Name: rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection
Uploaded: 2023-02-24T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection Video at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a los antiguos miembros de Weiss Lab que lideraron o contribuyeron al desarrollo del método de politransfección y su aplicación a los clasificadores celulares: Jeremy Gam, Bre DiAndreth y Jin Huh; otros miembros del laboratorio Weiss que han contribuido a un mayor desarrollo / optimización de métodos: Wenlong Xu, Lei Wang y Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard y miembros del grupo, incluidos Patrick Donahue y Hailey Edelstein, por probar la politransfección y proporcionar retroalimentación; y la profesora Nika Shakiba por invitar a este manuscrito y proporcionar comentarios. También nos gustaría agradecer a los Institutos Nacionales de Salud [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; Fundación Nacional de Ciencias [1745645]; Subvención de apoyo al Centro Oncológico (principal) [P30CCA14051, en parte] del NCI y de los Institutos Nacionales de la Salud [P50GM098792] para financiar este trabajo.

NOTA: La Tabla 1 y la Tabla 2 sirven como referencias significativas para este protocolo. La Tabla 1 muestra la escala de reactivos para las reacciones, y la Tabla 2 muestra la aritmética de la relación de ADN para un ejemplo de politransfección descrita en el protocolo (mitad superior) y para un posible experimento de seguimiento (mitad inferior).
1. Preparación de células para la transfección
<ol><li...

<ol>
	<li>Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+gene+circuits+and+cellular+decision-making+in+human+pluripotent+stem+cells.">Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells.</a> Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).</li><li>Sayeg, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+designed+microRNA-based+genetic+classifiers+target+specific+neurons+in+the+brain.">Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).</li><li>Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Input+RNAi-based+logic+circuit+for+identification+of+specific+cancer+cells.">Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells.</a> Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).</li><li>Nissim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+RNA-based+immunomodulatory+gene+circuits+for+cancer+immunotherapy.">Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy.</a> Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).</li><li>Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable+dual-promoter+integrator+for+targeting+of+cancer+cells.">A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells.</a> Molecular Systems Biology. 6, 444 (2010).</li><li>Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+regulatory+effect+size+of+cis-acting+genetic+variation+using+allelic+fold+change.">Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change.</a> Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).</li><li>Prochazka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete-to-analog+signal+pluripotent+stem+cells+conversion+in+human.">Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modularity,+context-dependence,+and+insulation+in+engineered+biological+circuits.">Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits.</a> Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).</li><li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design:+Engineering+the+mammalian+cell.">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li><li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+'poly-transfection'+method+for+rapid,+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems.">A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).</li><li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+tunable+signal+processing+in+mammalian+cells+via+engineered+covalent+modification+cycles.">Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles.</a> Nature Communications. 13 (1), 1720 (2022).</li><li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endoribonuclease-based+feedforward+controller+for+decoupling+resource-limited+genetic+modules+in+mammalian+cells.">An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).</li><li>DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERSIST+platform+provides+programmable+RNA+regulation+using+CRISPR+endoRNases.">PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases.</a> Nature Communications. 13 (1), 2582 (2022).</li><li>Frei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+mitigation+of+gene+expression+burden+in+mammalian+cells.">Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 4641 (2020).</li><li>Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+fast,+high-precision+characterization+of+synthetic+biology+devices.+Computer+Science+and+Artificial+Intelligence+Laboratory+Technical+Report.">A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report.</a> Massachusetts institute of technology. , (2012).</li><li>Beal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+measurement+precision+requirements+for+effective+engineering+of+genetic+regulatory+networks.">Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).</li><li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoflow:+A+Python+toolbox+for+flow+cytometry.">Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+gene+expression+with+synthetic+upstream+open+reading+frames).">Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).</li><li>Michaels, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+tuning+of+gene+expression+levels+in+mammalian+cells.">Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 818 (2019).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch.">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li><li>Wroblewska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+synthetic+circuits+with+RNA+binding+proteins+for+RNA-only+delivery.">Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).</li><li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells.">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).</li><li>Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21+as+a+key+regulator+of+oncogenic+processes.">miR-21 as a key regulator of oncogenic processes.</a> Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).</li><li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+mining+of+prokaryotic+repressors+for+orthogonal+logic+gates.">Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).</li><li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+transfer+of+prokaryotic+sensors+and+circuits+to+mammalian+cells.">Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).</li></ol>

Los métodos de creación rápida de prototipos, como el diseño asistido por computadora (CAD), el breadboard y la impresión 3D, han revolucionado las disciplinas mecánicas, eléctricas y de ingeniería civil. La capacidad de buscar rápidamente a través de muchas soluciones posibles a un desafío dado acelera enormemente el progreso en un campo. Creemos que la politransfección es una tecnología análoga para la ingeniería biológica, que permite la creación rápida de prototipos de circuitos genéticos. Además,...

