, uma miríade de problemas dependentes do contexto pode surgir em circuitos genéticos complexos, fazendo com que o comportamento de um circuito completo desafie as previsões baseadas em caracterizações de partes individuais 8,9.
Para desenvolver e testar mais rapidamente circuitos complexos de mamíferos, como classificadores de estado celular, nosso laboratório desenvolveu uma técnica chamada politransfecção10, uma evolução dos protocolos de cotransfecção de plasmídeos. Na co-transfecção, múltiplas espécies de DNA plasmidial são complexadas juntamente com um reagente lipídico ou polimérico carregado positivamente e, em seguida, entregues às células de forma correlacionada (Figura 1A). Na politransfecção, os plasmídeos são complexados separadamente com o reagente, de modo que o DNA de cada complexo de transfecção é entregue às células de forma descorrelacionada (Figura 1B). Usando este método, as células dentro da população transfectada são expostas a numerosas combinações de razões de duas ou mais cargas úteis de DNA carregando diferentes componentes do circuito.
Para medir as proporções dos componentes do circuito entregues a cada célula, cada complexo de transfecção dentro de uma politransfecção contém um repórter fluorescente constitutivamente expresso que serve como um proxy para a captação celular do complexo. O DNA de preenchimento que não contém nenhum elemento ativo dentro de uma célula de mamífero é usado para ajustar a quantidade relativa do repórter fluorescente e dos componentes do circuito entregues a uma célula em um único complexo de transfecção e é discutido com mais detalhes na discussão. Um exemplo de DNA de preenchimento usado no laboratório de Weiss é um plasmídeo contendo uma sequência de terminador, mas sem promotor, sequência codificadora, etc. Células com diferentes proporções de componentes do circuito podem então ser comparadas para encontrar razões ideais para a função do circuito gênico. Isso, por sua vez, produz previsões úteis para a escolha de promotores e outros elementos do circuito para alcançar níveis ideais de expressão gênica ao combinar componentes do circuito em um único vetor para integração genética (por exemplo, um lentivírus, transposon ou plataforma de pouso). Assim, em vez de escolher razões entre componentes do circuito com base na intuição ou através de um processo demorado de tentativa e erro, a politransfecção avalia uma ampla gama de estequiometrias entre partes genéticas em uma reação de pote único.
Em nosso laboratório, a politransfecção permitiu a otimização de muitos circuitos genéticos, incluindo classificadores celulares, controladores de feedback e feedforward e motivos biestáveis. Este método simples, mas poderoso, acelera significativamente os ciclos de projeto de circuitos genéticos complexos em células de mamíferos. Desde então, a politransfecção tem sido usada para caracterizar vários circuitos genéticos para revelar suas funções multidimensionais de transferência de entrada-saída em alta resolução10, otimizar uma topologia de circuito alternativo para classificação de estado celular 11 e acelerar vários projetos publicados12,13 e em andamento.
Aqui descrevemos e descrevemos o fluxo de trabalho para o uso da politransfecção para otimizar rapidamente um circuito genético (Figura 2). O protocolo mostra como gerar dados de politransfecção de alta qualidade e evitar vários erros comuns no protocolo de politransfecção e na análise dos dados (Figura 3). Em seguida, demonstra como usar a politransfecção para caracterizar componentes de circuitos simples e, no processo, comparar os resultados da politransfecção com a cotransfecção (Figura 4). Finalmente, os resultados da politransfecção mostram otimização do circuito classificador de câncer (Figura 5).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15mL Corning Falcon conical tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well petri dish</td>
			<td>Any company of choice</td>
			<td></td>
			<td>(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any company of choice</td>
			<td></td>
			<td>Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMQAX2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoflow</td>
			<td>Non-commercial software package</td>
			<td></td>
			<td>https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Use the correct media for your cell type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12401</td>
			<td>Use the relevant cell type for your experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td>Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Any company of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow calibration beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URCP-100-2H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection

Circuitos genéticos de mamíferos têm demonstrado o potencial para detectar e tratar uma ampla gama de estados de doenças, mas a otimização dos níveis de componentes do circuito permanece desafiadora e trabalhosa. Para acelerar esse processo, nosso laboratório desenvolveu a politransfecção, uma extensão de alto rendimento da transfecção tradicional de mamíferos. Na politransfecção, cada célula da população transfectada realiza essencialmente um experimento diferente, testando o comportamento do circuito em diferentes números de cópias de DNA e permitindo que os usuários analisem um grande número de estequiometrias em uma reação de pote único. Até o momento, foram demonstradas politransfecções que otimizam as proporções de circuitos de três componentes em um único poço de células; Em princípio, o mesmo método pode ser usado para o desenvolvimento de circuitos ainda maiores. Os resultados da politransfecção podem ser facilmente aplicados para encontrar proporções ótimas de DNA para co-transfect para circuitos transientes ou para escolher níveis de expressão para componentes de circuitos para a geração de linhagens celulares estáveis.
Aqui, demonstramos o uso da politransfecção para otimizar um circuito de três componentes. O protocolo começa com princípios de planejamento experimental e explica como a politransfecção se baseia em métodos tradicionais de cotransfecção. Em seguida, a politransfecção das células é realizada e seguida por citometria de fluxo alguns dias depois. Finalmente, os dados são analisados examinando fatias dos dados de citometria de fluxo de célula única que correspondem a subconjuntos de células com determinadas razões de componentes. No laboratório, a politransfecção tem sido usada para otimizar classificadores de células, controladores de feedback e feedforward, motivos biestáveis e muito mais. Este método simples, mas poderoso, acelera os ciclos de projeto de circuitos genéticos complexos em células de mamíferos.

