Name: visualizing early infection sites of rice blast disease (magnaporthe oryzae) on barley (hordeum vulgare) using a basic microscope and a smartphone
Uploaded: 2023-03-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease Magnaporthe oryzae on Barley Hordeum vulgare Using a Basic Microscope and a Smartphone at JoVE.com

De auteurs erkennen financiering van de USDA-NIFA award 2016-67013-24816.

1. Bereiding van experimenteel materiaal
<ol><li>Bereid havermoutagar (OMA) door havermout te mengen tot het een fijn poeder is. Voeg 25 g havermoutpoeder en 15 g agar toe aan 500 ml ddH2O en autoclaaf op mediacyclus (als alternatief breng het 20 minuten aan de kook). Giet de media in steriele petrischaaltjes van 60 mm. OPMERKING: Andere mediatypen die sporulatie induceren, zoals V8-agar, zijn acceptabel voor dit protocol.</li>
	<li>Plaat M. oryzae filtert voorraden rechtstreeks ...

<ol>
	<li>Roy, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+barley+blast+caused+by+Magnaporthe+oryzae+pathotype+Triticum+(MoT)+in+Bangladesh.">First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh.</a> Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).</li><li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology.">The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li><li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea.">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li><li>Wilson, R. A., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+pressure:+investigating+the+biology+of+plant+infection+by+Magnaporthe+oryzae.">Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).</li><li>Giraldo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+secretion+systems+facilitate+tissue+invasion+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Nature Communications. 4, 1996 (2013).</li><li>Islam, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+wheat+blast+in+Bangladesh+was+caused+by+a+SouthAmerican+lineage+of+Magnaporthe+oryzae.">Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae.</a> BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).</li><li>Langridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+and+Academic+Importance+of+Barley.">Economic and Academic Importance of Barley.</a> The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , 1-10 (2018).</li><li>Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+two+strains+of+Magnaporthe+grisea+with+rice,+goosegrass,+and+weeping+lovegrass.">Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass.</a> Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).</li><li>Gowda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+rice-blast+fungus+Magnaporthe+oryzae+field+isolates+from+southern+India.">Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India.</a> Genomics Data. 5, 284-291 (2015).</li><li>Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+reporters+for+functional+analysis+in+rice+leaves.">Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves.</a> Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).</li><li>Fernandez, J., Wilson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+no+feeding+frenzy?+Mechanisms+of+nutrient+acquisition+and+utilization+during+infection+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).</li><li>Cooper, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Genetic+Control+of+Reactive+Oxygen+Species+in+Magnaporthe+oryzae+(the+Rice+Blast+Fungus)+through+Development,+Screening,+and+Characterization+of+a+Random+Insert+Mutant+Library.">Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library.</a> University of Delaware. , (2022).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=al.The+plant+infection+test:+Spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea.">al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).</li><li>Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inoculation+method+of+Magnaporthe+grisea+for+cytological+observation+of+the+infection+process+using+intact+leaf+sheaths+of+rice+plants.">A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).</li><li>Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+surface+attachment+in+spores+of+a+plant+pathogenic+fungus.">A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus.</a> Science. 239 (4837), 288-290 (1988).</li><li>Khang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+of+Magnaporthe+oryzae+effectors+into+rice+cells+and+their+subsequent+cell-to-cell+movement.">et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement.</a> The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).</li></ol>

Er zijn veel veelgebruikte assays beschikbaar om M. oryzae-stammen te testen die een macroscopisch beeld geven van een compatibele of incompatibele infectierespons, zoals spray- of druppelinentingen, en het gebruik van beoordelingssystemen om laesiegroottes13,14 te kwantificeren. Een andere veel voorkomende test voor M. oryzae is het testen van het vermogen van de ziekteverwekker om zijn gespecialiseerde penetratiestructuur, het apppressorium<su...