El campo de la biología sintética de mamíferos ha progresado rápidamente, desde el desarrollo de partes simples de detección y respuesta en líneas celulares cultivadas hasta la optimización de redes complejas de genes para abordar los desafíos del mundo real en diagnóstico y terapéutica1. Estos sofisticados circuitos son capaces de detectar entradas biológicas desde perfiles de microARN hasta citoquinas y fármacos de moléculas pequeñas, e implementar circuitos de procesamiento lógico que incluyen transistores, filtros de paso de banda, interruptores de palanca y osciladores. También han mostrado resultados prometedores en modelos animales de enfermedades como el cáncer, la artritis, la diabetes y muchos más 1,2,3,4,5. Sin embargo, a medida que crece la complejidad de un circuito, optimizar los niveles de cada uno de sus componentes se vuelve cada vez más desafiante.
Un tipo particularmente útil de circuito genético es un clasificador celular, que puede programarse para detectar y responder a los estados celulares. La producción selectiva de proteínas o salidas de ARN en estados celulares específicos es una herramienta poderosa para guiar y programar la diferenciación de células y organoides, identificar y destruir células enfermas y/o tipos de células indeseables, y regular la función de las células terapéuticas 1,2,3,4,5 . Sin embargo, la creación de circuitos en células de mamíferos que puedan clasificar con precisión los estados celulares de múltiples especies celulares de ARN y / o proteínas ha sido muy desafiante.
Uno de los pasos más lentos del desarrollo de un circuito de clasificación celular es optimizar los niveles de expresión relativos de los genes componentes individuales, como sensores y factores de procesamiento, dentro del circuito. Para acelerar la optimización de circuitos y permitir la construcción de circuitos más sofisticados, trabajos recientes han utilizado modelos matemáticos de circuitos clasificadores celulares y sus componentes para predecir composiciones y topologías óptimas 6,7. Si bien esto ha mostrado resultados poderosos hasta ahora, el análisis matemático está limitado por la necesidad de caracterizar sistemáticamente el comportamiento de entrada-salida de los genes componentes en el circuito, lo que lleva mucho tiempo. Además, una miríada de problemas dependientes del contexto pueden surgir en circuitos genéticos complejos, haciendo que el comportamiento de un circuito completo desafíe las predicciones basadas en caracterizaciones de partes individuales 8,9.
Para desarrollar y probar más rápidamente circuitos complejos de mamíferos, como los clasificadores de estado celular, nuestro laboratorio desarrolló una técnica llamada politransfección10, una evolución de los protocolos de cotransfección de plásmidos. En la cotransfección, múltiples especies de ADN plásmido se complejan junto con un reactivo lipídico o polimérico cargado positivamente, y luego se entregan a las células de manera correlacionada (Figura 1A). En la politransfección, los plásmidos se complejan por separado con el reactivo, de modo que el ADN de cada complejo de transfección se entrega a las células de manera descorrelacionada (Figura 1B). Usando este método, las células dentro de la población transfectada están expuestas a numerosas combinaciones de proporciones de dos o más cargas útiles de ADN que transportan diferentes componentes del circuito.
Para medir las proporciones de los componentes del circuito entregados a cada célula, cada complejo de transfección dentro de una politransfección contiene un reportero fluorescente expresado constitutivamente que sirve como un proxy para la absorción celular del complejo. El ADN de relleno que no contiene ningún elemento activo dentro de una célula de mamífero se utiliza para ajustar la cantidad relativa del reportero fluorescente y los componentes del circuito entregados a una célula en un solo complejo de transfección y se discute con más detalle en la discusión. Un ejemplo de ADN de relleno utilizado en el laboratorio de Weiss es un plásmido que contiene una secuencia terminadora, pero no promotor, secuencia codificante, etc. Las células con diferentes proporciones de componentes del circuito se pueden comparar para encontrar proporciones óptimas para la función del circuito génico. Esto a su vez produce predicciones útiles para elegir promotores y otros elementos del circuito para lograr niveles óptimos de expresión génica cuando se combinan componentes del circuito en un solo vector para la integración genética (por ejemplo, un lentivirus, transposón o plataforma de aterrizaje). Por lo tanto, en lugar de elegir relaciones entre los componentes del circuito basadas en la intuición o mediante un proceso de prueba y error que consume mucho tiempo, la politransfección evalúa una amplia gama de estequiometrías entre partes genéticas en una reacción de un solo bote.
En nuestro laboratorio, la politransfección ha permitido la optimización de muchos circuitos genéticos, incluidos clasificadores celulares, controladores de retroalimentación y feedforward, y motivos biestables. Este método simple pero poderoso acelera significativamente los ciclos de diseño para circuitos genéticos complejos en células de mamíferos. Desde entonces, la politransfección se ha utilizado para caracterizar varios circuitos genéticos para revelar sus funciones multidimensionales de transferencia de entrada-salida a alta resolución 10, optimizar una topología de circuito alternativo para la clasificación del estado celular11 y acelerar varios proyectos publicados 12,13 y en curso.
Aquí describimos y describimos el flujo de trabajo para usar la politransfección para optimizar rápidamente un circuito genético (Figura 2). El protocolo muestra cómo generar datos de politransfección de alta calidad y evitar varios errores comunes en el protocolo de politransfección y el análisis de datos (Figura 3). Luego demuestra cómo usar la politransfección para caracterizar componentes de circuitos simples y, en el proceso, comparar los resultados de la politransfección con la cotransfección (Figura 4). Finalmente, los resultados de la politransfección muestran una optimización del circuito clasificador de cáncer (Figura 5).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15mL Corning Falcon conical tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well petri dish</td>
			<td>Any company of choice</td>
			<td></td>
			<td>(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any company of choice</td>
			<td></td>
			<td>Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMQAX2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoflow</td>
			<td>Non-commercial software package</td>
			<td></td>
			<td>https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Use the correct media for your cell type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12401</td>
			<td>Use the relevant cell type for your experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000001</td>
			<td>Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Any company of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow calibration beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URCP-100-2H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection

Los circuitos genéticos de mamíferos han demostrado el potencial para detectar y tratar una amplia gama de estados de enfermedad, pero la optimización de los niveles de los componentes del circuito sigue siendo un desafío y requiere mucha mano de obra. Para acelerar este proceso, nuestro laboratorio desarrolló la politransfección, una extensión de alto rendimiento de la transfección tradicional de mamíferos. En la politransfección, cada célula de la población transfectada esencialmente realiza un experimento diferente, probando el comportamiento del circuito en diferentes números de copias de ADN y permitiendo a los usuarios analizar un gran número de estequiometrías en una reacción de un solo recipiente. Hasta ahora, se han demostrado politransfecciones que optimizan las proporciones de circuitos de tres componentes en un solo pocillo de células; En principio, el mismo método se puede utilizar para el desarrollo de circuitos aún más grandes. Los resultados de la politransfección se pueden aplicar fácilmente para encontrar proporciones óptimas de ADN a cotransfecto para circuitos transitorios o para elegir niveles de expresión para componentes de circuitos para la generación de líneas celulares estables.
Aquí, demostramos el uso de la politransfección para optimizar un circuito de tres componentes. El protocolo comienza con los principios de diseño experimental y explica cómo la politransfección se basa en los métodos tradicionales de cotransfección. A continuación, se lleva a cabo la politransfección de células y seguida de citometría de flujo unos días después. Finalmente, los datos se analizan examinando cortes de los datos de citometría de flujo de una sola célula que corresponden a subconjuntos de células con ciertas proporciones de componentes. En el laboratorio, la politransfección se ha utilizado para optimizar clasificadores celulares, controladores de retroalimentación y feedforward, motivos biestables y muchos más. Este método simple pero poderoso acelera los ciclos de diseño para circuitos genéticos complejos en células de mamíferos.

En la Figura 1, comparamos la co-transfección con la poli-transfección. En una co-transfección, todos los plásmidos se entregan en la misma mezcla de transfección, lo que resulta en una alta correlación entre la cantidad de cada plásmido que recibe cualquier célula individual (Figura 1A). Si bien el número total de plásmidos entregados a cada célula varía significativamente, la fluorescencia de las dos proteínas reporteras en las células individual...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection Video at JoVE.com

Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection Video (Video) | JoVE

Los circuitos genéticos complejos requieren mucho tiempo para diseñar, probar y optimizar. Para facilitar este proceso, las células de mamíferos se transfectan de una manera que permite la prueba de múltiples estequiometrías de los componentes del circuito en un solo pozo. Este protocolo describe los pasos para la planificación experimental, la transfección y el análisis de datos.