Na Figura 1, comparamos a co-transfecção com a politransfecção. Em uma co-transfecção, todos os plasmídeos são liberados na mesma mistura de transfecção, resultando em alta correlação entre a quantidade de cada plasmídeo que uma única célula recebe (Figura 1A). Enquanto o número de plasmídeos totais entregues a cada célula varia significativamente, a fluorescência das duas proteínas repórteres nas células individuais em toda a população e...

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Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection Video (Video) | JoVE

Circuitos genéticos complexos são demorados para projetar, testar e otimizar. Para facilitar esse processo, células de mamíferos são transfectadas de forma a permitir o teste de múltiplas estequiometrias de componentes do circuito em um único poço. Este protocolo descreve as etapas para o planejamento experimental, transfecção e análise dos dados.

Rápido Desenvolvimento de Circuitos de Identificação do Estado Celular com Poli-Transfecção

Mammalian genetic circuits have demonstrated the potential to sense and treat a wide range of disease states, but optimization of the levels of circuit ...

Nosso protocolo facilita e agiliza o entendimento das relações entre as partes biológicas. Podemos testar o comportamento de muitas combinações métricas de razão de peças em um único poço. Esta técnica permite aos pesquisadores caracterizar as complexas relações entre os componentes do circuito de forma mais abrangente com maior eficiência experimental do que as abordagens convencionais.Este método é aplicável para biologia sintética e para quaisquer questões biológicas, investigando mudanças comportamentais em uma célula em resposta a diferentes níveis de genes transfectados onde o débito pode ser medido via citometria de fluxo. Comece a preparar tubos para cada agregado de DNA reservando tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulados como sem controle de cor, controle mKO2, controle TagBFP, controle verde neon, controle de todas as cores, mistura de politransfecção um e mistura de politransfecção dois. Adicione 36 microlitros de meio de soro reduzido ao controle sem cor, controle mKO2, controle TagBFP, controle verde neon e todos os tubos de controle de cor, em seguida, adicione 18 microlitros de meio de soro reduzido a cada mistura de politransfecção um e mistura de politransfecção dois tubos.Em seguida, adicione 600 nanogramas de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle sem cor, 300 nanogramas de mKO2 e 300 nanogramas de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle de cor mKO2 e adicione 300 nanogramas de TagBFP e 300 nanogramas de plasmídeo de preenchimento ao tubo de controle de cor TagBFP. Ao tubo de controle de cor verde neon, adicione 300 nanogramas de verde neon constitutivo e 300 nanogramas de plasmídeo de carga, em seguida, adicione 100 nanogramas de cada mKO2, TagBFP, verde neon constitutivo e 300 nanogramas de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle de todas as cores. Para a mistura de politransfecção um tubo, adicione 150 nanogramas de mKO2, 75 nanogramas de plasmídeo verde neon repórter e 75 nanogramas de plasmídeo de preenchimento.Para a mistura de politransfecção dois tubos, adicione 150 nanogramas de TagBFP, 75 nanogramas de plasmídeo L7Ae e 75 nanogramas de plasmídeo de enchimento. Uma vez feito, crie a mistura mestre de transfecção em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro combinando 216 microlitros de meio de soro reduzido com 9,48 microlitros de reagente de transfecção. Misture bem pipetando para cima e para baixo antes de colocá-lo de lado.Adicione 1,58 microlitros de reagente intensificador sem controle de cor, controle de cor única e todos os tubos de controle de cor e adicione 79 microlitros de reagente intensificador a cada tubo de mistura de politransfecção. Misture cada tubo individualmente pipetando vigorosamente. Adicione 37,58 microlitros de mistura mestre de transfecção ao controle sem cor, controle de cor única e todos os tubos de controle de cor e misture pipetando vigorosamente.Em seguida, adicione 18,79 microlitros de mistura mestre de transfecção a cada tubo de mistura de politransfecção e misture bem cada tubo com pipetagem vigorosa. Distribua as misturas de transfecção nos poços pipetando 65,97 microlitros de cada mistura de transfecção para os controles sem cor, cor única e todas as cores para os poços correspondentes, em seguida, transfira 32,98 microlitros da mistura de politransfecção um para o poço de politransfecção e distribua os complexos de forma eficaz, girando a placa rapidamente, mas suavemente em um apertado, Figurar padrão ao longo de uma superfície plana, em seguida, pipetar 32,98 microlitros da poli-transfecção misturar dois no mesmo poço de poli-transfecção e girar a placa da mesma maneira. Incubar as células por dois dias.Realizar citometria de fluxo para ler a fluorescência dos marcadores de transfecção e o repórter de saída para cada célula. Uma co-transfecção bem realizada, distinta da poli-transfecção mostrada no vídeo, mostra uma estreita correlação entre TagBFP e EYFP, expressando plasmídeos que foram co-entregues. Em