Magnaporthe oryzae, de rijststraalschimmel, infecteert een assortiment graangewassen, waaronder gerst, tarwe en rijst1. Deze ziekteverwekker veroorzaakt verwoestende ziekten en vormt een wereldwijde bedreiging voor deze waardevolle gewassen, waardoor het gewas volledig verloren gaat als het niet wordt gecontroleerd. Veel laboratoria over de hele wereld richten zich op rijstblastziekte vanwege de wereldwijde dreiging en de kenmerken ervan als een uitstekend model voor plant-schimmelinteracties2. Het is volledig gesequenced en de genetica van de infectieuze cyclus, met name de vroege gebeurtenissen, zijn vastgesteld 3,4. De levenscyclus begint met een spore die ontkiemt op een bladoppervlak en de gespecialiseerde penetratiestructuur vormt die het appressorium wordt genoemd. Het appressorium dringt het bladweefsel binnen en de infectie gaat verder met de ontwikkeling van laesies die het proces van sporulatie starten en ziekte verspreiden4. Het voorkomen van een van deze vroege gebeurtenissen zou deze verwoestende ziekte drastisch remmen. Daarom is het meeste huidige onderzoek naar blastziekte gericht op de vroege infectiestappen, van de gekiemde conidia die een appressorium vormen tot de ontwikkeling van de invasieve schimmeldraden en het biotrofe interfaciale complex (BIC)5.
De enorme hoeveelheid onderzoek naar blastziekte is uitgevoerd in rijst, hoewel M. oryzae een belangrijke ziekteverwekker is voor een verscheidenheid aan gewassen, en nieuw geëvolueerde stammen opkomen als een wereldwijde bedreiging voor tarwe6. Terwijl rijst een van de top drie basisgewassen is die worden gebruikt om de bevolking te voeden, samen met tarwe en maïs, is gerst de vierde graankorrel in termen van veevoer en bierproductie7. Naarmate de ambachtelijke bierindustrie groeit, groeit ook de economische waarde van gerst. Er zijn duidelijke voordelen van het gebruik van M. oryzae en gerst als een pathosysteem om blastziekte te bestuderen. Ten eerste zijn er stammen van M. oryzae die alleen gerst infecteren, evenals stammen die meerdere grassoorten kunnen infecteren. 4091-5-8 infecteert bijvoorbeeld voornamelijk alleen gerst, terwijl Guy11 en 70-15 zowel gerst als rijst8 kunnen infecteren. Deze stammen zijn genetisch vergelijkbaar en het infectieproces is vergelijkbaar9. Ten tweede is gerst onder standaard laboratorium- en kasomstandigheden gemakkelijker te kweken, omdat het niet de gecompliceerde vereisten van rijst heeft (beknopte temperatuurregeling, hoge luchtvochtigheid, specifieke lichtspectra). Er zijn ook beeldvormingsuitdagingen met rijst vanwege de hydrofobiciteit van het bladoppervlak, die gerst niet vertoont10.
Dit protocol presenteert een eenvoudige methode voor het isoleren en effectief gebruiken van gerstbladscheden voor microscopische analyse van meerdere infectiestadia, met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumbenodigdheden en een smartphone voor gegevensverzameling. Deze methode voor de gerstbladschedetest is aanpasbaar voor laboratoria over de hele wereld, omdat het minimale voorraden vereist en toch een duidelijk beeld geeft van de microscopische interactie tussen de ziekteverwekker en de eerste paar cellen die het infecteert. Terwijl pathogeniciteitstests, zoals een spray of druppelinenting, een macrobeeld kunnen geven van het vermogen van de ziekteverwekker om laesies te vormen, stelt deze test de onderzoeker in staat om specifieke stappen van vroege infectie te visualiseren, van pre-penetratiegebeurtenissen tot kolonisatie van epidermale cellen. Verder kunnen onderzoekers infectie met de wild-type schimmel gemakkelijk vergelijken met infectie met een mutant verminderd in virulentie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell phone&#160;</td>
			<td>Google&#160;</td>
			<td>Pixel 4A</td>
			<td>Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell phone Microscope adapter</td>
			<td>Vankey</td>
			<td>B01788LT3S</td>
			<td>https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&#38;qid=1662568182&#38;sprefix= 
			vankey+%2Caps%2C63&#38;sr=8-2 
			-spons&#38;psc=1&#38;spLa=ZW5jcnlwd 
			GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR 
			jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 
			9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E 
			M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM 
			DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI 
			md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY 
			WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 
			QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>FM690TC</td>
			<td>40x&#8211;2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal old fashioned rolled oats</td>
			<td>Quaker</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&#38;linkCode=df0 
			&#38;hvadid=312253390021&#38;hvpos= 
			&#38;hvnetw=g&#38;hvrand=98212627704 
			6839544&#38;hvpone=&#38;hvptwo=&#38;hvq 
			mt=&#38;hvdev=c&#38;hvdvcmdl=&#38;hvlocint 
			=&#38;hvlocphy=9007494&#38;hvtargid 
			=pla-568492637928&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProMix BX</td>
			<td>ProMix</td>
			<td>1038500RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular coverglass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS2975245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides, microscope</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer&#160;</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A36CALM7</td>
			<td>0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing early infection sites of rice blast disease (magnaporthe oryzae) on barley (hordeum vulgare) using a basic microscope and a smartphone