Desarrollo rápido de circuitos de identificación del estado celular con politransfección

Mammalian genetic circuits have demonstrated the potential to sense and treat a wide range of disease states, but optimization of the levels of circuit ...

Nuestro protocolo hace que sea más fácil y rápido entender las relaciones entre las partes biológicas. Podemos probar el comportamiento de muchas combinaciones métricas de proporción de partes en un solo pozo. Esta técnica permite a los investigadores caracterizar las complejas relaciones entre los componentes del circuito de manera más exhaustiva con una mayor eficiencia experimental que los enfoques convencionales.Este método es aplicable para la biología sintética y para cualquier pregunta biológica, sondeando cambios de comportamiento en una célula en respuesta a diferentes niveles de genes transfectados donde la salida se puede medir a través de citometría de flujo. Comience a preparar tubos para cada agregado de ADN reservando tubos de microcentrífuga de 1.5 mililitros etiquetados como sin control de color, control mKO2, control TagBFP, control verde neón, control de todo color, mezcla de politransfección uno y mezcla de politransfección dos. Agregue 36 microlitros de medio sérico reducido al control sin color, control mKO2, control TagBFP, control verde neón y todos los tubos de control de color, luego agregue 18 microlitros de medio sérico reducido a cada mezcla de politransfección uno y mezcla de politransfección dos tubos.A continuación, agregue 600 nanogramos de plásmido de relleno al tubo de control sin color, 300 nanogramos de mKO2 y 300 nanogramos de plásmido de relleno al tubo de control de color mKO2 y agregue 300 nanogramos de TagBFP y 300 nanogramos de plásmido de relleno al tubo de control de color TagBFP. Al tubo de control de color verde neón, agregue 300 nanogramos de verde neón constitutivo y 300 nanogramos de plásmido de relleno, luego agregue 100 nanogramos de cada mKO2, TagBFP, verde neón constitutivo y 300 nanogramos de plásmido de relleno al tubo de control de todo color. A la mezcla de poli-transfección un tubo, agregue 150 nanogramos de mKO2, 75 nanogramos de plásmido verde neón reportero y 75 nanogramos de plásmido de relleno.A la mezcla de poli-transfección de dos tubos, agregue 150 nanogramos de TagBFP, 75 nanogramos de plásmido L7Ae y 75 nanogramos de plásmido de relleno. Una vez hecho esto, cree la mezcla maestra de transfección en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros combinando 216 microlitros de medio sérico reducido con 9,48 microlitros de reactivo de transfección. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo antes de reservar.Agregue 1.58 microlitros de reactivo potenciador sin control de color, control de color único y todos los tubos de control de color y agregue 79 microlitros de reactivo potenciador a cada tubo de mezcla de politransfección. Mezclar cada tubo individualmente pipeteando vigorosamente. Agregue 37.58 microlitros de mezcla maestra de transfección a los tubos sin control de color, control de color único y todos los tubos de control de color y mezcle pipeteando vigorosamente.A continuación, agregue 18.79 microlitros de mezcla maestra de transfección a cada tubo de mezcla de politransfección y mezcle bien cada tubo con un pipeteo vigoroso. Dispense las mezclas de transfección en los pocillos pipeteando 65.97 microlitros de cada mezcla de transfección para los controles sin color, de un solo color y de todo el color en los pocillos correspondientes, luego transfiera 32.98 microlitros de la mezcla de politransfección uno al pozo de politransfección y distribuya los complejos de manera efectiva girando la placa rápida pero suavemente en un apretado, Calcule el patrón a lo largo de una superficie plana, luego pipete 32.98 microlitros de la poli-transfección mezcle dos en el mismo pocillo de poli-transfección y gire la placa de la misma manera. Incubar las células durante dos días.Realice citometría de flujo para leer la fluorescencia de los marcadores de transfección y el reportero de salida para cada célula. Una co-transfección bien realizada, distinta de la poli-transfección que se muestra en el video, muestra una estrecha correlación entre TagBFP y EYFP, expresando plásmidos que fueron co-entregados. En contraste, una co-transfección mal realizada muestra una correlación pobre entre los dos plásmidos.La politransfección bien realizada mostró una buena cobertura del espacio bidimensional y una buena compensación de cualquier sangrado espectral entre las proteínas fluorescentes. Los datos de politransfección con un bajo número de células vivas fueron difíciles de subdividir en suficientes contenedores con un número suficiente de células en cada contenedor para el análisis. Una politransfección con poca eficiencia de transfección dio como resultado una cobertura dispersa del espacio bidimensional para el análisis.La relación efectiva de ADN en la expresión de salida se probó colocando una proteína represora, L7Ae con mKO2, y una proteína de salida, verde neón con TagBFP, en mezclas de transfección separadas. La expresión verde neón fue monitoreada en diferentes niveles de mKO2 y TagBFP. Los resultados de co-transfección y poli-transfección se compararon para este circuito.Los resultados de 11 cotransfecciones individuales que combinaron las partes de ADN mostradas anteriormente se recopilaron en un solo conjunto de datos y se compararon con los datos de politransfección. La comparación de las curvas de dosis-respuesta de L7Ae que reprimían el reportero de salida mostró que el nivel medio de salida por contenedor era muy similar entre los datos de co-transfección y poli-transfección. Se demostró una aplicación exitosa de politransfección para optimizar un clasificador de tipo celular.El micro ARN-21 presente en las células HeLa y las células no-HEK actúa para derribar la expresión de BM3R1 porque BM3R1 reprime la producción de la salida del circuito mKO2. Cuando el micro ARN 21 está presente en una célula, se activará la expresión de mKO2. La cantidad de Gal4-VP16 sintoniza la expresión de mKO2 a niveles bajos de BM3R1.Cada componente del circuito fue entregado conjuntamente con un marcador fluorescente diferente. Esta politransfección cuantifica la cantidad de cada componente del circuito que recibió cada célula. mKO2 se produce en MIR21, produciendo células HeLa pero no en células HEK.La salida de mKO2 se analizó después de entregar estos componentes del circuito en mezclas de transfección separadas con distintos reporteros fluorescentes para indicar la cantidad de cada componente del circuito recibido por una celda en particular. Este submuestreo predijo que en esta relación, el circuito cotransfectado tenía una especificidad del 91%, una sensibilidad del 62% y una precisión del 77%, al clasificar HEK293 versus células HeLa. El punto de dolor más común en este protocolo es la falta de una correlación estrecha dentro de cada mezcla de transfección.Así que recuerde mezclar vigorosamente los tubos de transfección justo después de agregar el reactivo potenciador y luego sea suave con la mezcla y pipeteo de los tubos de transfección después de agregar la mezcla de transfección que contiene lípidos Los componentes genéticos en este procedimiento podrían reemplazarse con cualquier otro componente genético para responder preguntas sobre su rendimiento funcional en diversos entornos. Este método ha desarrollado rápidamente circuitos genéticos, como clasificadores celulares, controladores de retroalimentación y feedforward, motivos biestables y muchos más.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores (Video) | JoVE 