contraste, uma co-transfecção mal realizada mostra uma fraca correlação entre os dois plasmídeos.A politransfecção bem realizada mostrou boa cobertura do espaço bidimensional e boa compensação de qualquer sangramento espectral entre proteínas fluorescentes. Os dados de politransfecção com um baixo número de células vivas foram difíceis de subdividir em compartimentos suficientes com um número suficiente de células em cada silo para análise. Uma politransfecção com baixa eficiência de transfecção resultou em cobertura esparsa do espaço bidimensional para análise.A razão efetiva do DNA na expressão de saída foi testada colocando-se uma proteína repressora, L7Ae com mKO2, e uma proteína de saída, verde neon com TagBFP, em misturas de transfecção separadas. A expressão do verde de néon foi então monitorada em diferentes níveis de mKO2 e TagBFP. Os resultados de co-transfecção e politransfecção foram comparados para este circuito.Os resultados de 11 co-transfecções individuais que combinaram as partes de DNA mostradas anteriormente foram agrupados em um único conjunto de dados e comparados com os dados de politransfecção. A comparação das curvas dose-resposta de L7Ae reprimindo o repórter de saída mostrou que o nível mediano de saída por silo foi muito semelhante entre os dados de co-transfecção e politransfecção. Uma aplicação bem sucedida de poli-transfecção foi demonstrada para otimizar um classificador de tipo celular.O micro RNA-21 presente nas células HeLa e não-HEK atua para derrubar a expressão de BM3R1 porque BM3R1 reprime a produção do circuito de saída mKO2. Quando o micro RNA 21 está presente em uma célula, a expressão de mKO2 será ativada. A quantidade de Gal4-VP16 sintoniza a expressão de mKO2 em baixos níveis de BM3R1.Cada componente do circuito foi co-entregue com um marcador fluorescente diferente. Essa politransfecção quantifica quanto de cada componente do circuito cada célula recebeu. O mKO2 é produzido em MIR21, produzindo células HeLa, mas não em células HEK.A saída de mKO2 foi analisada após a entrega desses componentes de circuito em misturas de transfecção separadas com repórteres fluorescentes distintos para indicar a quantidade de cada componente do circuito recebido por uma determinada célula. Essa subamostragem previu que, nessa proporção, o circuito co-transfectado apresentou especificidade de 91%, sensibilidade de 62% e acurácia de 77%, ao classificar células HEK293 versus células HeLa. O ponto de dor mais comum neste protocolo é a falta de uma correlação estreita dentro de cada mistura de transfecção.Portanto, lembre-se de misturar vigorosamente os tubos de transfecção logo após a adição do reagente intensificador e, em seguida, ser suave com a mistura e pipetagem dos tubos de transfecção depois que a mistura de transfecção contendo lipídios for adicionada Os componentes genéticos neste procedimento podem ser substituídos por quaisquer outros componentes genéticos para responder a perguntas sobre seu desempenho funcional em vários ambientes. Este método desenvolveu rapidamente circuitos genéticos, tais como classificadores de células, controladores de feedback e feedforward, motivos bi-estáveis e muito mais.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores Video (Video) | JoVE

Monitoramento adsorção de proteínas com Solid-state Nanoporos

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

Bioengenharia

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells Video (Video) | JoVE

Biossensores raciométrica que medem estado redox mitocondrial e ATP em células vivas de levedura

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor Video (Video) | JoVE

Sensoriamento de Barreira rompimento do tecido com um transistor Eletroquímica Orgânica

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling Video (Video) | JoVE

In Vitro Modelo de fisiológicos e patológicos fluxo de sangue com aplicativos para Investigações de Reformas celular Vascular

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry Video (Video) | JoVE

Caracterização qualitativa da fração aquosa de Hydrothermal Liquefação de algas por cromatografia gasosa 2D com Time-of-flight Espectrometria de Massa

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe Video (Video) | JoVE

Padronização Subtractive rápida de camadas de células vivas com uma Probe microfluídicos

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering Video (Video) | JoVE

A rápida e sem produtos químicos dosagem de hemoglobina com Photothermal angular de espalhamento de luz

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures Video (Video) | JoVE

Síntese de biocompatíveis cristal líquido de elastómero Espumas como andaimes celulares para cultura de células 3D espaciais

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library Video (Video) | JoVE

Triagem e identificação de pequenos peptídeos visando o fator de crescimento de fibroblastos Receptor2 usando uma biblioteca de peptídeos de Phage display

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning Video (Video) | JoVE

Montagem rápida de construções multigênicas usando clonagem modular de golden gate

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...