Begrijpen hoe planten en ziekteverwekkers op elkaar inwerken, en of die interactie culmineert in afweer of ziekte, is nodig om sterkere en duurzamere strategieën voor de gezondheid van planten te ontwikkelen. Vooruitgang in methoden die plantenpathogene monsters effectiever in beeld brengen tijdens infectie en kolonisatie heeft hulpmiddelen opgeleverd zoals de rijstbladschedetest, die nuttig is geweest bij het monitoren van infecties en vroege kolonisatiegebeurtenissen tussen rijst en de schimmelpathogeen, Magnaporthe oryzae. Deze hemi-biotrofe ziekteverwekker veroorzaakt ernstig ziekteverlies in rijst en gerelateerde eenzaadlobbigen, waaronder gierst, rogge, gerst en meer recent tarwe. De bladschedetest levert, indien correct uitgevoerd, een optisch helder plantengedeelte op, meerdere lagen dik, waardoor onderzoekers live-cell beeldvorming kunnen uitvoeren tijdens een pathogeenaanval of vaste monsters kunnen genereren die zijn gekleurd voor specifieke kenmerken. Gedetailleerd cellulair onderzoek naar de gerst-M. oryzae interactie is achtergebleven bij die van de rijstgastheer, ondanks het groeiende belang van dit graan als voedselbron voor dieren en mensen en als gefermenteerde dranken. Hier wordt de ontwikkeling van een gerstebladschedetest gemeld voor ingewikkelde studies van M. oryzae-interacties tijdens de eerste 48 uur na inenting. De bladschedetest, ongeacht welke soort wordt bestudeerd, is delicaat; Er is een protocol dat alles omvat, van gerstgroeiomstandigheden en het verkrijgen van een bladschede, tot inenting, incubatie en beeldvorming van de ziekteverwekker op plantenbladeren. Dit protocol kan worden geoptimaliseerd voor high-throughput screening met behulp van zoiets eenvoudigs als een smartphone voor beeldvormingsdoeleinden.

Een weergave van de initiële workflow voor deze techniek wordt weergegeven in figuur 1. De omhulsels werden geoogst van 14 dagen oude vatbare "Lacey" gerstplanten (H. vulgare). De conidia werden geoogst van 10 dagen oude sporende M. oryzae OMA-platen, met een conidiale suspensie bereid met steriele ddH2O voor een eindconcentratie van 5 x 104 sporen per ml. De entsuspensie werd direct aangebracht op de bladmantels, die werden bevestigd aan steriele pet...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease Magnaporthe oryzae on Barley Hordeum vulgare Using a Basic Microscope and a Smartphone at JoVE.com

Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease Magnaporthe oryzae on Barley Hordeum vulgare Using a Basic Microscope and a Smartphone

Dit is een eenvoudig protocol van een gerstbladschedetest met minimale reagentia en gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur (inclusief een basissmartphone). Het doel is om het vroege infectieproces van blastziekte in laboratoria te visualiseren zonder toegang tot geavanceerde microscopieapparatuur.