Monitoreo adsorción de proteínas de estado sólido Nanoporos

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

Investigación

Bioingeniería

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells (Video) | JoVE 

Biosensores radiométricos que miden el estado redox mitocondrial y ATP en las células vivas de levadura

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor (Video) | JoVE 

Detección de barrera interrupción del tejido con un transistor orgánico Electroquímica

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling Video (Video) | JoVE

En Vitro Modelo de fisiológicos y patológicos de flujo de sangre con aplicación a las investigaciones de remodelado vascular celular

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry Video (Video) | JoVE

Caracterización cualitativa de la fracción acuosa de hidrotérmico Licuefacción de algas mediante 2D cromatografía de gases con espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe Video (Video) | JoVE

Patrones sustractiva rápida de las capas de células vivas con una sonda de microfluidos

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering Video (Video) | JoVE

Un ensayo de hemoglobina rápida y libre de químicos con fototérmica angular de dispersión de luz

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures Video (Video) | JoVE

Síntesis de biocompatibles de cristal líquido de elastómero Espumas como andamios celulares para 3D espaciales Cultivos Celulares

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library Video (Video) | JoVE

Detección e identificación de pequeños péptidos dirigidos al receptor de factor de crecimiento de fibroblastos2 utilizando una biblioteca de péptidos de pantalla de fago

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning Video (Video) | JoVE

Montaje rápido de construcciones multigénicas mediante clonación modular Golden Gate

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...