Visualisatie van vroege infectieplaatsen van rijstontploffingsziekte (Magnaporthe oryzae) op gerst (Hordeum vulgare) met behulp van een basismicroscoop en een smartphone

Understanding how plants and pathogens interact, and whether that interaction culminates in defense or disease, is required to develop stronger and more ...

Ons protocol is een vereenvoudigde methode waarmee onderzoekers vroege infectiestappen van wilde en genetische schimmelmutanten kunnen visualiseren zonder het gebruik van dure apparatuur. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van basislaboratoriumbenodigdheden om complexe biologische vragen te beantwoorden en voor de snelle screening van schimmelmutanten voor verdere analyse. Een moeilijk onderdeel van deze techniek is de behandeling van de schede.De schede is een dunne laag cellen die gemakkelijk kan worden beschadigd, dus zorgvuldige behandeling is essentieel voor een succesvol experiment. Selecteer om te beginnen de gerst die tot het tweede bladstadium is gegroeid. En knip met een steriele schaar de gerstplant net boven de grondlijn.Snijd met behulp van een tang en een scalpel voorzichtig de schede van het eerste blad dat in de lengterichting open is. En verwijder het met behulp van de tang van de basis van het tweede blad. Snijd met behulp van een scalpel het grootste deel van het eerste blad weg van de schede, waardoor slechts 0,5 inch van het bladweefsel overblijft voor montage.Leg het eerste blad plat in een steriele petrischaal van 60 millimeter met daarin een nat keukenpapier om de luchtvochtigheid in de plaat te behouden. Plak het bladweefsel vast aan de bodem van de petrischaal. Selecteer een negen tot 12 dagen oude Magnaporthe oryzae-kweekplaat en voeg er 0,5 tot twee milliliter steriel water aan toe.Schraap met behulp van een steriele inentingslus voorzichtig de mycelia om de aangehechte conidia vrij te maken. Pipetteer de conidiale suspensie voorzichtig in een microcentrifugebuis met een klein stukje kaasdoek om grote stukken mycelium uit de conidiale suspensie te filteren. Verdun indien nodig de sporenconcentratie met steriel water tot vijf keer 10 tot de vierde sporen per milliliter, omdat een te hoge concentratie het in beeld brengen van individuele infectieplaatsen uitdagend maakt.Afhankelijk van de grootte van de schede, pipetteer voorzichtig 25 tot 50 microliter van de conidiale suspensie in de gerolde bladschede. Vul vervolgens vier of vijf bekers van 500 milliliter met dubbel gedestilleerd water en verwarm tot het stomt. Houd het deksel van de petrischaal boven een van de dampende bekers om vocht in de plaat op te vangen.Stapel de geïnfecteerde bladmantelplaten en omring ze met de resterende hete bekers, omdat het een vochtige, vochtige omgeving creëert voor de sporen om te ontkiemen. Bescherm deze opstelling tegen licht door deze te bedekken met een effen gekleurde rubberen of plastic doos en deze 48 uur of het gewenste tijdstip voor beeldvorming ongestoord te laten. Bereid de vlek door vers verdund 45% azijnzuur en 0,1% trypanblauw te mengen.Aliquot één milliliter van de kleurstofoplossing in microcentrifugebuizen. Snijd met behulp van een scalpel de bladschede voorzichtig weg van de tape. Plaats de schede met een tang in de microcentrifugebuis en zorg ervoor dat deze volledig is ondergedompeld in de kleurstofoplossing.Laat de buisjes twee uur staan in een warmteblok van 40 graden Celsius of waterbad zodat de kleurstof het blad kan binnendringen. Spoel vervolgens de bladmantels drie keer voorzichtig af in 60% verse glycerol om de extra kleurstof te verwijderen. Houd de schede in glycerol totdat u klaar bent om op dia's te monteren.Leg de schede op een schone glazen plaat en voeg een paar druppels 60% glycerol toe. Gebruik een ontleedmicroscoop en twee paar tangen om de schede voorzichtig uit te rollen, waarbij het geënte midden naar boven gericht blijft. Houd de schede open met de tang en plaats de afdekslip bovenop om te voorkomen dat de schede krult en de infectieplaats blokkeert.Sluit de afdeklaag af met nagellak voor langdurige opslag of tape voor kortdurende opslag. Observeer de dia's onder een samengestelde lichtmicroscoop. Maak basisfoto's met een smartphone door een mobiele telefoonadapter op de microscoop te monteren.Voor Android-apparaten past u de instellingen van de cameratoepassing aan om uit te flitsen, schakelt u de bovenste opname uit, schakelt u de automatische aanpassing van helderheid en schaduwen uit en stelt u de fotoresolutie in op volledig. Maak na het monteren van de mobiele telefoon een afbeelding van een schaalmicrometer met een gewenst doel voor het verkrijgen van de gegevens. Pas de zoom van de telefoon aan tot 2,5 x en houd deze consistent om een consistente pixelgrootte te behouden.Het midden van de schede herbergt de grootste concentratie sporen en infecterende appressoria. Streef daarom naar negen tot 12 afbeeldingen van elke schede om significante aantallen te verkrijgen voor statistische analyse. De infectieplaatsen van de schede werden in beeld gebracht met behulp van een smartphone- en smartphonemicroscoopadapter na kleuring met trypanblauw.De hitte en azijnzuur in de kleuringsprocedure verzacht het bladweefsel zachtjes. De nakleuringsspoelingen in 60% glycerol verwijderen niet alleen de overtollige vlek, maar helpen ook de lichtverstrooiing veroorzaakt door het blad te verminderen en de beeldkwaliteit te verbeteren. Afwijkingen van het kleuringsprotocol kunnen resulteren in suboptimale resultaten, zoals hier afgebeeld.Gerst geïnfecteerd met 4091 wild type produceerde met succes geïnfecteerde cellen geïdentificeerd door de aanwezigheid van geïnfecteerde schimmeldraden in het bladschedeweefsel. In het geval van de gemuteerde J99A-infectie werd een succesvolle ontwikkeling van appressoria en penetratiepennen opgemerkt, maar produceerde geen invasieve schimmeldraden. Timing is belangrijk voor op infectie gebaseerde assays.Goed verouderde planten en schimmelsporen zijn essentieel voor succes. In deze studie hebben we gekeken naar de aan- of afwezigheid van de infectiestructuren. Aanvullende experimenten zouden vragen kunnen beantwoorden over het fenotype van de infectiestructuur en dat van de binnendringende schimmeldraden.Onze methodologie is niet nieuw, maar een vereenvoudigde, toegankelijke versie van een complexer, duurder experiment.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease (Magnaporthe oryzae) on Barley (Hordeum vulgare) Using a Basic Microscope and a Smartphone

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Inzicht in de vroege organogenese Met behulp van een vereenvoudigd<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie Protocol in<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Alginaat inkapseling van pluripotente stamcellen Met behulp van een co-axiale Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Isolatie en karakterisatie van primaire Rat klep interstitiële cellen: een nieuw Model voor het bestuderen van verkalking van de aortaklep

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Visualiseren van de zich ontwikkelende hersenen in levende zebravissen met behulp van Brainbow en Time-lapse Confocalimaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Confocale Microscoop-gebaseerde Laser Ablatie en Regeneratie Test in Zebrafish Interneuromast Cellen

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Voorbereiding van kleine RNA-bibliotheken voor sequencing van vroege muisembryo's

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolatie van Murine Spermatogenic Cellen met behulp van een Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Een protocol voor immunohistochemie en RNA-in-situ distributie binnen vroege drosophila-embryo's

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...